Artigo de método

Melhorando a confiabilidade do biobanco de tumores de próstata com técnica de amostragem aprimorada e caracterização histológica

DOI:

10.3791/65635

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17 de novembro de 2023

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1Department of Pathology, Hospital Universitario y Politécnico La Fe, 2Department of Urology, Hospital Universitario y Politécnico La Fe, 3Biobanco La Fe, Instituto de Investigación Sanitaria La Fe, 4Department of Medicine, Jaume I University of Castellon, 5Department of Surgery, University of Valencia, 6Department of Pathology, University of Valencia

* These authors contributed equally

Neste artigo

Resumo

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Este protocolo descreve um método para facilitar a coleta de amostras de espécimes de prostatectomia radical. O objetivo é mapear, caracterizar e dissecar micro-macro amostras de tecido dos espécimes com base em critérios anatomopatológicos antes de armazená-los em um Biobanco.

Resumo

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A aquisição de amostras de tecido tumoral frescas e bem caracterizadas é fundamental para a realização de estudos "ômicos" de alta qualidade. No entanto, pode ser particularmente desafiador no contexto do câncer de próstata (CP) devido à natureza única desse órgão e à alta heterogeneidade associada a esse tumor. Por outro lado, caracterizar histopatologicamente as amostras antes de seu armazenamento sem causar alterações teciduais significativas também é um desafio intrigante. Nesse contexto, apresentamos um novo método para aquisição, mapeamento, caracterização e microdissecação de tecido prostático ressecado com base em critérios anatomopatológicos.

Ao contrário dos protocolos publicados anteriormente, este método reduz o tempo necessário para a análise histopatológica da peça de próstata sem comprometer sua estrutura, o que é crucial para a avaliação das margens cirúrgicas. Além disso, permite o delineamento e micro-macro dissecção de amostras frescas de tecido prostático, com foco em áreas histológicas de tumores definidas por critérios patológicos como escore de Gleason, lesões precursoras (neoplasia intraepitelial prostática de alto grau - NIP) e lesões inflamatórias (prostatite). Essas amostras são então armazenadas em um Biobanco para análises de pesquisa subsequentes.

Introdução

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O câncer de próstata (CP) é o2º câncer mais frequente em homens e a5ª principal causa de morte em todo o mundo1. O tratamento e o prognóstico do paciente dependem do estadiamento e da classificação (escore de Gleason) do tumor, como evidenciado pelas maiores taxas de sobrevida em 5 anos de tumores localizados e de baixo grau (grau 6 de Gleason) (99%) em comparação com altos graus de Gleason e tumores metastáticos (31%)2.

A recidiva local do PC e a falha do tratamento têm sido associadas à alta heterogeneidade genética intratumoral característica desse tipode tumor 3. Além disso, o PC é considerado uma doença multifocal com vários focos tumorais exibindo diferentes características morfológicas, histológicas e moleculares4, que podem se originar independentemente ou derivar de um ancestral comum de células tumorais5. Estudos anteriores mostraram que a evolução do tumor difere entre os pacientes com base em fatores genéticos específicos que podem promover metástases ou confinar a linhagem celular à próstata5. Portanto, a caracterização molecular dos diferentes focos tumorais é crucial não apenas para fornecer um diagnóstico e prognóstico mais precisos, mas também para adaptar o tratamento eficaz e personalizado para o paciente.

Nesse contexto, a pesquisa biomédica e as abordagens multiômicas integrativas estão oferecendo oportunidades sem precedentes para classificar os cânceres em diferentes subtipos, identificar biomarcadores diagnósticos e prognósticos e descobrir marcadores relacionados à resposta ao tratamento. Além disso, essas abordagens contribuem para uma melhor compreensão da biologia dessa doença 6,7. Amostras biológicas, sejam tecidos ou biofluidos, podem ser analisadas usando várias plataformas multiômicas (genômica, transcriptômica, proteômica, metabolômica, etc.) para descobrir as características biológicas subjacentes à fisiopatologia do câncer, abordando assim as limitações atuais relacionadas à heterogeneidade genética e fenotípica6. No entanto, é importante considerar que a qualidade dos dados derivados de estudos ômicos depende da qualidade das amostras coletadas dos tumores, de sua caracterização precisa e do posterior processamento e armazenamento8.

Nesse contexto, a obtenção de tecido PC fresco para pesquisa apresenta um desafio metodológico devido à dificuldade de amostragem tumoral bem-sucedida9. Os métodos anteriores envolviam amostragem aleatória após prostatectomia radical, com resultados ruins10. No entanto, abordagens mais recentes incorporam protocolos direcionados baseados em dados de ressonância magnética (RM) e biópsia, resultando em maior eficácia na coleta de amostras de tumor11.

