PCR de bloqueio de tipo selvagem combinado com sequenciamento de Sanger para detecção de mutação somática de baixa frequência

A doença residual mínima (MRD) é o pequeno número de células cancerígenas que ainda estão presentes no corpo após o tratamento. Devido ao seu pequeno número, eles não levam a nenhum sinal ou sintoma físico. Eles geralmente não são detectados por métodos tradicionais, como visualização microscópica e / ou rastreamento de proteínas séricas anormais no sangue. Um resultado de teste positivo para DRM indica a presença de células doentes residuais. Um resultado negativo significa que as células doentes residuais estão ausentes. Após o tratamento do câncer, as células cancerígenas restantes no corpo podem se tornar ativas e começar a se multiplicar, causando uma recaída da doença. A detecção de DRM é indicativa de que o tratamento não foi completamente eficaz ou que o tratamento foi incompleto. Outra razão para os resultados positivos para MRD após o tratamento pode ser que nem todas as células cancerígenas responderam à terapia ou porque as células cancerígenas se tornaram resistentes aos medicamentos usados¹.

O linfoma angioimunoblástico de células T (AITL) é um subtipo de linfoma periférico de células T (PTCL) derivado de células T foliculares auxiliares²; é o tipo mais comum de linfoma de células T, representando cerca de 15% a 20% do PTCL³. É um grupo de malignidades relacionadas que afetam o sistema linfático. A célula de origem é a célula T auxiliar folicular. A classificação da OMS de 2016 o categoriza como Linfoma Angioimunoblástico de Células T⁴. Em 2022, a OMS o renomeou como linfoma nodal de células auxiliares foliculares T, tipo angioimunoblástico (nTFHL-AI), juntamente com linfoma nodal de células auxiliares foliculares T, tipo folicular (nTFHL-F) e linfoma nodal de células auxiliares foliculares T, sem outra especificação (nTFHL-NOS), coletivamente referido como linfoma de células T auxiliares foliculares nodulares (nTFHL). Isso foi feito para identificar suas importantes características clínicas e imunofenotípicas e assinaturas e mutantes semelhantes de expressão gênica do T folicular helper (TFH). Geneticamente, o nTFHL-AI é caracterizado pela aquisição progressiva de mutações somáticas em células-tronco hematopoiéticas precoces por meio de mutações TET2 e DNMT3A, enquanto mutações RHOA e IDH2 também estão presentes em células tumorais TFH⁵. Vários estudos mostraram que a mutação RHOA G17V ocorre em 50% a 80% dos pacientes com AITL 6,7,8,9. A proteína RHOA codificada pelo gene RHOA é ativada pela ligação do trifosfato de guanosina (GTP) e inativada pela ligação do difosfato de guanosina (GDP). Quando ativado, ele pode se ligar a uma variedade de proteínas efetoras e regular uma variedade de processos biológicos. Fisiologicamente, o RHOA medeia a migração e a polaridade das células T, desempenha um papel no desenvolvimento dos timócitos e medeia a ativação da sinalização do receptor pré-T (pré-TCR)¹⁰. A mutação RHOA G17V é uma mutação de perda de função que desempenha um papel determinante na patogênese do linfoma¹¹. A detecção de sua mutação de baixa frequência é útil para o monitoramento de DRM de AITL.

O sequenciamento de Sanger tem sido usado há mais de 40 anos como padrão-ouro para a detecção de mutações conhecidas e desconhecidas. No entanto, seu limite de detecção é de apenas 5%-20%, o que limita sua aplicação para detecção de mutações de baixa frequência^12,13. No sequenciamento de Sanger, a sensibilidade de detecção pode ser reduzida para 0,1% substituindo a PCR tradicional por BDA, uma tecnologia de bloqueio selvagem¹⁴. A tecnologia BDA adiciona principalmente um primer incompatível complementar ao tipo mutante ao projetar primers convencionais para competir com o tipo selvagem, de modo a atingir o objetivo de amplificar o tipo mutante. A chave para o design do primer é o primer de incompatibilidade e a modificação do terminal. Ao mesmo tempo, de acordo com o princípio estrutural do DNA, a diferença entre a energia livre de Gibbs dos dois primers está entre 0,8 kcal / mol e 5 kcal / mol. Outro passo fundamental nessa técnica é suprimir a amplificação do tipo selvagem, ajustando a proporção de primers do tipo selvagem e do tipo bloqueador^14,15.

