Método de imobilização vertical para análise de microscopia time-lapse em cianobactérias filamentosas

Resumo

Apresentamos um método simples e acessível para visualização de cianobactérias filamentosas no plano XY. Foi utilizada uma matriz de agarose de baixo ponto de fusão, permitindo a aquisição de imagens das proteínas envolvidas na divisão, na orientação vertical. Portanto, esta metodologia pode ser aplicada a qualquer organismo filamentoso e diferentes tipos de proteínas.

Resumo

Um evento principal na divisão celular bacteriana é o processo de septação, onde a proteína FtsZ é o elemento chave. O FtsZ polimeriza-se formando uma estrutura semelhante a um anel (anel Z) no meio da célula que serve de arcabouço para outras proteínas de divisão. A microscopia de super-resolução em modelos bacterianos de Escherichia coli e Bacillus subtilis mostrou que o anel Z é descontínuo, enquanto estudos de imagem de células vivas demonstraram que o FtsZ se move ao longo do anel por um mecanismo conhecido como esteira. Para estudar a dinâmica da FtsZ in vivo, uma colocação especial de células em posição vertical é necessária para obter imagens da estrutura completa do anel no plano XY. No caso da imagem por FtsZ em cianobactérias multicelulares, como Anabaena sp.PCC7120, manter os filamentos em posição vertical é um desafio devido ao tamanho das células e ao comprimento dos filamentos. Neste artigo, descrevemos um método que permite a imobilização vertical de filamentos de Anabaena sp., PCC 7120, usando agarose de baixo ponto de fusão e seringas, para registrar o anel Z em um mutante que expressa uma proteína de fusão FtsZ-sfGFP. Este método é uma maneira rápida e barata de registrar a dinâmica de proteínas no local de divisão usando microscopia confocal.

Introdução

A divisão celular bacteriana é o processo no qual uma célula-mãe gera duas células-filhas, na maioria dos casos pelo mecanismo conhecido como fissão binária. Um dos eventos mais precoces no processo de septação é a localização de FtsZ no meio da célula¹. Essa proteína, estruturalmente homóloga à tubulina², é conservada e amplamente distribuída na maioria das bactérias, e sua polimerização gera uma estrutura contrátil conhecida como anel Z³. Este anel serve como um andaime para outras proteínas de divisão e juntos eles formam uma maquinaria molecular chamada divisome. Vários estudos têm demonstrado....

Protocolo

1. Considerações e seleção do modelo celular

NOTA: As cianobactérias têm uma forte autofluorescência devido à presença de pigmentos fotossintéticos. Este sinal está na parte vermelha do espectro, portanto, as proteínas fluorescentes adequadas para imageamento em cianobactérias são as que estão longe da emissão vermelha. Por exemplo, GFP, YFP, Vênus, Turquesa e BFP.

1. Selecione um componente divisômico presente na cepa de cianobactéria filamentosa alvo. Para os experimentos, é necessário construir um mutante cianobacteriano filamentoso que expresse o componente divisômico selecionado fundido a uma proteína fluorescen....

Resultados

Visualização do anel Z em Anabaena sp., pelo método de imobilização vertical
Para estudar a dinâmica dos componentes do anel Z em bactérias, é necessário adquirir imagens em células orientadas verticalmente. Nesta posição, é possível visualizar o anel Z e as principais proteínas do divisômio para monitorar a dinâmica proteica por microscopia de lapso de tempo. A preparação clássica de amostras para bactérias não funciona para cianobactérias filamentosas. No caso de Anabaena sp., os f.......

Discussão

O estudo da dinâmica das proteínas divisômicas é, sem dúvida, um desafio. Particularmente, nas cianobactérias filamentosas, um dos desafios é a visualização do anel Z no plano horizontal, para o qual as células devem ser orientadas verticalmente. O método aqui descrito permite o posicionamento do anel Z no plano XY para realizar as diferentes análises. Este é o primeiro método simples para cianobactérias filamentosas que permite a visualização completa do anel Z.

Embora este protocolo seja si.......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Seringa de 1 ml	Qingdao Agna Medical Technology Co., Ltd.	-	A seringa de plástico médico descartável com agulha de 1 ml geralmente usada para bombear líquido ou líquido de injeção, neste experimento é usada para sugar a amostra e fazê-la polimerizar.
Câmara de Células Attofluor	ThermoFischer Scientific	A7816	A Câmera de Células Attofluor é um suporte de lamínula durável e prático projetado para visualizar amostras de células vivas em microscópios verticais ou invertidos.
Termociclador Axygen MaxyGene II com bloco de 96 poços	CORNING	THERM-1001	O novo Termociclador MaxyGene II aumentou a velocidade e os recursos avançados, proporcionando o desempenho premium que você espera dos produtos da marca Axygen. Programação flexível exclusiva. Tempos de execução rápidos. Fluxo de trabalho aprimorado em relação aos cicladores de gradiente tradicionais. Taxas de rampa de até 5 graus; C/seg. A tampa aquecida ajustável acomoda tiras, tubos e microplacas.
Óculos de Cobertura Fisherbrand: Circles	ThermoFischer Scientific	12-546-2P	Feito do melhor vidro óptico de borossilicato, com espessura e tamanho uniformes. Forma circular. Resistente à corrosão.
Baixo ponto de fusão agarose	Promega	V3841	Agarose, baixo ponto de fusão, grau analítico, é ideal para aplicações que requerem recuperação de fragmentos de DNA intactos após eletroforese em gel.
Microscópio LSM 880 da Zeiss Airyscan	Zeiss-O		microscópio Zeiss Airyscan LSM 880 é um microscópio focal de varredura a laser que pode adquirir imagens abaixo do limite de resolução (resolução lateral ~ 120nm e resolução axial ~ 350nm). Os detectores são altamente sensíveis, possibilitando a aquisição de imagens de super-resolução em alta velocidade.
Microcentrí fuga Fresco 17	ThermoFischer Scientific	75002402	Acelere os processos rotineiros de preparação de amostras em até 17.000 μμμes com nossa microcentrífuga padrão, disponível com refrigeração. Essas microcentrífugas oferecem produtividade, versatilidade, segurança e conveniência em um instrumento de laboratório de design compacto e fácil de usar.
Microscópio de lapso de tempo Nikon	Nikon-O		microscópio confocal de varredura a laser Nikon C2 é um microscópio ideal para timelapse de longo prazo, pois graças à sua câmara de incubação é possível manter as amostras em condições ideais por mais de 8 horas.
Lâminas de barbear finas Schick Super Chromium	Farmazon	SKU: 401146	As lâminas de barbear finas são usadas para cortar a matriz de agarose, permitindo-nos obter os discos com a amostra, mantendo a integridade da matriz.