Aplicação da Análise de Citometria de Fluxo para Medir Múltiplos Parâmetros Mitocondriais em Organoides Cerebrais 3D

Summary

Este protocolo relata um método único de uso de um citômetro de fluxo e vários anticorpos para avaliação simultânea de vários parâmetros funcionais mitocondriais, incluindo alterações no volume mitocondrial, quantidades das subunidades complexas da cadeia respiratória mitocondrial (MRC) e replicação do DNA mitocondrial (mtDNA).

Abstract

A disfunção mitocondrial é um contribuinte primário ou secundário comum para muitos tipos de neurodegeneração, e alterações na massa mitocondrial, complexos da cadeia respiratória mitocondrial (MRC) e número de cópias do DNA mitocondrial (mtDNA) geralmente aparecem nesses processos. Organoides cerebrais humanos derivados de células-tronco pluripotentes induzidas por humanos (iPSCs) recapitulam o arranjo citoarquitetônico tridimensional (3D) do cérebro e oferecem a possibilidade de estudar mecanismos de doenças e rastrear novas terapias em um sistema humano complexo. Aqui, relatamos uma abordagem única baseada em citometria de fluxo para medir vários parâmetros mitocondriais em organoides corticais derivados de iPSC. Este relatório detalha um protocolo para gerar organoides cerebrais corticais a partir de iPSCs, dissociação de célula única de organoides gerados, fixação, coloração e análise citométrica de fluxo subsequente para avaliar vários parâmetros mitocondriais. A coloração dupla com anticorpos contra a subunidade do complexo MRC NADH: Ubiquinona Oxidorredutase Subunidade B10 (NDUFB10) ou fator de transcrição mitocondrial A (TFAM) juntamente com o canal seletivo de ânions dependente de voltagem 1 (VDAC 1) permite a avaliação da quantidade dessas proteínas por mitocôndria. Como a quantidade de TFAM corresponde à quantidade de mtDNA, ela fornece uma estimativa indireta do número de cópias de mtDNA por conteúdo mitocondrial. Todo esse procedimento pode ser concluído em um período de 2-3 h. Crucialmente, permite a quantificação simultânea de vários parâmetros mitocondriais, incluindo níveis totais e específicos relativos à massa mitocondrial.

Introduction

As mitocôndrias são organelas celulares essenciais e o principal local de produção de trifosfato de adenosina (ATP). Além de fornecer energia para as células, as mitocôndrias também participam de vários processos celulares, incluindo transmissão de informações celulares, diferenciação celular e apoptose, e têm a capacidade de regular o crescimento celular e o ciclo celular. Alterações na função mitocondrial foram identificadas em várias doenças neurodegenerativas, incluindo doença de Parkinson (DP)^1,2, doença de Alzheimer (DA)³ e esclerose lateral amiotrófica (ELA)⁴. A disfunção mitocondrial desempenha um papel no processo de envelhecimento, acumulando mutações somáticas no mtDNA e diminuindo a função da cadeia respiratória⁵.

Vários tipos de disfunção mitocondrial ocorrem na neurodegeneração, e a capacidade de medir essas alterações é extremamente útil ao estudar os mecanismos da doença e testar possíveis tratamentos. Além disso, o estabelecimento de sistemas modelo in vitro adequados que recapitulam a doença nas células cerebrais humanas é vital para uma melhor compreensão dos mecanismos da doença e o desenvolvimento de novas terapias. As iPSCs de pacientes com doenças neurodegenerativas têm sido usadas para gerar diversas células cerebrais que manifestam danos mitocondriais 6,7,8,9. O desenvolvimento de organoides cerebrais 3D derivados de iPSCs é um passo importante na modelagem de doenças. Esses organoides cerebrais derivados de iPSC fornecem complexidade e contêm o próprio histórico genético do paciente, fornecendo assim um modelo de doença que reflete com mais precisão a patologia no cérebro do paciente.

Embora algumas pesquisas tenham sido conduzidas em estudos mitocondriais usando organoides cerebrais derivados de iPSC 10,11,12, técnicas convenientes e confiáveis para determinar vários parâmetros funcionais mitocondriais em organoides cerebrais derivados de iPSC permanecem limitadas. A citometria de fluxo fornece uma ferramenta poderosa para medir parâmetros mitocondriais no nível de uma única célula, como demonstramos anteriormente¹³. Este estudo fornece um protocolo detalhado para gerar organoides corticais a partir de iPSCs, combinado com uma nova abordagem baseada em citometria de fluxo para medir simultaneamente vários parâmetros mitocondriais, incluindo massa mitocondrial, subunidades complexas da cadeia respiratória e número de cópias do mtDNA (Figura 1). É importante ressaltar que, ao usar a massa mitocondrial como denominador, esses protocolos permitem medir os níveis total e específico por unidade mitocondrial.