Atualmente, as técnicas comuns de detecção de mutação somática de baixa frequência incluem PCR alelo-específico baseado em PCR (reação em cadeia da polimerase alelo-específica, ASPCR), PCR do sistema de mutação refratária à amplificação (amplification-refractory mutation system-PCR, ARMS-PCR) usado para genotipagem de SNP com a ajuda de primers refratários. O design de primers para os alelos mutante e normal permite a amplificação seletiva e a PCR digital (Droplet Digital PCR, ddPCR), um método para realizar PCR digital baseado na tecnologia de gotículas de emulsão água-óleo¹⁶. Uma amostra é fracionada em 20.000 gotículas e, para cada gota, uma amplificação por PCR das moléculas modelo é feita com uma sensibilidade de 1 x ^10-5; a amplificação de deslocamento do bloqueador (BDA) também é um método de enriquecimento de alelos raros baseado em PCR usado para detecção e quantificação precisas de SNVs e indels até 0,01% VAF em um ambiente altamente multiplexado; A tecnologia de ácido nucleico bloqueado (ácido nucleico bloqueado não extensível, LNA) é uma classe de análogos de RNA de alta afinidade em que o anel de ribose é bloqueado na conformação ideal para a ligação de Watson-Crick; sondas específicas de hotspot (Hot-Spot-Specific Probe, HSSP), sobrepõem-se à sequência de primer alvo, incluem uma única mutação e são modificadas com um espaçador C3 na extremidade C3^' para evitar amplificação por qPCR 14,16,17,18. Quando existe uma mutação na sequência, o HSSP se liga competitivamente à mutação alvo e impede que o primer se ligue à sequência mutante alvo, o que interrompe a amplificação da sequência; NGS (sequenciamento de próxima geração) - sequenciamento de alto rendimento baseado em imunoglobulina (igHTS) Perfil personalizado de câncer por sequenciamento profundo (CAAP-seq), é um método baseado em sequenciamento de próxima geração usado para quantificar o DNA circulante em células cancerígenas (a sensibilidade é 1 x ^10-4); etc. Entre eles, a maioria dos métodos é baseada em PCR e só pode detectar um pequeno número de sítios de mutação, e os métodos baseados em NGS podem detectar múltiplos sítios, mas o custo é alto e o processo é complicado 14,16,17,18. Houve relatos sobre a detecção de mutações de baixa frequência RHOA G17V com base na qPCR, mas o limite de detecção pode chegar a apenas cerca de 2%¹⁹. Não há relato sobre a detecção da mutação de baixa frequência RHOA G17V com base no sequenciamento de Sanger. Aqui, demonstramos o aumento da sensibilidade alcançado pelo BDA, um PCR em bloco do tipo selvagem combinado com o sequenciamento de Sanger, para otimizar a detecção de mutações somáticas de baixa frequência RHOA G17V, e a sensibilidade de detecção pode chegar a 0,5%. Dados adicionais para IDH2 e JAK1 também são fornecidos.

Este artigo fornece um protocolo detalhado do esquema de detecção de baixa frequência RHOA G17V por sequenciamento Sanger e fornece uma referência para o desenvolvimento de mais detecção de mutação de baixa frequência com base na plataforma de sequenciamento Sanger. Este método pode ser usado para detectar e monitorar possíveis mutações de resistência a medicamentos e resíduos mínimos em tumores.

Este estudo foi aprovado pelo comitê de revisão de ética médica do Hospital Central de Yongzhou (número de aprovação: 2024022601). Os participantes forneceram consentimento informado.

1. Projeto da primeira demão

1. Projeto de primer convencional: Projete primers de acordo com as regras de design de primer relatadas²⁰, design de primer por NCBI Primer-BLAST (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/index.cgi?LINK_LOC=BlastHome). Para o local de mutação do RHOA G17V, todas as sequências de referência para o projeto de primers convencionais são a sequência de bases mutada. Certifique-se de que os primers de amplificação reversa projetados contenham a sequência do local de mutação e que a temperatura de recozimento dos primers seja de cerca de 60 °C.
2. Projeto de primer BDA
   1. Projete o primer de bloqueio selvagem com um comprimento de cerca de 20-30 pares de bases (pb), contendo 2-4 bases modificadas e as bases modificadas compostas por A e T. Certifique-se de que o primer de bloqueio tenha 6-14 pb sobreposto ao primer de amplificação de mutação, usado para competir com o primer de amplificação de mutação.
   2. Projete o primer com uma temperatura de recozimento para os primers de amplificação mutante projetados finais e primers de bloqueio selvagem ajustados em cerca de 60 ° C, e a diferença na energia livre de Gibbs entre 0,8-5 kcal / mol. Para regras de cálculo detalhadas, consulte a literatura¹⁵.
      NOTA: Quando os primers projetados não atendem às condições acima, as bases podem ser adicionadas ou subtraídas manualmente para ajuste. A lista final de primers elaborados é mostrada na Tabela 1 e na Tabela 2.