Por outro lado, a caracterização histopatológica das amostras antes de seu armazenamento sem alteração tecidual significativa também representa um desafio interessante. Consequentemente, em muitos casos, a determinação histopatológica das amostras é realizada após sua análise (por exemplo, análise metabolômica de RMN HR 1H)12. Essa prática acarreta gastos desnecessários, consumo de tempo e perda de um número significativo de amostras que acabam sendo excluídas da análise (por exemplo, amostras que, após análise histopatológica, acabam não sendo amostras de tumores). Em outros casos, a caracterização histopatológica das amostras é realizada antes de sua análise. De fato, alguns estudos anteriores tentaram padronizar métodos para fornecer amostras de pesquisa representativas de alta qualidade de espécimes de prostatectomia radical para genômica e metabolômica13,14. No entanto, a eficiência da amostragem é significativamente maior quando realizada a partir de cortes já confirmados histologicamente (88%) que rompem o tecido, em comparação com quando realizada a partir de cortes não confirmados (45%)1.

Aqui, uma nova metodologia é apresentada para superar essas limitações, visando obter amostras de PC frescas e bem caracterizadas antes do armazenamento no Biobanco. Este método foi desenvolvido através de esforços colaborativos entre diferentes serviços clínicos (Urologia, Patologia e Biobanco do Hospital La Fe). É importante destacar que os Biobancos desempenham um papel essencial na coleta, processamento, preservação e armazenamento de amostras biológicas, garantindo a alta qualidade das amostras e dados, bem como o cumprimento dos requisitos éticos e legais 8,15,16.

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Protocolo

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Este método foi desenvolvido através de esforços colaborativos envolvendo diferentes serviços clínicos (Urologia, Patologia e Biobanco do Hospital La Fe). O estudo foi conduzido em conformidade com as diretrizes institucionais, nacionais e internacionais para o bem-estar humano e recebeu a aprovação do Comitê de Ética em Pesquisa Biomédica do Instituto de Investigación Sanitaria Hospital Universitario y Politécnico La Fe (Valência, Espanha). Todas as amostras foram armazenadas no Biobanco Hospitalar La Fe (PT13/0010/0026). O procedimento geral é detalhado na Figura 1.

figure-protocol-1
Figura 1: Esquema geral do procedimento. Representação esquemática do procedimento passo a passo descrito na seção de protocolo. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

1. Direcionamento do tumor

  1. Antes da cirurgia, utilize a ressonância magnética multiparamétrica ou biparamétrica (mpMRI ou bpMRI)17,18 para localizar o tumor e mapear sua posição dentro da próstata. Combine as informações obtidas na ressonância magnética com os achados da ultrassonografia transretal ou do exame retal se este último produzir resultados discordantes.
  2. Para melhorar a localização do tumor, revise os resultados das biópsias transretais de próstata pré-operatórias guiadas por ultrassom e guiadas por ressonância magnética.
    NOTA: No procedimento diagnóstico do câncer de próstata, as biópsias são feitas diretamente da próstata por acesso transretal. Essas biópsias incluem amostragem sistemática da próstata (envolvendo cilindros distribuídos por toda a glândula) e cilindros diretamente direcionados a achados suspeitos na ressonância magnética. Para direcionar a recuperação dessas amostras, é usado o ultrassom transretal, que é combinado com os achados da ressonância magnética de maneira cognitiva ("fusão cognitiva") ou com "software real de fusão de ressonância magnética e ultrassom", quando disponível.

2. Prostatectomia radical e coleta de próstata

  1. Realizar uma prostatectomia radical robótica padronizada por meio de uma abordagem transperitoneal, seguindo os passos descritos por Huynh et al.19.
    1. Comece com o acesso abdominal, a insuflação e a colocação da porta da câmera (consulte a Tabela de Materiais). Coloque as cinco portas restantes sob visão direta. Ajuste o pneumoperitônio para 12 mm.
    2. Solte a bexiga incisando o peritônio e dissecando o espaço perirretal.
    3. Abra a fáscia pélvica de cada lado.
    4. Realize uma dissecção completa dos aspectos anterior e lateral da próstata e da bexiga.
    5. Realize a abertura do colo da bexiga, identifique e seccione a uretra proximal para ter acesso aos aspectos posteriores da próstata e da bexiga.
    6. Dissecar as vesículas seminais e o espaço do reto19.
    7. Dissecar os aspectos laterais da próstata, poupando os feixes neurovasculares.
    8. Garantir a hemostasia dos vasos no espaço retropúbico.
    9. Dissecar o ápice e seccionar a uretra distal.
    10. Complete a anastomose vesicouretral.
    11. Extrair a próstata e realizar o fechamento da incisão19.
  2. Colete a próstata fresca em um recipiente seco. É crucial não fixar ou embutir em parafina a amostra da amostra.
  3. Transporte a amostra cirúrgica fresca, que inclui toda a próstata, para o Biobanco para processamento da amostra.