Protocol

1. Diferenciação de iPSCs em organoides corticais

1. Preparação de placas revestidas com matriz
   1. Descongele o frasco da matriz de membrana basal disponível comercialmente no gelo durante a noite. Diluir em 1:100 em Advanced Dulbecco's Modified Eagle's Medium/Ham's F12 DMEM/F12 frio (1% de concentração final). Faça alíquotas e guarde-as a -20 °C (ver Tabela de Materiais).
   2. Descongele a solução da matriz de membrana a 4 °C (mantenha-a fria) e cubra o número necessário de alvéolos (1 mL para um poço em uma placa de 6 poços). Incubar a 37 °C durante 1 h.
   3. Retire a placa da incubadora e deixe atingir a temperatura ambiente (RT) (deixe agir por uma hora).
      NOTA: As placas podem ser armazenadas por até 2 semanas na geladeira (lembre-se de retirá-las e aquecer os poços revestidos necessários para aquele dia em RT até que não esfriem mais ao toque antes do uso). Recomenda-se usar as placas dentro de 3 dias. Para armazenamento prolongado, adicione 1 mL de Essential 8 Medium (consulte a Tabela de Materiais) à placa revestida para evitar que o gel seque.

2. Preparação Essential 8 (E8) meio para cultura de iPSC

1. Em um ambiente estéril, prepare o meio E8 combinando o meio basal E8 com o suplemento E8 (consulte a Tabela de Materiais). Isso pode ser armazenado a 4 °C por 2 semanas.
   NOTA: Descongele o suplemento E8 congelado a 4 °C durante a noite antes de preparar o meio completo. Não é recomendado descongelar o suplemento congelado a 37 °C; use E8 Médio por 2 semanas. Antes de usar, aqueça o E8 Medium necessário para aquele dia no RT até que não esteja mais frio ao toque.

3. Subcultura de iPSCs

1. Pré-aqueça as placas revestidas com matriz em RT ou incubadora a 37 °C por 20-30 min. Pré-aqueça a quantidade de meio E8 necessária em RT.
2. Aspirar o meio de cultura com uma pipeta.
3. Enxágue os iPSCs (consulte a Tabela de Materiais) com solução salina tamponada com fosfato de Dulbecco (livre de Ca²⁺/Mg²⁺ ) (DPBS-/-) (4 mL para um poço em uma placa de 6 poços).
4. Adicione ácido etilenodiaminotetracético (EDTA) (0,5 mM) (1 mL para um poço em uma placa de 6 poços). Incube a 37 °C até que as bordas das colônias comecem a se desprender da placa (geralmente 3-5 min).
5. Aspirar a solução de dissociação.
6. Adicione o meio E8 pré-aquecido (4 mL para um poço em uma placa de 6 poços) e use alta pressão para separar as colônias de iPSC.
7. Transfira para dois alvéolos diferentes numa placa de 6 poços revestida com matriz (2 ml para um alvéolo numa placa de 6 poços) e incube a 37 °C.
   NOTA: Agite suavemente antes de colocar a placa na incubadora. A proporção de divisão pode ser de 1:2-1:4.
8. Troque mídia diariamente até que as colônias obtenham 80% de confluência com bom tamanho e conexões.
   NOTA: Monitore colônias de tamanho apropriado, normalmente caracterizadas por uma forma circular bem definida e um diâmetro variando de 0,5 a 1 mm. As colônias devem exibir estruturas densas e compactas com bordas lisas e claramente delineadas.