2. Preparação de amostras e extração de DNA

NOTA: As amostras de verificação experimental são todas provenientes de amostras de sangue periférico, medula óssea ou tumor sólido de pacientes com linfoma humano. Houve 10 amostras positivas: 3 eram amostras de tumores sólidos, 4 eram amostras de medula óssea e 3 eram amostras de sangue periférico. Existem 30 amostras negativas de pessoas saudáveis.

1. Extração de amostras de medula óssea e sangue periférico
   1. Adicionar 400 μL de amostra de medula óssea ou sangue periférico e reagentes nos tubos correspondentes, de acordo com os requisitos, e extrair de acordo com o procedimento de extração do fabricante.
   2. Prepare novos tubos de amostra e tubos de microcentrífuga de 1,5 mL. Numere os tubos de amostra de 1 a 24. Marque as tampas dos tubos de 1,5 mL com o nome da amostra e a data de extração na ordem dos nomes nos tubos de coleta de sangue correspondentes. Marque 1-24 na lateral do tubo da microcentrífuga para verificação de correspondência individual.
   3. Adicione 40 μL de solução de proteinase K ao tubo de amostra e adicione 400 μL de amostra de sangue total (para volumes inferiores a 400 μL, encha até 400 μL com PBS).
   4. Coloque o sample tubo (1-24), a ponta da pipeta (incluindo a tampa da pipeta) e o tubo de coleta nas posições correspondentes. Extraia o DNA de acordo com o procedimento do fabricante.
2. Extração de amostras de embebidas em parafina fixada em formalina (FFPE)
   1. Colocar as amostras e os reagentes nos tubos correspondentes de acordo com os requisitos e extrair de acordo com o procedimento de extração do fabricante.
   2. Adicione 1,1 mL de tampão de armazenamento de proteinase K (solução PK) ao pó seco de proteinase K, vórtice e misture bem para obter uma solução de proteinase K com concentração de 10 mg / mL. Conservar a -20 °C.
   3. Retire a solução de proteinase K e derreta-a completamente à temperatura ambiente. Ligue o termostato seco e ajuste a temperatura em 55 °C.
   4. Pegue um tubo de microcentrífuga de 1,5 mL e escreva o nome da amostra nele. Pegue menos de 30 mg de tecido e coloque-o no tubo da microcentrífuga. Em seguida, adicione 500 μL de tampão de desparafina e 20 μL de solução de proteinase K ao tubo.
   5. Após a mistura em vórtice por pelo menos 10 s, coloque o tubo da microcentrífuga em um termostato seco e mantenha-o aquecido a 55 ° C por 90 min.
   6. Certifique-se de que a coluna de centrifugação se encaixa no tubo do filtro. Após a conclusão da incubação, transfira a amostra, incluindo líquido e tecido, para a coluna de centrifugação. Centrifugue a 16.500 x g por 5 min para centrifugar todo o líquido no tubo do filtro.
   7. Pegue 1 tubo de amostra (sem tampa) incluído com o kit e escreva o nome da amostra nele. Transfira o líquido do tubo filtrante de 400 μL para o tubo de amostra.
   8. Após a conclusão do pré-tratamento e preparação da amostra, coloque os consumíveis e reagentes correspondentes nas posições correspondentes e realize a extração de DNA de acordo com as instruções do fabricante.
3. Controle de qualidade do DNA
   1. Meça a concentração e a pureza do DNA extraído e certifique-se de que a concentração de DNA seja ≥ 25 ng/μL. Registre a concentração de DNA de cada amostra e use imediatamente para detecção subsequente ou congele a -20 °C.
      NOTA: Os valores OD260 / OD280 são geralmente usados para testar a pureza das amostras de DNA. O valor normal de OD260 / OD280 é de cerca de 1,7-1,9, indicando que a pureza do DNA é boa; se o valor OD260/OD280 for ≤1,7, indica que pode haver contaminação proteica; se o valor OD260/OD280 for ≥2,0, isso indica que pode haver contaminação por RNA ou que o DNA foi degradado.