3. Processamento da próstata e coleta de amostras

  1. Selecione zonas de próstata direcionadas para amostragem com base nas informações de localização do tumor recuperadas da mpMRI pré-operatória, resultados de biópsia pré-operatória e palpação direta da amostra de prostatectomia. Registre essas informações em um formulário que inclua dados de identificação do paciente, áreas da próstata finalmente amostradas e o número de amostras coletadas.
    NOTA: Quando os achados da ressonância magnética, os resultados da biópsia pré-operatória e a palpação direta da amostra de prostatectomia forem concordantes, direcione todas as amostras para esse ou esses locais (entre 4 e 6 cilindros). Se houver alguma discordância, aumente o número de cilindros e direcione separadamente todas as zonas que suspeitam ser afetadas por qualquer um desses métodos.
  2. Use uma agulha automática descartável (cirurgião) para recuperar amostras cilíndricas das áreas selecionadas (etapa 1.1). Em seguida, identifique (patologista) a zona externa do cilindro, prenda o cilindro com uma pinça de tecido, coloque-o em uma lâmina e marque a zona externa com tinta de tecido. Repita este processo com todos os cilindros retirados.
  3. Coloque os cilindros coletados horizontalmente em um sample disco porta-amostras (consulte Tabela de Materiais) cheio de meio de incorporação de criostato e transfira-os para a placa de resfriamento do micrótomo para corte.
  4. Uma vez colocado no cilindro, prenda o sample disco porta-amostras ao mandril de amostra e corte-o com movimentos cuidadosos da roda seguindo as próximas etapas:
    1. Use o composto de temperatura de corte ideal (composto OCT, consulte a Tabela de Materiais) para incorporar a amostra de tecido antes do corte congelado em um micrótomo-criostato.
    2. Em seguida, cortar a amostra com um micrótomo criostato a -25 °C. Recolha secções finas de tecido em forma de cilindro (10 μm) em lâminas de microscópio tratadas. Certifique-se de coletar apenas alguns mícrons de tecido para garantir uma quantidade adequada de tecido tumoral intacto para armazenamento no Biobanco.
    3. Reúna duas ou três seções finas por lâmina e pinte-as manualmente para controlar a coloração final. O olho do técnico garante uma coloração ideal e qualquer nova coloração necessária pode ser feita. Siga esses passos
      1. Fixe as lâminas em etanol a 96%, hidrate em água destilada e core com hematoxilina de Harris (ver Tabela de Materiais) por 1 min para corar os núcleos. Remova o excesso de hematoxilina enxaguando as lâminas com água destilada.
      2. Trate as lâminas com hidróxido de amônio a 30% para tornar a hematoxilina azul. Remova o excesso de solução com enxágues de água destilada.
      3. Lâminas de coloração com eosina (ver Tabela de Materiais) por 30 s.
      4. Em seguida, desidrate as lâminas com titulações crescentes de álcool, limpe com xileno (100%) e monte-as com DPX (uma mistura de distireno, plastificante e xileno, usado como meio de montagem de resina sintética que substitui xileno-bálsamo, consulte a Tabela de Materiais). Durante essas etapas, mergulhe as lâminas e remova-as do frasco da solução de Coplin.
      5. Por fim, coloque uma lamínula em cima do tecido corado e use um meio com índice de refração adequado (consulte a Tabela de Materiais) para visualização ao microscópio.

4. Caracterização da amostra

  1. Analisar a amostra ao microscópio óptico (patologista), discriminando as áreas de carcinoma e determinando o escore de Gleason do tumor. Documente todos esses dados e marque as zonas tumorais precisas nas lâminas.
  2. Durante esta etapa, rotule a lâmina com a localização precisa do tumor e seu respectivo Gleason Score20. Além disso, marque a localização do PIN (Neoplasia Intraepitelial Prostática