4. Formação do corpo embrióide (EB) e indução neural

1. Prepare o meio de indução neural (NIM) combinando os componentes listados na Tabela de Materiais.
2. Aspire o meio e enxágue as células com DPBS -/- (4 mL por poço em uma placa de 6 poços).
3. Adicione Accutase pré-aquecida (1 mL por poço em uma placa de 6 poços) (consulte a Tabela de Materiais) no poço e incube a 37 ° C por 10 min.
4. Pipete suavemente a solução para cima e para baixo 3 a 4 vezes usando uma ponta de pipeta de 1000 μL.
5. Neutralize com 2 mL de DMEM com 10% de soro fetal bovino (FBS) e centrifugue o tubo cônico de 15 mL contendo as células a 600 x g por 5 min em RT. Aspire o sobrenadante.
6. Ressuspenda os grânulos de células pipetando suavemente para cima e para baixo até obter paletes de célula única.
7. Conte e calcule a concentração de células vivas usando azul de tripano¹⁴ em um contador de células automatizado.
8. Calcule a taxa de diluição e dilua as células em NIM para fazer uma concentração celular final de 60.000 células vivas / mL.
9. Adicione o inibidor da proteína quinase associada a Rho (ROCK) Y-27632 (concentração final de 50 μM) (consulte a Tabela de Materiais) à suspensão celular e misture suavemente.
10. Adicione 150 μL de suspensão de célula única em cada poço de placa de 96 poços de fixação ultrabaixa (consulte a Tabela de Materiais) e coloque na incubadora. Configure como Dia 0.
11. No dia 1, verifique as células e as formas de EB em cada poço.
    NOTA: Avalie a formação bem-sucedida de EB com base em sua aparência brilhante, esférica e translúcida ao microscópio, sua capacidade de permanecer flutuando livremente e separada e a ausência de células mortas, que aparecem como manchas escuras.
12. No dia 2, remova 75 μL de meio de cada poço com cuidado e adicione 150 μL NIM junto com 50 μM Y-27632 a cada poço.
13. Nos dias 4, 6 e 8, remova 100 μL de meio de cada poço e adicione 150 μL de NIM a cada poço.

5. Geração de organoides corticais

1. Prepare o meio de diferenciação neural menos vitamina A (NDM-) combinando os componentes listados na Tabela de Materiais.
2. No dia 10, transfira EBs da placa de 96 poços de fixação ultrabaixa para a placa de 6 poços de fixação ultrabaixa usando uma pipeta de 5 mL. Transfira oito EBs para cada poço com cautela (Figura 2). Adicione 5 mL de NDM- a cada poço.
3. Coloque a placa no agitador orbital dentro da incubadora e comece a girar a 80 rpm.
4. Nos dias 12, 14 e 16, substitua o NDM- por 4 mL após aspirar 3 mL de meio antigo.

6. Maturação e cultura a longo prazo de organoides corticais

1. Prepare o meio de diferenciação neural com vitamina A (NDM+) e fator neurotrófico derivado do cérebro (BDNF). Para obter detalhes, consulte Tabela de materiais.
2. No dia 18, remova o meio de 3 mL e adicione 4 mL NDM+.
3. Retorne o prato para a cultura de fiação.
4. Alimentar a cada 4 dias e manter os organoides corticais diferenciados em NDM+ até o uso. Organoides corticais de 25 a 40 dias de idade foram usados para a análise a jusante.
   NOTA: Os organoides corticais podem ser mantidos por mais tempo (até 3-4 meses); mas a viabilidade celular será reduzida devido à falta de troca nutricional.

7. Caracterização celular por imunocitoquímica e coloração por imunofluorescência

1. Use uma pipeta de 1000 μL para coletar suavemente o organoide do meio e coloque-o suavemente em um meio com o mínimo de meio em uma lâmina de microscópio padrão.
2. Deixe secar completamente em RT. Adicione 4% de paraformaldeído (PFA) (300 μL por amostra) por 30 min. Remova o PFA e enxágue duas vezes com PBS.
   NOTA: O PFA é tóxico e suspeito de ser cancerígeno. Evite o contato com a pele e os olhos e manuseie sob uma coifa química.
3. Adicione solução de sacarose a 30% (300 μL por amostra) às lâminas e incube durante a noite a 4 °C.
4. Bloqueie e permeabilize os organoides com tampão de bloqueio (BB) (300 μL por amostra) contendo PBS (com Ca²⁺/Mg²⁺), 0,3% de Triton X-100 e 10% de soro de cabra normal por 2 h em RT (ou durante a noite a 4 ° C). Contorne os organoides com uma caneta de barreira hidrofóbica para manter o tampão na lâmina.
5. Sobreponha as amostras com anticorpo primário em tampão de bloqueio (300 μL por amostra), anti-SRY (região determinante do sexo Y) - caixa 2 (SOX2, 1:100) e anti-neural tuberina beta III (Tuj1, 1:1000) e incube durante a noite a 4 ° C no escuro (ver Tabela de Materiais).
6. Lave em PBS por 3 h com duas a três trocas de buffer em uma plataforma de balanço suave.
7. Incubar com anticorpo secundário (300 μL por amostra), farinha anti-Alexa 488 (1:800) e farinha anti-Alexa 594 (1:800), durante a noite a 4 ° C em uma câmara escura umidificada. Adicione a coloração nuclear Hoechst 33342 (1:5000) ao mesmo tempo (consulte a Tabela de Materiais).
8. Aspire o anticorpo e enxágue rapidamente com PBS, depois adicione PBS contendo 0,01% de NaAzide por 1-2 dias a 4 ° C para evitar contaminação.
9. Aspire o PBS e remova o excesso de solução. Monte os organoides com meio de montagem (consulte a Tabela de Materiais) e, em seguida, adicione uma lamínula. Evite a formação de bolhas de ar e coloque em uma sala escura em RT por pelo menos 12 h para permitir que a montagem polimerize totalmente.
   NOTA: A amostra agora está pronta para ser imaginada sob um microscópio de fluorescência.