3. Amplificação de PCR

1. Preparação de primers
   1. Preparação da solução-mãe de primer
      1. Retire o pó seco do primer e centrifugue a 5400-8400 x g por 2-3 min. Verifique o valor nmol do primer e abra lentamente a tampa. Usando uma pipeta com o volume correspondente de água bidestilada (ddH₂O), que é 10x do valor nM, adicione-a lentamente ao longo da parede do tubo de primer.
      2. Prepare primers a 0,1 nM / μL ou 100 μM solução estoque (por exemplo, o valor nM é 21,1; correspondentemente, a água a ser adicionada é 211 μL). Misture bem o vórtice e, em seguida, centrifugue brevemente para garantir que a solução chegue ao fundo de cada poço. Escreva o nome do primer, os dados de configuração e a pessoa de configuração na tampa do tubo. Coloque-o no local de armazenamento da solução de estoque correspondente.
   2. Preparação da solução de trabalho do primer
      1. Pipetar 5 μL de primer direto, 5 μL de primer reverso, 50 μL de solução estoque de primer de tipo selvagem e 40 μL de ddH₂O em um tubo de microcentrífuga limpo. Pipete repetidamente 2x-3x, vórtice para misturar e gire instantaneamente.
      2. Escreva o nome do primer, a data de configuração e a pessoa que o configurou na tampa do tubo e coloque-o no local de armazenamento correspondente da solução de trabalho.
2. Procedimento de amplificação por PCR
   1. Para cada reação, adicione 5 μL de mistura mestre de enzimas de amplificação por PCR, 1 μL de solução de trabalho de primer e 1 μL de molde de DNA (a quantidade de entrada do molde precisa atingir 400 ng, se a concentração de DNA não for suficiente; aumente o volume de DNA e reduza o volume de ddH₂O adicionado) e 3 μL de ddH₂O. Vortex para misturar e girar instantaneamente.
   2. Coloque o tubo de reação de PCR no instrumento de PCR predefinido para amplificação de PCR. Defina o programa do ciclo térmico do instrumento de PCR da seguinte forma e execute:
      95 °C por 3 min; 20 ciclos de 95 °C por 30 s, 68 °C por 15 s (diminuir 0,5 °C por ciclo), 72 °C por 1 min; 16 ciclos de 95 °C por 30 s, 58 °C por 15 s, 72 °C por 1 min; e 72 °C por 10 min.
3. Realize eletroforese em gel no produto de PCR com agarose a 2% para verificar se o fragmento alvo é amplificado.
4. Purificação de produtos PCR
   1. Leve purificase I e purificase II à temperatura ambiente e gire instantaneamente. Prepare a reação de purificação do produto de PCR da seguinte forma: 1 μL de purificado I, 0,5 μL de purificado II, 3 μL de produto de PCR e 3,5 μL de ddH₂O.
   2. Coloque o tubo de reação de PCR no instrumento de PCR predefinido para amplificação de PCR. Defina o programa do ciclo térmico do instrumento de PCR da seguinte forma e execute a máquina:
      37 °C por 30 min, 95 °C por 15 min.

