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Artigo de método

Preparo e Coloração por Imunofluorescência de Feixes e Células Monofibrais do Córtex e Núcleo do Cristalino Ocular

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DOI:

10.3791/65638

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9 de junho de 2023

 , 
1School of Optometry and Vision Science Program, Indiana University

Neste artigo

Resumo

Este protocolo descreve métodos para preparar células de fibras periféricas, maduras e nucleares do cristalino ocular para coloração por imunofluorescência para estudar interdigitações complexas célula-célula e a arquitetura da membrana.

Resumo

O cristalino é um órgão transparente e elipsoide na câmara anterior do olho que muda de forma para focalizar finamente a luz na retina para formar uma imagem clara. A maior parte desse tecido é composta por células fibrosas especializadas e diferenciadas que possuem secção transversal hexagonal e se estendem dos polos anterior para posterior do cristalino. Essas células longas e magras são fortemente opostas às células vizinhas e têm interdigitações complexas ao longo do comprimento da célula. As estruturas intertravadas especializadas são necessárias para as propriedades biomecânicas normais do cristalino e têm sido extensivamente descritas usando técnicas de microscopia eletrônica. Este protocolo demonstra o primeiro método para preservar e imunomanchar singular, bem como feixes de células de fibra de lente de camundongo para permitir a localização detalhada de proteínas dentro dessas células de forma complexa. Os dados representativos mostram a coloração das células periféricas, diferenciadoras, maduras e de fibras nucleares em todas as regiões do cristalino. Este método pode ser potencialmente utilizado em células de fibras isoladas de lentes de outras espécies.

Introdução

O cristalino é um tecido límpido e ovoide, na câmara anterior do olho, composto por dois tipos celulares, células epiteliais efibras1 (Figura 1). Existe uma monocamada de células epiteliais que recobre o hemisfério anterior do cristalino. As células fibrosas são diferenciadas das células epiteliais e compõem a maior parte do cristalino. As células fibrosas altamente especializadas sofrem uma programação de alongamento, diferenciação e maturação, marcada por distintas mudanças na morfologia da membrana celular da periferia do cristalino para o centro do cristalino2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12 , também conhecido como núcleo do cristalino. A função do cristalino de focalizar a luz vinda de várias distâncias para a retina depende de suas propriedades biomecânicas, incluindo rigidez e elasticidade 13,14,15,16,17,18,19. As complexas interdigitações das fibras do cristalino foram hipotetizadas 20,21 e recentemente mostraram-se importantes para a rigidez do cristalino 22,23.

figure-introduction-1
Figura 1: Diagramas de anatomia do cristalino e imagens representativas de microscopia eletrônica de varredura (MEV) das fibras do cristalino. O desenho mostra uma visão longitudinal (anterior a posterior de cima para baixo) da monocamada anterior de células epiteliais (sombreada em azul claro) e uma massa volumosa de células de fibra do cristalino (branco). O centro da lente (sombreado em rosa) é conhecido como núcleo e compreende células de fibra altamente compactadas. À direita, um desenho animado de seção transversal revela a forma de célula hexagonal alongada das fibras da lente que são embaladas em um padrão de favo de mel. As células de fibra têm dois lados largos e quatro lados curtos. Imagens SEM representativas ao longo da parte inferior mostram as interdigitações complexas da membrana entre as células de fibra da lente em diferentes profundidades da lente. A partir da direita, as fibras de lente recém-formadas na periferia da lente têm pequenas saliências ao longo dos lados curtos e bolas e soquetes ao longo do lado largo (caixas vermelhas). Durante a maturação, as fibras do cristalino desenvolvem grandes domínios de remo que são decorados por pequenas saliências ao longo dos lados curtos (caixas azuis). As células de fibras maduras possuem grandes domínios de pás ilustrados por pequenas saliências. Esses domínios de intertravamento são importantes para as propriedades biomecânicas das lentes. As células de fibra no núcleo do cristalino têm menos pequenas saliências ao longo de seus lados curtos e têm interdigitações complexas de língua e sulco (caixas roxas). Os lados largos da célula exibem uma morfologia de membrana globular. O desenho foi modificado de22,32 e não desenhado em escala. Barra de escala = 3 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