8. Dissociação de organoides corticais

1. Adicione 30 mL de DPBS -/- em um tubo de centrífuga de 50 mL.
2. Recolha suavemente os organoides cerebrais no tubo utilizando uma pipeta de 10 ml. Pelo menos 3 organoides são usados para uma coloração e devem ter mais de 25 dias, mas menos de 40 dias.
3. Organoides de sedimentos por aproximadamente 5 min. Não centrifugue.
4. Aspire a DPBS e adicione 2 mL de Accutase pré-aquecida no tubo. Incubar a amostra em banho-maria durante 5 min a 37 °C.
5. Triturar 15 vezes suavemente usando uma ponta de pipeta de 1000 μL sem gerar bolhas. Incubar a amostra por mais 5 min a 37 °C em banho-maria.
6. Dissociado suavemente usando ponteiras de pipeta de 1000 μL 15 vezes sem gerar bolhas (Figura 3A).
   NOTA: Se ainda houver algumas células não dissociadas, transfira as células não dissociadas para um novo tubo de centrifugação de 50 mL e incube por mais 5 minutos em banho-maria a 37 ° C. Em seguida, dissocie suavemente usando ponteiras de pipeta de 1000 μL 20 vezes.
7. Neutralize com 4 mL de DMEM com 10% de FBS e centrifugue o tubo cônico de 15 mL contendo as células a 600 x g por 5 min em RT.
8. Aspire o sobrenadante e ressuspenda com 200 μL de DPBS usando ponteiras de pipeta de 1000 μL 10 vezes sem gerar bolhas.
9. Adicione 200 μL de DPBS para fazer um volume total de 400 μL de suspensões de células em DPBS.
10. Filtre com o filtro ou tubo de filtro (use filtros de 35 ou 40 μm e enxágue o filtro com DPBS antes de usar o filtro).
11. Separe metade da solução em um tubo e use-a como amostra não corada.

9. Medição por citometria de fluxo de subunidades do complexo MRC e TFAM em células fixas

1. Adicione corante de coloração vivo e morto (L / D) (1: 1000) (consulte a Tabela de Materiais) (com Vermelho Distante ou Infravermelho Próximo, dependendo da configuração dos marcadores para citometria de fluxo).
   NOTA: Se um novo frasco para o corante L/D for aberto, adicione 50 μL de DMSO para reconstituir e faça uma alíquota de 10 μL para armazená-los a -20 °C.
2. Mantenha em RT e escuro por 30 min. Adicione 40 mL de DPBS -/-. Centrifugue a 600 x g por 5 min.
3. Ressuspenda em suspensão unicelular após descartar o sobrenadante.
4. Fixe e permeabilize as células com 1 mL de metanol gelado a 90% a -20 °C por 20 min.
5. Bloqueie as amostras em 1 mL de tampão de bloco contendo 0,3 M de glicina, 5% de soro de cabra e 1% de albumina de soro bovino (BSA) em PBS (com Ca²⁺/Mg²⁺).
6. Lave com tampão de fluxo de 20 mL contendo PBS (com Ca²⁺/Mg²⁺) com BSA 0,2% uma ou duas vezes.
7. Adicione os anticorpos primários anti-NDUFB10 conjugados com Alexa Fluor 405 (1:100), anti-VDAC 1 conjugado com Alexa Fluor PE (1:100) e anticorpo anti-TFAM conjugado com Alexa Fluor 488 (1:200) por 30 min (consulte a Tabela de Materiais).
8. Lave com tampão de fluxo de 20 mL.
9. Aspirar e deixar cerca de 100 μL e reconstituir os sedimentos celulares em tampão de fluxo de 300 μL.
10. Transfira as células para tubos de fluxo de 1,5 mL. Mantenha no escuro e no gelo.
11. Analise no citômetro de fluxo (consulte a Tabela de Materiais). Os sinais foram detectados para Anti NDUFB10-Alexa 405 usando um filtro passa-banda 450/50, TFAM-Alexa 488 usando filtro passa-banda 530/30, VDAC 1-Alexa 647 usando filtro passa-banda 670/14 e corante L / D no filtro passa-banda 780/60 (Figura 3B).

