Método de imobilização vertical para análise de microscopia time-lapse em cianobactérias filamentosas

Summary

Apresentamos um método simples e acessível para visualização de cianobactérias filamentosas no plano XY. Foi utilizada uma matriz de agarose de baixo ponto de fusão, permitindo a aquisição de imagens das proteínas envolvidas na divisão, na orientação vertical. Portanto, esta metodologia pode ser aplicada a qualquer organismo filamentoso e diferentes tipos de proteínas.

Abstract

Um evento principal na divisão celular bacteriana é o processo de septação, onde a proteína FtsZ é o elemento chave. O FtsZ polimeriza-se formando uma estrutura semelhante a um anel (anel Z) no meio da célula que serve de arcabouço para outras proteínas de divisão. A microscopia de super-resolução em modelos bacterianos de Escherichia coli e Bacillus subtilis mostrou que o anel Z é descontínuo, enquanto estudos de imagem de células vivas demonstraram que o FtsZ se move ao longo do anel por um mecanismo conhecido como esteira. Para estudar a dinâmica da FtsZ in vivo, uma colocação especial de células em posição vertical é necessária para obter imagens da estrutura completa do anel no plano XY. No caso da imagem por FtsZ em cianobactérias multicelulares, como Anabaena sp.PCC7120, manter os filamentos em posição vertical é um desafio devido ao tamanho das células e ao comprimento dos filamentos. Neste artigo, descrevemos um método que permite a imobilização vertical de filamentos de Anabaena sp., PCC 7120, usando agarose de baixo ponto de fusão e seringas, para registrar o anel Z em um mutante que expressa uma proteína de fusão FtsZ-sfGFP. Este método é uma maneira rápida e barata de registrar a dinâmica de proteínas no local de divisão usando microscopia confocal.

Introduction

A divisão celular bacteriana é o processo no qual uma célula-mãe gera duas células-filhas, na maioria dos casos pelo mecanismo conhecido como fissão binária. Um dos eventos mais precoces no processo de septação é a localização de FtsZ no meio da célula¹. Essa proteína, estruturalmente homóloga à tubulina², é conservada e amplamente distribuída na maioria das bactérias, e sua polimerização gera uma estrutura contrátil conhecida como anel Z³. Este anel serve como um andaime para outras proteínas de divisão e juntos eles formam uma maquinaria molecular chamada divisome. Vários estudos têm demonstrado que o anel Z é altamente dinâmico e que os protofilamentos FtsZ se movem por esteira ^4,5,6. Para estudar o anel Z em experimentos de lapso de tempo, é aconselhável registrar o local de divisão no plano XY para melhor resolução e amostragem rápida. Para isso, é necessário desenvolver métodos de imobilização celular vertical que comumente incluam a nanofabricação de armadilhas celulares de microfuros e dispositivos microfluídicos complexos⁷.

Cianobactérias são microrganismos fotossintéticos classificados como gram-negativos por sua morfologia celular. Entretanto, filogeneticamente estão mais próximas de bactérias^{gram-positivas8}. Esses organismos possuem genes de divisão celular que são comuns dentro de bactérias gram-positivas e gram-negativas, mas seu divisômio também contém elementos únicos⁹. PCC 7120 (doravante Anabaena sp.) é cianobactéria filamentosa com um plano de divisão e é um modelo para o estudo da divisão celular em cianobactérias multicelulares. Nessa linhagem, foi possível determinar o posicionamento da FtsZ no meio das células¹⁰. No entanto, não há estudos mostrando a dinâmica in vivo da FtsZ neste modelo. Em nosso laboratório, através de acasalamento triparental e recombinação homóloga, obtivemos um mutante totalmente segregado de Anabaena sp., que expressa a proteína FtsZ fusionada à sfGFP, que substituiu o gene ftsZ endógeno completo. Desenvolvemos um método rápido e simples de imobilização celular que favorece a orientação vertical dos filamentos de deformação mutantes para experimentos de time-lapse para visualizar a divisão de proteínas em cianobactérias filamentosas. Este método não necessita de dispositivos microfluídicos que podem ser caros e difíceis de desenvolver. Como exemplo, usamos este protocolo para visualizar o anel Z no mutante FtsZ-sfGFP por microscopia confocal.

Protocol

1. Considerações e seleção do modelo celular

NOTA: As cianobactérias têm uma forte autofluorescência devido à presença de pigmentos fotossintéticos. Este sinal está na parte vermelha do espectro, portanto, as proteínas fluorescentes adequadas para imageamento em cianobactérias são as que estão longe da emissão vermelha. Por exemplo, GFP, YFP, Vênus, Turquesa e BFP.

1. Selecione um componente divisômico presente na cepa de cianobactéria filamentosa alvo. Para os experimentos, é necessário construir um mutante cianobacteriano filamentoso que expresse o componente divisômico selecionado fundido a uma proteína fluorescente. Neste protocolo, um mutante de Anabaena sp., que expressa FstZ-sfGFP, como exemplo. Esta cepa foi obtida por acasalamento triparental com E. coli¹¹.
2. Verifique o nível de segregação do mutante que será utilizado. No exemplo, a segregação foi determinada por amplificação por PCR do gene alvo. O mutante FtsZ-sfGFP usado neste protocolo é uma cepa totalmente segregada que não possui o gene ftsZ selvagem.

2. Condições de crescimento

1. Fazer um novo subcultivo do mutante usando 10 mL de cultura em fase estacionária (cultivada por aproximadamente 14 dias em luz constante, a 25°C , para Anabaena sp.) e adicionando a 90 mL de meio BG11 suplementado com antibióticos (Spectinomicina e Streptomicina 10 μl ml-1 para o mutante FtsZ-sfGFP).
2. Cultivar a nova cultura celular em luz constante e na temperatura ideal até atingir a fase exponencial. O mutante FtsZ-sfGFP de Anabaena sp.