A lente cresce pela adição de conchas de novas células de fibra sobrepostas às gerações anteriores de fibras24,25. As células de fibra têm uma forma de seção transversal hexagonal alongada com dois lados largos e quatro lados curtos. Essas células se estendem do polo anterior ao posterior do cristalino e, dependendo da espécie, as fibras do cristalino podem ter vários milímetros de comprimento. Para suportar a estrutura dessas células alongadas e magras, interdigitações especializadas ao longo dos lados largos e curtos criam estruturas interligadas para manter a forma da lente e as propriedades biomecânicas. Alterações na forma da membrana celular durante a diferenciação e maturação das células fibrosas têm sido extensivamente documentadas por estudos de microscopia eletrônica (ME)2,3,4,5,6,7,8,9,10,20,26,27,28,29 . As células de fibra recém-formadas têm bolas e soquetes ao longo de seus lados largos com saliências muito pequenas ao longo de seus lados curtos, enquanto as fibras maduras têm saliências e pás interligadas ao longo de seus lados curtos. As fibras nucleares exibem interdigitações de língua e sulco e morfologia da membrana globular. Pouco se sabe sobre as proteínas necessárias para essas complexas membranas interligadas. Estudos prévios sobre a localização de proteínas em células fibrosas basearam-se em cortes de tecido do cristalino, que não permitem uma visualização clara da arquitetura celular complexa.

Este trabalho criou e aperfeiçoou um novo método para fixar células de fibras simples e em feixes de lentes para preservar a morfologia complexa e permitir a imunomarcação de proteínas na membrana celular e dentro do citoplasma. Este método preserva fielmente a arquitetura da membrana celular, comparável aos dados de estudos de EM, e permite a coloração com anticorpos primários para proteínas específicas. Temos previamente imunomarcadas fibras corticais do cristalino em fase de diferenciação ematuração22,23. Neste protocolo, há também um novo método para corar células de fibra do núcleo do cristalino. Este protocolo abre as portas para a compreensão dos mecanismos de formação e mudanças nas interdigitações da membrana durante a maturação das células fibrosas e compactação do núcleo do cristalino.

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Protocolo

Os camundongos foram cuidados com base em um protocolo animal aprovado pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais da Indiana University Bloomington. Os camundongos utilizados para gerar dados representativos foram animais controle (selvagem) no fundo C57BL6/J, fêmeas e com 8-12 semanas de idade. Camundongos machos e fêmeas podem ser usados para este experimento, já que é muito improvável que o sexo dos camundongos afete o resultado do experimento.

1. Dissecção e descapsulação do cristalino

  1. Eutanasiar camundongos seguindo o "Guia para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório" do National Institutes of Health, bem como protocolos de uso de animais aprovados pela instituição.
    NOTA: Para o presente estudo, os ratos foram eutanasiados por overdose de CO2 seguida de deslocamento cervical de acordo com um protocolo animal aprovado (Universidade de Indiana).
  2. Enuclear os olhos dos ratos usando pinças curvas, deprimindo o tecido ao redor dos olhos com um lado da pinça para deslocar o olho para fora da cavidade. Em seguida, feche a pinça embaixo do olho e levante para remover o olho do encaixe. Transfira os olhos para solução salina tamponada com fosfato (PBS) fresca em uma bandeja de dissecção.
  3. Corte o nervo óptico com uma tesoura ultrafina o mais próximo possível do globo ocular. Insira cuidadosamente pinças retas de ponta fina no globo ocular através da saída do nervo óptico na parte posterior do olho.
  4. Introduza cuidadosamente a tesoura no mesmo local que a pinça no passo 1.3 e comece a cortar uma incisão posterior em direção à junção córnea-escleral.
    NOTA: As lentes de roedores ocupam ~30% dos olhos. Danos acidentais ocorrerão se a pinça ou tesoura for inserida muito profundamente no olho.
  5. Continue cortando ao longo da junção córnea-escleral até que pelo menos metade da junção tenha sido separada.
  6. Use uma pinça para empurrar suavemente a córnea para que a lente possa sair pela incisão feita com os passos 1.4 e 1.5.
  7. Remova cuidadosamente qualquer pedaço grande de tecido da lente usando pinças retas de ponta fina. Inspecione a lente para encontrar a região equatorial.
  8. Perfure superficialmente a lente usando pinças retas de ponta fina e, em seguida, remova a cápsula da lente. A massa de células de fibra do cristalino permanecerá intacta, e a monocamada epitelial do cristalino permanecerá presa à cápsula do cristalino. Descarte a cápsula da lente.