10. Aquisição e análise por citometria de fluxo

1. Use amostras não coradas e coradas únicas do organoide de controle para definir a voltagem das configurações do citômetro.
2. Use o tubo de controle não corado para definir os gráficos de dispersão da área de dispersão direta (FSC-A) e da área de dispersão lateral (SSC-A) com base no tamanho e granularidade da população de células (Figura 4A).
3. Bloqueie os detritos para selecionar células vivas das parcelas FSC-A e SSC-A. Gate out dupletos usando a altura de dispersão lateral (SSC-H) vs. Gráfico SSC-A (Figura 4B).
4. Selecione as células vivas com base na coloração do corante L/D, alternando para APC-cy7 vs. Gráfico FSC-A (Figura 4C).
5. Usando as amostras não coradas de cada linha, desenhe uma porta acima da população principal dos eventos em FSC-A vs. canais de fluorocromo (FITC, APC, BV 421) plotagens.
6. A configuração compensa o citômetro de fluxo¹⁵.
7. Use o controle de isotipo para controle negativo para observar a coloração de fundo.
8. Realize a aquisição de dados.
   1. Selecione as células vivas com base na coloração do corante L/D, alternando para APC-cy7 vs. o gráfico FSC-A (Figura 4C).
   2. Utilize o não corado como controle negativo. Então, ao examinar o FSC-A vs. canais de fluorocromo (FITC, APC, BV 421), estabelecem uma porta acima da população principal de eventos de célula única (Figura 4D-F).
9. Realize a análise de dados usando o software FlowJo (consulte a Tabela de Materiais).
   1. Duplique as posições das comportas nas amostras de células coradas. Documente o número de células que exibem coloração positiva.
   2. Para cada população-alvo, avalie a intensidade média de fluorescência (MFI) de diferentes canais (FITC, APC, BV 421) plotados no eixo x de um histograma para identificar o sinal mitocondrial. Os valores específicos para a subunidade do complexo I NDUFB10 e TFAM podem ser determinados dividindo o MFI da expressão complexa ou TFAM pelo indicador de massa mitocondrial, VDAC 1.

Results

A Figura 1 fornece uma representação diagramática do processo de diferenciação e das estratégias utilizadas para análise por citometria de fluxo. As iPSCs humanas foram cultivadas em placas não aderentes de 96 poços para formar EBs e depois transferidas para placas não aderentes de 6 poços para obter organoides corticais totalmente crescidos. A composição celular dos organoides foi validada por microscopia confocal após imunomarcação com marcadores neuronais¹⁶ e gliai...