3. Preparação da amostra em matriz de agarose

1. Tomar 2 mL da cultura de crescimento homogeneizada.
2. Centrifugar a 2.500 x g por 10 min à temperatura ambiente.
3. Enquanto isso, em um frasco de 50 mL, aquecer 30 mL de agarose de baixo ponto de fusão a 3% em meio líquido BG11. Use um micro-ondas regulado para o nível de potência média e verifique a solução a cada 15 s até dissolver completamente. Reserve para esfriar até 37 °C.
   OBS: Autoclave a solução de agarose para evitar contaminação.
4. Feita a centrifugação, descartar 1,9 mL do sobrenadante e ressuspender as células no volume restante, pipetando pelo menos três vezes para cima e para baixo.
5. Misturar as células ressuspensas com 900 μL da solução de agarose a 3%, pipetando para cima e para baixo pelo menos três vezes.
   NOTA: A solução de agarose deve ser líquida, mas não muito quente para evitar danos celulares. O próximo passo deve ser realizado rapidamente e antes que a solução de agarose forme um gel como consistência =.
6. Aspirar cuidadosamente a matriz de agarose numa seringa de 1 ml. É importante evitar a geração de bolhas enquanto a amostra está sendo aspirada com a seringa.
   NOTA: Antes desta etapa, certifique-se de que a ponta da seringa está cortada para eliminar o orifício de entrada estreito.
7. Deixar solidificar a mistura amostra-agarose colocando a seringa na posição horizontal à temperatura ambiente durante 2 horas.
8. Retire a matriz de agarose cuidadosamente usando o êmbolo e coloque-a em uma superfície limpa e plana.
9. Corte a amostra solidificada em fatias, na faixa de espessura de 0,5 a 1 mm, mantendo a integridade da matriz.
   NOTA: Para melhores resultados, corte a matriz de agarose usando um bisturi ou lâminas de barbear finas.
10. Coloque as fatias lado a lado sobre uma lamínula. O número de discos em uma lamínula dependerá de suas dimensões.
    NOTA: Para microscopia de lapso de tempo, recomenda-se o uso de uma câmara celular feita para análise de microscopia (por exemplo, câmaras magnéticas Attofluor ou Chamlida). Estas câmaras permitem a aquisição da amostra evitando a desidratação. Neste exemplo, as amostras são preparadas em lamínulas arredondadas (25 mm) usando a câmara Attofluor.
11. Adicionar 2 ml de solução de agarose a 3% derretida sobre a amostra colocada na câmara para evitar a desidratação.
12. Espere até que a solução de agarose esteja completamente solidificada para formar um gel.

4. Aquisição de imagens

1. Padronizar os parâmetros para visualização da proteína fluorescente de interesse na cepa mutante em microscópio confocal. Certifique-se de que o microscópio pode detectar a autofluorescência e o marcador fluorescente selecionado.
2. Visualize a amostra na conformação do campo brilhante com ampliação máxima e procure um filamento orientado verticalmente como mostrado na Figura 1.
3. Encontre o local de divisão de interesse com uma varredura inicial usando o sinal de autofluorescência ao longo do plano Z.
4. Use os parâmetros do marcador de proteína fluorescente para visualizar o sinal da proteína de interesse no local de divisão.
5. Realizar experimentos de lapso de tempo de acordo com o modelo biológico e a proteína de interesse. Por exemplo, neste caso, experimentos de lapso de tempo de 10 s em 50 s foram realizados para registrar a dinâmica de FtsZ ao longo do anel Z em Anabaena sp.

Results

Visualização do anel Z em Anabaena sp., pelo método de imobilização vertical
Para estudar a dinâmica dos componentes do anel Z em bactérias, é necessário adquirir imagens em células orientadas verticalmente. Nesta posição, é possível visualizar o anel Z e as principais proteínas do divisômio para monitorar a dinâmica proteica por microscopia de lapso de tempo. A preparação clássica de amostras para bactérias não funciona para cianobactérias filamentosas. No caso de Anabaena sp., os f...

Discussion

O estudo da dinâmica das proteínas divisômicas é, sem dúvida, um desafio. Particularmente, nas cianobactérias filamentosas, um dos desafios é a visualização do anel Z no plano horizontal, para o qual as células devem ser orientadas verticalmente. O método aqui descrito permite o posicionamento do anel Z no plano XY para realizar as diferentes análises. Este é o primeiro método simples para cianobactérias filamentosas que permite a visualização completa do anel Z.

Embora este protocolo seja si...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Seringa de 1 ml	Qingdao Agna Medical Technology Co., Ltd.	-	A seringa de plástico médico descartável com agulha de 1 ml geralmente usada para bombear líquido ou líquido de injeção, neste experimento é usada para sugar a amostra e fazê-la polimerizar.
Câmara de Células Attofluor	ThermoFischer Scientific	A7816	A Câmera de Células Attofluor é um suporte de lamínula durável e prático projetado para visualizar amostras de células vivas em microscópios verticais ou invertidos.
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Baixo ponto de fusão agarose	Promega	V3841	Agarose, baixo ponto de fusão, grau analítico, é ideal para aplicações que requerem recuperação de fragmentos de DNA intactos após eletroforese em gel.
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Lâminas de barbear finas Schick Super Chromium	Farmazon	SKU: 401146	As lâminas de barbear finas são usadas para cortar a matriz de agarose, permitindo-nos obter os discos com a amostra, mantendo a integridade da matriz.