2. Coloração da célula de fibra única da lente

  1. Transferir a massa celular de fibra do cristalino para uma placa de poço com 500 μL de solução de paraformaldeído a 1% (PFA; em 1x PBS) recém-fabricada e incubar as amostras a 4 °C durante a noite com nutação suave (Figura 2A).
    NOTA: Os volumes para as soluções fornecidas são otimizados para placas de 48 poços. Se forem utilizados tubos ou placas de poço de outro tamanho, ajuste os volumes das soluções em conformidade. As soluções de fixação, bloqueio e lavagem (1x PTX, 0,1% Triton X-100 em 1x PBS) foram feitas com 10x PBS e água bidestilada (ddH2O) até uma concentração final de 1x PBS.
  2. Transfira as células de fibra da lente para uma placa de 60 mm com PFA a 1%. Utilizar bisturi afiado para dividir a bola de células fibrosas ao meio ao longo de seu eixo anteroposterior (Figura 2B). Corte as metades ao meio novamente ao longo do mesmo eixo para produzir quartos.
    NOTA: O eixo anteroposterior é facilmente reconhecido pela direção das células fibrosas na massa tecidual.
  3. Use uma pinça reta para remover a região do núcleo dos quartos das células de fibra do cristalino (Figura 2C).
    NOTA: A região do núcleo da lente é rígida nas lentes de roedores, e o centro da lente se separará das fibras corticais mais macias facilmente.
  4. Pós-fixar os quartos da região do córtex do cristalino em 200 μL de PFA a 1% por 15 min à temperatura ambiente (TR) com agitação suave (300 rpm em um agitador de placa).
  5. Lave os quartos de tecido duas vezes em 750 μL de 1x PBS por 5 min cada com agitação suave em RT.
  6. Bloquear as amostras usando 200 μL de solução de bloqueio (5% de soro, 0,3% Triton X-100, 1x PBS) por 1 h no TR com agitação suave.
    NOTA: Para os dados representativos neste protocolo, as amostras não foram coradas com anticorpos primários ou secundários. Após a etapa de blocagem, as amostras foram incubadas com aglutinina de gérmen de trigo (WGA; 1:100) e faloidina (1:100) (ver Tabela de Materiais) por 3 h em TR com agitação suave e proteção contra a luz. A coloração primária de anticorpos foi demonstrada em publicações anteriores22,23.
  7. Incubar com 100 μL de solução de anticorpos primários durante a noite a 4 °C com agitação suave.
    NOTA: Os anticorpos são diluídos em solução de bloqueio. Em comparação com lâminas com cortes de tecido, há mais células neste tipo de preparação. As concentrações primárias de anticorpos devem ser aumentadas para fornecer amplos anticorpos para corar mais células. Recomenda-se dobrar a concentração de anticorpos em relação ao que é usado em cortes de tecido. O mesmo se aplica aos anticorpos secundários.
  8. Lave os quartos de tecido três vezes com 1x PTX (0,1% Triton X-100, 1x PBS) por 5 min cada em RT com agitação suave.
  9. Incubar as células de fibra com 100 μL de solução secundária de anticorpo/corante durante 3 h em RT com agitação suave. Proteger as amostras da luz durante esta e as etapas subsequentes.
    NOTA: WGA, faloidina e outros corantes fluorescentes podem ser adicionados à solução de anticorpos secundários para marcação simultânea da membrana celular, citoesqueleto ou outras organelas, ao mesmo tempo em que marcam o anticorpo primário.
  10. Lave as células de fibra quatro vezes com 1x PTX por 5 min cada em RT com agitação suave.
  11. Adicione uma gota ou 50 μL de mídia de montagem em uma lâmina de microscópio com carga adicional antes de transferir os quartos de tecido para a lâmina.
  12. Use pinças para separar suavemente as células de fibra umas das outras e tente limitar a sobreposição dos feixes celulares.
  13. Aplique suavemente uma tampa #1.5 sobre a amostra na mídia de montagem. O meio de montagem deve se espalhar até a borda da tampa; Se isso não ocorrer, adicione alguns suportes de montagem adicionais à borda da tampa. Aspirar qualquer excesso de mídia de montagem ao redor da borda da lamínula e use esmalte para selar as bordas da lamínula na corrediça.
    NOTA: Qualquer tipo de meio de montagem formulado para microscopia confocal pode ser usado para esses experimentos.

3. Coloração da célula de fibra única do núcleo do cristalino

  1. Complete a dissecação descrita na seção 1.
  2. Remova mecanicamente as fibras corticais da bola das células de fibra do cristalino, deixando o núcleo do cristalino, transferindo suavemente a massa celular de fibra para as pontas dos dedos molhadas e enluvadas e rolando suavemente a massa de tecido.
    NOTA: Em lentes de camundongo, rolar a bola de células de fibra do cristalino entre as pontas dos dedos enluvados é um método eficaz para a remoção das células de fibras corticais do núcleo duro do cristalino28,30. Para lentes onde este método mecânico não é eficaz, dissecção cuidadosa ou um método de vórtice29 pode ser usado para remover as células de fibra cortical.
  3. Transfira o núcleo da lente para uma solução de PFA a 1% recém-fabricada em uma placa de poço e incube durante a noite a 4 °C com agitação suave.
  4. Transfira a amostra para uma placa de 60 mm com PFA a 1% e use um bisturi afiado para dividir o núcleo do cristalino ao longo do eixo anteroposterior. Reduza as amostras de tecido pela metade novamente para produzir quartos de núcleo.
  5. Siga o processo descrito nas etapas 2.4-2.13 para imunomarcação e montagem da amostra.

