Vírus pseudotipados (PVs) são virions defeituosos de replicação que são usados para estudar interações vírus-hospedeiro em condições mais seguras do que manusear vírus autênticos. Apresentado aqui é um protocolo detalhado que mostra como os PVs SARS-CoV-2 podem ser usados para testar a capacidade de neutralização do soro dos pacientes após a vacinação COVID-19.
É necessária uma assinatura do JoVE para visualizar este conteúdo. Faça login ou inicie seu teste gratuito.
Artigo de método
Vírus pseudotipados como uma ferramenta molecular para monitorar respostas imunes humorais contra SARS-CoV-2 via ensaio de neutralização
* These authors contributed equally
Neste artigo
Resumo
Resumo
Vírus pseudotipados (PVs) são ferramentas moleculares que podem ser usadas para estudar interações vírus-hospedeiro e testar a capacidade neutralizante de amostras de soro, além de seu uso mais conhecido em terapia gênica para a entrega de um gene de interesse. Os PVs são defeituosos de replicação porque o genoma viral é dividido em diferentes plasmídeos que não são incorporados aos PVs. Este sistema seguro e versátil permite o uso de PVs em laboratórios de nível 2 de biossegurança. Aqui, apresentamos uma metodologia geral para produzir PVs lentivirais baseada em três plasmídeos como mencionado aqui: (1) o plasmídeo da espinha dorsal que carrega o gene repórter necessário para monitorar a infecção; (2) o plasmídeo de embalagem que carrega os genes de todas as proteínas estruturais necessárias para gerar os PVs; (3) plasmídeo de expressão de glicoproteínas na superfície do envelope que determina o tropismo viral e medeia a entrada viral na célula hospedeira. Neste trabalho, a Spike de SARS-CoV-2 é a glicoproteína do envelope usada para a produção de lentivírus pseudotipados SARS-CoV-2 não replicativos.
Resumidamente, as células de embalagem (HEK293T) foram co-transfectadas com os três diferentes plasmídeos usando métodos padrão. Após 48 h, o sobrenadante contendo as VVPP foi colhido, filtrado e armazenado a -80 °C. A infectividade dos PVs SARS-CoV-2 foi testada estudando a expressão do gene repórter (luciferase) em uma linhagem celular alvo 48 h após a infecção. Quanto maior o valor das unidades de luminescência relativa (RLUs), maior a taxa de infecção/transdução. Além disso, os PVs infecciosos foram adicionados às amostras de soro diluídas em série para estudar o processo de neutralização da entrada de pseudovírus nas células-alvo, medido como a redução na intensidade da RLU: valores mais baixos correspondentes à alta atividade neutralizante.
Introdução
Vírus pseudotipados (PVs) são ferramentas moleculares utilizadas em microbiologia para estudar interações vírus-hospedeiro e patógeno-patógeno 1,2,3,4. Os PVs consistem em uma parte interna, o núcleo viral que protege o genoma viral, e uma parte externa, as glicoproteínas do envelope na superfície do vírus que definem o tropismo5. Um pseudovírus é incompetente em replicação na célula-alvo porque não contém toda a informação genética para gerar novas partículas virais. Essa combinação de características peculiares torn....
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Protocolo
O presente protocolo foi aprovado e segue as diretrizes do Comitê de Ética da Universidade de Verona (protocolo de aprovação número 1538). Consentimento informado por escrito foi obtido dos sujeitos humanos participantes do estudo. Amostras de sangue total foram coletadas de voluntários de profissionais de saúde que estavam no processo de receber vacinas anti-SARS-CoV-2. Essas amostras foram coletadas em tubos plásticos contendo anticoagulantes para posterior isolamento do soro15.
Todos os processos a seguir devem ser realizados em uma capa biológica Classe 2, trabalhando em condições estéreis. O manuseio do vírus de....