5. Micro-macro-dissecação e armazenamento de amostras

  1. Marque claramente diferentes componentes histológicos com marcadores distintos na lâmina (patologista) e correlacione-os diretamente com o tecido congelado no disco.
  2. Em seguida, usando uma lâmina cirúrgica, macromicro dissecar as áreas da amostra marcadas na lâmina dentro do disco OCT, dividindo-as em tecido tumoral, peritumoral, PIN e prostático normal.
  3. Quando o meio de incorporação começar a descongelar, manuseie o tecido com uma pinça e coloque-o em criotubos corretamente rotulados.
    NOTA: Armazene cuidadosamente cada fragmento dissecado dentro do tubo correspondente, seguindo o diagnóstico histológico das fatias criogênicas.
  4. Armazene os criotubos rotulados com amostras histológicas totalmente caracterizadas no Biobanco a -80 ° C para uso subsequente em estudos de pesquisa.
    NOTA: As etapas descritas nesta seção podem ser executadas por um técnico treinado sob a supervisão do patologista. A peça cirúrgica deve ser transportada para o Biobanco o mais rápido possível para evitar a degradação do tecido e do ácido nucleico. De acordo com os guias de referência, esforços devem ser feitos para evitar o tempo prolongado de isquemia (>30 min)21. As amostras podem ser mantidas no Biobanco indefinidamente, desde que os princípios de qualidade da amostra sejam mantidos.

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Resultados

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Os resultados revelam que essa técnica possibilitou a obtenção de material tumoral em 61% dos casos estudados (25 de 41 casos) (Tabela 1).

Tabela 1: Dados histopatológicos das amostras dos estudos. Resumo dos dados histopatológicos das amostras utilizadas no estudo. O cilindro de diagnóstico refere-se à amostra de biópsia de próstata obtida para fins de diagnóstico, enquanto o cilindro processado corresponde ao cilindro obtido da amostra de prostatectomia para...

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Discussão

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Em qualquer pesquisa, a obtenção de amostras de qualidade é um requisito essencial para reduzir vieses sistemáticos e obter resultados confiáveis22. Portanto, o controle de variáveis pré-analíticas como a temperatura na qual as amostras são processadas e armazenadas, o tempo decorrido desde a coleta até o armazenamento da amostra, o uso de materiais esterilizados ou os efeitos que a adição de conservantes ou outros aditivos pode ter nas amostras deve ser considerado em qualquer protocolo que envol...

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Divulgações

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Os autores declaram não haver conflito de interesses.

Agradecimentos

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A.L. reconhece um contrato de pós-doutorado "Margarita Salas" (número 21-076) e o MAM-T um contrato de pesquisa 'Maria Zambrano' (número MAZ/2021/03 UP2021-021). Ambos os contratos foram financiados pela União Europeia-Next Generation EU.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Pinça CadiereIntuitivePN1052082-US 10/2021Número da peça: 471049. 18 usos.
Lâminas convencionaisKnittel Glass2021Extremidade retificada/ fosca
Micrótomo criostatoThermo Fisher Scientific---Criostato CryoStar NX50
CryotubesGreiner Bio-One GmbHRef.: 122280.CRYO S. PP, com tampa de rosca, estéril. 
Sistema cirúrgico Da VinciIntuitivoPN1052082-US 10/2021Modelo XI
Instrumentos de dissecçãoBayer---Duas pinças e uma lâmina cirúrgica 
DPX Eukitt Medizin- und Labortechnik GmbH6.00.01.0001.06.01.01
EosinAgilent157252
Pinça bipolar fenestradaIntuitivePN1052082-US 10/2021Número da peça: 471205. 14 vidas.
Força bipolarIntuitivoPN1052082-US 10/2021Número da peça: 471405. 12 usos.
FreezersThermo ScientificMODELO 907. -80 º C
HematoxilinaAgilent157251
Lâminas de InmunohistoquímicaAgilent-DakoK802021-2
Chave de agulha grandeIntuitivoPN1052082-US 10/2021Número da peça: 471006. 15 usos.
Pinça bipolar MarylandIntuitivePN1052082-US 10/2021Número da peça: 471172. 14 usos.
MicroscópioOlympus---Olympus cx40
Lâminas de micrótomoPFM Medicala35
Tesoura curva monopolarIntuitivoPN1052082-US 10/2021Número da peça: 470179. 10 usos.
Composto OCTNEG-50LOTE.117340
PlusSpeed S Dispositivo de Biópsia de Uso Único com ponta chanfradaPeter Pflugbeil GmbH PSS-1825-S
Pinça ProGaspIntuitivaPN1052082-US 10/2021Número da peça: 471093. 18 usos.
Porta-amostras DiscDavidson Cryo Chuck. BradleyProducts30 mm 
Tinta de sedaPelikan2021Tinta 4001 preto brilhante (301168)
XylolQuimipurRef. 169

Referências

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