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Figura 2: Resumo gráfico detalhando a preparação e imunomarcação das células de fibras do cristalino . (A) Esta placa de 48 poços foi codificada por cor por coluna para demonstrar uma configuração da placa de amostra para os métodos descritos, permitindo a fácil transferência de amostras entre as várias etapas de imunomarcação por manuseio suave usando pinças. Embora os dados representativos para este protocolo não sejam incubados com um anticorpo primário, o diagrama inclui uma coluna para incubação de anticorpos primários, e os poços para lavagem podem ser reutilizados após a remoção dos tampões de lavagem usados por aspiração. (B) Após a fixação da massa celular fibrosa do cristalino, o tecido é dividido ao longo do eixo anteroposterior (linhas tracejadas vermelhas) para preservar a estrutura original das células. Uma vez que a massa de tecido tenha sido reduzida pela metade, as amostras são giradas e as metades divididas em quartos ao longo do eixo anteroposterior (linhas tracejadas vermelhas). (C) A remoção da região do núcleo do cristalino (em rosa) é feita facilmente usando uma pinça para extrair o tecido central denso das células de fibras corticais (em azul). Diagramas de desenhos animados foram parcialmente criados usando BioRender.com e não desenhados em escala. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Resultados

As células de fibras do cristalino são preparadas a partir do córtex do cristalino (fibras diferenciadoras e fibras maduras) e do núcleo, e as células são coradas com faloidina para F-actina e WGA para a membrana celular. Uma mistura de feixes de células ou fibras de lente única (Figura 3) são observadas e imageadas. A partir do córtex do cristalino, encontram-se dois tipos de células (Figura 3A). As células de fibra diferenciadoras na periferia do cristalino sã...

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Discussão

Este protocolo demonstrou os métodos de fixação, preservação e imunomarcação que preservam fielmente a morfologia da membrana 3D de feixes ou células de fibras do cristalino singular de várias profundidades no cristalino. As fibras coradas do cristalino são comparadas com preparações de MEV que têm sido usadas há muito tempo para estudar a morfologia das células das fibras do cristalino. Os resultados mostram estruturas de membrana comparáveis entre as duas preparações. A ME continua sendo o padrão-ouro para o estudo da ...

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Divulgações

Os autores não têm nada a revelar.

Agradecimentos

Este trabalho foi financiado pelo processo R01 EY032056 (para CC) do Instituto Nacional de Olhos. Os autores agradecem à Dra. Theresa Fassel e Kimberly Vanderpool do Scripps Research Core Microscopy Facility por sua assistência com as imagens do microscópio eletrônico.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
100% Triton X-100FisherScientificBP151-500
60mm plateFisherScientificFB0875713A
16% paraformaldehydeElectron Microscopy Sciences15710
10X phosphate buffered salineThermoFisher70011-044
1X phosphate buffered salineThermoFisher14190136
48-well plateCytoOneCC7672-7548
Cover slips (22 x 40 mm)FisherScientific12-553-467
Curved tweezersWorld Precision Instruments501981
Dissection microscopeCarl ZeissStereo Discovery V8
Fine tip straight tweezersElectron Microscopy Sciences72707-01
Fisherbrand Superfrost Plus Microscope SlidesFisherScientific12-550-15
LSM 800 confocal microscope with Airyscan (63X) and Zen 3.5 SoftwareCarl Zeiss
Nail polish
Normal donkey serumJackson ImmunoResearch017-000-121
Phalloidin (rhodamine)ThermoFisherR415
Primary antibody
Scalpel Feather Disposable, steril, No. 11VWR76241-186
Secondary antibody
Straight forcepsWorld Precision Instruments11252-40
Thermo Scientific Nunc MicroWell MiniTrays (dissection tray)FisherScientific12-565-154
Ultra-fine scissorsWorld Precision Instruments501778
VECTASHIELD Antifade Mounting Medium with DAPIVector LaboratoriesH-1200
Wheat germ agglutinin (fluorescein)Vector LaboratoriesFL-1021-5

Referências

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