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Resultados
Este protocolo descreve a produção de PVs SARS-CoV-2 e uma aplicação a jusante destes PVs para analisar a actividade da neutralização do soro/plasma dos indivíduos que recebem a vacinação anti-COVID-1917. Além disso, este protocolo pode ser aplicado para produzir pseudotipos de cada variante de preocupação SARS-CoV-2 (VOC) para testar a evolução da resposta neutralizante. Apesar desse protocolo facilitar o estudo da resposta imune humoral após a vacinação contra a COVID-19, ele pode ser adaptado p.......
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Discussão
Embora o uso de um vírus selvagem simule a infecção real, os PVs lentivirais são uma opção mais segura para estudar os mecanismos associados à entrada e infecção viral sem os rígidos requisitos de segurança necessários para trabalhar com vírus patogênicos 4,20,21. Os PVs são compostos por um núcleo viral defeituoso de replicação circundado pela glicoproteína do envelope de superfície de um vírus patogênico, que é o objetivo do e.......
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Divulgações
Os autores declaram não haver conflitos de interesse.
Agradecimentos
Reconhecemos a contribuição dos profissionais de saúde voluntários. Este projeto foi apoiado pelo Departamento de Excelência 2023/2027, MUR, Itália. A AR e a DZ foram apoiadas pela PRIN2022 (fundos da UE; NextGenerationEU)
....Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| 0,45 μ filtro m | SARSTEDT | 83 1826 | |
| placa de 6 poços | SARSTEDT | 83 3920 | |
| placa de 96 poços | SARSTEDT | 8,33,924 | |
| Unidades de Filtro Centrífugo Amicon Ultra-15 | Merck | 10403892 | |
| Preto Opaco Microplaca de 96 poços | Perkin Elmer 60005270 | ||
| Dulbecco's Modified Eagle Medium | SIGMA-ALDRICH | D6546 - 500ML | |
| Solução salina tamponada com fosfato de Dulbecco (PBS 1x) | AUROGENE | AU-L0615-500 | |
| Soro fetal bovino | AUROGENE | AU-S1810-500 | |
| Graphpad Prism versão 7 | graphpad dotmatics | NA | No manuscrito, substituímos o nome comercial por 'programa de análise de dados'HEK293T |
| células | ATCC | Células CRL-3216 | |
| HEK293T/ACE2 | ATCC | CRL-3216 | HEK293T foi transduzido para superexpressar ACE2 com um vetor lentiviral. |
| L-glutamina | AUROGENE | AU-X0550-100 | |
| Luminômetro - Victor3 | Perkin Elmer | HH35000500 | No manuscrito, substituímos o nome comercial por 'luminômetro' |
| Opti-MEM | Thermo Fisher Scientific | 11058021 | No manuscrito, substituímos o nome comercial por 'meio de soro reduzido' |
| p8.91 plasmídeo de embalagem | Di Genova et al., 2021 | Um gentil presente do Prof. Nigel Temperton (ref 16.) | |
| plasmídeo repórter pCSFLW | Di Genova et al., 2021 | Um gentil presente do Prof. Nigel Temperton (ref 16.) | |
| Penicilina/estreptomicina | AUROGENE | AU-L0022-100 | |
| Polietilenimina ramificada (PEI) (25 kDa) | SIGMA-ALDRICH | 408727 | |
| RRL.sin.cPPT.SFFV/Ace2.IRES-puro.WPRE (MT126) | Addgene | 145839 | Este plasmídeo foi usado para gerar HEK293Tcells/ACE2 |
| SARS-CoV-2 Spike expressando plasmídeo | Addgene | pGBW-m4137382 | |
| steadylite plus Sistema de ensaio de gene repórter | Perkin Elmer | 6066759 | No manuscrito, substituímos o nome comercial por 'reagente de leitura de luciferase'Tripsina |
| EDTA 1x | AUROGENE | AU-L0949-100 |
Referências
- Ozaki, D. A., et al. International technology transfer of a GCLP-compliant HIV-1 neutralizing antibody assay for human clinical trials. Plos One. 7 (1), e30963(2012).
- Pouget, M., et al.
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Reimpressões e permissões