4. Sequenciamento de produtos de PCR após purificação

1. Seqüenciamento
   1. Leve a mistura mestre de enzimas de amplificação de sequenciamento, tampão e ddH₂O à temperatura ambiente. Depois que o reagente se liquefizer, gire instantaneamente.
   2. Prepare o sistema de reação de sequenciamento da seguinte forma: 1,8 μL de tampão de sequenciamento, 0,4 μL de master mix de enzimas de amplificação de sequenciamento, 1 μL de primer de sequenciamento, 0,8 μL de produto de PCR purificado e 6 μL de ddH₂O.
   3. Coloque o tubo de reação de PCR no instrumento de PCR predefinido para amplificação de PCR. Defina o programa do ciclo térmico do instrumento de PCR da seguinte forma e execute: 96 °C por 3 min; 28 ciclos de 96 °C por 25 s, 56 °C por 15 s, 60 °C por 4 min.
   4. Após o término da reação de sequenciamento, remova o produto do instrumento de PCR. Armazene os produtos de reação na geladeira, protegidos da luz.
2. Purificação de produtos de sequenciamento
   1. Vortex as contas magnéticas completamente. Adicione 10 μL de esferas magnéticas e 40 μL de álcool a 80% à placa de 96 poços e sele a placa com um filme.
   2. Coloque a placa de 96 poços com grânulos magnéticos e álcool no agitador de vórtice por 10 s para suspender e misturar totalmente os grânulos magnéticos (observando se há precipitação de grânulos magnéticos no fundo e tome cuidado para não deixar o líquido entrar no filme de vedação). Coloque-o em um oscilador horizontal e amarre-o com um elástico para vibrar por 3-5 min (marcha máxima).
   3. Depois de oscilar, coloque a placa PCR no suporte magnético, preste atenção em pressioná-la firmemente. Mantenha o suporte a 4 °C para adsorção estática por 3 min e, depois que as esferas magnéticas estiverem todas adsorvidas na parede, remova o filme de vedação e despeje o líquido residual.
   4. Adicione 40 μL de álcool a 80% à placa de PCR, enxágue as esferas e despeje o líquido residual. Coloque a placa em papel absorvente e bata suavemente (não deixe a placa PCR se separar do disco). Repita 1x.
   5. Coloque o papel absorvente de cabeça para baixo junto com a placa magnética na centrífuga a 120 x g para uma centrifugação rápida.
   6. Coloque a placa PCR contendo as esferas magnéticas após remover o álcool no forno a 60 °C por 3-5 min. Seque as contas completamente.
      NOTA: Se não houver forno, coloque o prato em temperatura ambiente por 10 min.
   7. Adicione 40 μL de água pura após a secagem. Coloque o filme de vedação na placa e agite-o em um agitador de vórtice por 3-5 s. Coloque o prato em uma coqueteleira horizontal, amarre-o firmemente e agite-o por 3-5 min para dissolver o produto de sequenciamento purificado.
   8. Gire o produto de sequenciamento dissolvido a 180 x g e use o produto para análise genômica usando eletroforese capilar²¹ (observe que o disco de suporte precisa ser adicionado à placa de amostra).
3. Análise dos resultados do sequenciamento
   1. Obtenha os resultados do sequenciamento do software. Consulte o manual do software para obter os procedimentos de operação detalhados. Use a sequência de referência do NCBI.

Compare a sequência da amostra de teste com a sequência de referência para obter o status de mutação da amostra de teste. A tecnologia WBT-PCR baseada em BDA pode detectar a mutação RHOA G17V conhecida e outras mutações de baixa frequência no intervalo de amplificação de primers a montante e a jusante. Veja a Figura 1. Dois genes adicionais, a saber, IDH2 e JAK1, também foram analisados usando este método, Figura 2 e Figura 3, respectivamente. Os resultados mostram que este método é bastante sensível na detecção de mutações de baixa frequência.

Figura 1: Resultado do sequenciamento para RHOA. De cima para baixo, a figura mostra a mutação de base do sítio RHOA G17 amplificada por WBT-PCR e os resultados do sequenciamento após a amplificação tradicional por PCR correspondente ao RHOA G17 do tipo selvagem. A imagem do meio mostra os resultados do sequenciamento da mutação c.50G>T após amplificação com primers WBT-PCR quando a sensibilidade de detecção é de 0,5%. A imagem inferior mostra os resultados do sequenciamento da mutação c.49-50delinsTT após amplificação com primers WBT-PCR quando a sensibilidade de detecção é de 0,5%. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2: Resultado do sequenciamento para IDH2. De cima para baixo, a figura acima mostra a mutação de base do sítio IDH2 R172 amplificada por WBT-PCR e os resultados do sequenciamento após a amplificação tradicional por PCR correspondente ao IDH2 R172 do tipo selvagem. A imagem superior mostra os resultados do sequenciamento da mutação c.515G>A após amplificação com primers WBT-PCR quando a sensibilidade de detecção é de 0,5%. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3: Resultado do sequenciamento para JAK1. De cima para baixo, a figura acima mostra a mutação de base do sítio JAK1 S703 amplificada por WBT-PCR e os resultados do sequenciamento após a amplificação tradicional por PCR correspondente ao JAK1 S703 do tipo selvagem. A imagem superior mostra os resultados do sequenciamento da mutação c.2108G>T após amplificação com primers WBT-PCR quando a sensibilidade de detecção é de 0,5%. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Tabela 1: A lista final de primers do RHOA.

Tabela 2: A lista final de IDH2 e JAK1.

Os autores não têm nada a divulgar.