Discussion

Um protocolo é apresentado para gerar organoides cerebrais corticais a partir de iPSCs humanas e para realizar a análise citométrica de fluxo de parâmetros mitocondriais em células isoladas isoladas desses organoides. A composição celular dos organoides foi verificada por microscopia confocal com coloração imuno-histoquímica para marcadores de células neuronais e gliais. A estratégia baseada em citometria de fluxo de co-coloração com anti-NDUFB10, VDAC 1 e TFAM demonstrou permitir a medi...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Anticorpos usando citometria
anti-DUFB10 Alexa Fluor 405	NOVUS biologicals	NBP2-72915AF405
anti-VDAC1 Alexa Fluor 647	Santa cruz technology	sc-390996
anti-TFAM Alexa Fluor 488	Abcam	ab198308
L/D kit de coloração de células mortas near-IR fixável	Life technologies	L10119
Anticorpos usando na coloração
anti-Tuj1	Abcam	ab78078
anti-SOX2	Abcam	ab97959
farinha anti-Alexa 488	Thermo Fisher Scientific	A28175
farinha anti-Alexa 594	Thermo Fisher Scientific	A-21442
Células comerciais
AG05836 (RRID:CVCL_2B58)			Fornecido por Gareth John Sullivan do Instituto de Ciências Médicas Básicas do Universidade de Oslo, Noruega
Essential 8 Medium (meio de cultura iPSC)
Essential 8 Basal Medium	Suplemento Thermo Fisher Scientific	A1516901
Essential 8 (50x) 2% (v/v)	Thermo Fisher Scientific	A1517101
Loja em 4 ° C e aqueça até à RT antes de utilizar.
Instruments
Heracell 150i CO2 Incubadoras	Fisher Scientific, EUA
Agitadores orbitais - SSM1, SSL1	Stuart Equipment, Reino Unido
Câmera de microscópio CCD Leica DFC3000 G	Leica Microsystems, Alemanha
Banho-maria Jb Academy Basic Jba5 JBA5 Grant Instrumentos	Grant Instruments, EUA
Sistema de aspiração de fluidos Controle BVC	Vacuubrand, Alemanha
Microscópio confocal Leica TCS SP8 STED	Leica Microsystems, Alemanha
Tubo de falcão de 50 mL	Sigma-Aldrich	CLS430828
BD LSR Fortessa	BD Biosciences, EUA
Análise de amostrador Flowjo	FlowJo LLC, EUA
Pipeta de 10 mL	Sigma-Aldrich	SIAL1100
1, 10, 100, 1000 mL	pipeta Sigma-Aldrich
40 µ m Cell stariner	Sigma-Aldrich	CLS431750
placa de 96 poços de fixação ultra-baixa	S-BIO	MS-9096UZ
Contador de células automatizado Countess II	Thermo Fisher Scientific
Meio de diferenciação neural  (NDM+)
DMEM/F12	Life technologies	11330032
Neurobasal medium	Life technologies	2110349
Glutamax suplemento 1% (v/v)	Life technologies	35050
N2 suplemento 0,5% (v/v)	Life technologies	17502-048
B27 suplemento 1% (v/v)	Life technologies tecnologias	17504-044
β-Mercaptoetanol 50 µ M	Sigma-aldrich	M3148
BDNF 20 ng/mL	Peprotech	450-02
Ácido ascórbico 200 µ M	Sigma-Aldrich	A92902
Loja em 4° C por até 2 semanas
Meio de diferenciação neural menos viatmina A (NDM-)
DMEM/F12	Life technologies	11330032
Meio neurobasal	Life technologies	2110349
suplemento Glutamax 1% (v/v)	Life technologies	35050
N2 suplemento 0,5% (v/ v)	Tecnologias de vida	17502-048
B27 suplemento sem vit. A 1% (v/v)	Tecnologias de vida	12587010
β-Mercaptoetanol 50 µ Loja M	Sigma-aldrich	M3148
em 4° C por até 8 dias
Meio de indução neural (NIM)
DMEM/F12	Life technologies	11330032
Knockout serum replacement 15% (v/v)	Life technologies	10828028
Glutamax suplemento 1% (v/v)	Life technologies	35050
β- Mercaptoetanol 100 µ M	Sigma-Aldrich	M3148
LDN-193189 100 nM	Stemgent/Reprocell	04-0074
SB431542 10 µ M	Tocris	1614
XAV939 2 µ Loja M	Sigma-Aldrich	X3004
em 4° C por até 10 dias
Meio de neutralização
IMDM	Tecnologias de vida	21980032
FBS 10%	Sigma-Aldrich	12103C
Outros reagentes
DPBS (livre de Ca2+/Mg2+)	Thermo Fisher Scientific	14190250
Albumina de soro bovino	Europa Bioproducts	EQBAH62-1000
Accutase	Life technologies	A11105-01
Geltrex	Life technologies	A1413302
EDTA	Life technologies	15575038
Advanced DMEM / F12	Life technologies	12634010
Tecido neural kit de dissociação	Miltenyi biotec	130-092-628
Y-27632 dicloridrato Inibidor de Rocha	Biotechne Tocris	1254
Fluoromount-G™ Meio de Montagem	SouthernBiotech	0100-20
PFA	Thermo Fisher Scientific	28908