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Artigo de método

Vírus pseudotipados como uma ferramenta molecular para monitorar respostas imunes humorais contra SARS-CoV-2 via ensaio de neutralização

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DOI:

10.3791/65658

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21 de novembro de 2023

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1Department of Neuroscience, Biomedicine and Movement, University of Verona, 2Laboratory of Molecular Neurovirology, Faculty of Health Science, University of Brasília, 3Viral Pseudotype Unit, Medway School of Pharmacy, Universities of Kent and Greenwich at Medway

* These authors contributed equally

Neste artigo

Resumo

Vírus pseudotipados (PVs) são virions defeituosos de replicação que são usados para estudar interações vírus-hospedeiro em condições mais seguras do que manusear vírus autênticos. Apresentado aqui é um protocolo detalhado que mostra como os PVs SARS-CoV-2 podem ser usados para testar a capacidade de neutralização do soro dos pacientes após a vacinação COVID-19.

Resumo

Vírus pseudotipados (PVs) são ferramentas moleculares que podem ser usadas para estudar interações vírus-hospedeiro e testar a capacidade neutralizante de amostras de soro, além de seu uso mais conhecido em terapia gênica para a entrega de um gene de interesse. Os PVs são defeituosos de replicação porque o genoma viral é dividido em diferentes plasmídeos que não são incorporados aos PVs. Este sistema seguro e versátil permite o uso de PVs em laboratórios de nível 2 de biossegurança. Aqui, apresentamos uma metodologia geral para produzir PVs lentivirais baseada em três plasmídeos como mencionado aqui: (1) o plasmídeo da espinha dorsal que carrega o gene repórter necessário para monitorar a infecção; (2) o plasmídeo de embalagem que carrega os genes de todas as proteínas estruturais necessárias para gerar os PVs; (3) plasmídeo de expressão de glicoproteínas na superfície do envelope que determina o tropismo viral e medeia a entrada viral na célula hospedeira. Neste trabalho, a Spike de SARS-CoV-2 é a glicoproteína do envelope usada para a produção de lentivírus pseudotipados SARS-CoV-2 não replicativos.

Resumidamente, as células de embalagem (HEK293T) foram co-transfectadas com os três diferentes plasmídeos usando métodos padrão. Após 48 h, o sobrenadante contendo as VVPP foi colhido, filtrado e armazenado a -80 °C. A infectividade dos PVs SARS-CoV-2 foi testada estudando a expressão do gene repórter (luciferase) em uma linhagem celular alvo 48 h após a infecção. Quanto maior o valor das unidades de luminescência relativa (RLUs), maior a taxa de infecção/transdução. Além disso, os PVs infecciosos foram adicionados às amostras de soro diluídas em série para estudar o processo de neutralização da entrada de pseudovírus nas células-alvo, medido como a redução na intensidade da RLU: valores mais baixos correspondentes à alta atividade neutralizante.

Introdução

Vírus pseudotipados (PVs) são ferramentas moleculares utilizadas em microbiologia para estudar interações vírus-hospedeiro e patógeno-patógeno 1,2,3,4. Os PVs consistem em uma parte interna, o núcleo viral que protege o genoma viral, e uma parte externa, as glicoproteínas do envelope na superfície do vírus que definem o tropismo5. Um pseudovírus é incompetente em replicação na célula-alvo porque não contém toda a informação genética para gerar novas partículas virais. Essa combinação de características peculiares torna os PVs uma alternativa segura a um vírus selvagem. Os vírus selvagens, por outro lado, são altamente patogênicos e não podem ser usados em laboratórios BSL 2 para análise6.

A infectividade dos PVs pode ser monitorada por um gene repórter, geralmente codificando para uma proteína fluorescente (GFP, RFP, YFP) ou uma enzima que produz produtos quimioluminescentes (luciferase). Este está contido em um dos plasmídeos utilizados para a produção de PV e incorporado ao genoma do pseudovírus7.

Vários tipos de núcleos fotovoltaicos existem atualmente, incluindo partículas derivadas de lentivirais baseadas no genoma do HIV-1. A grande vantagem dos PVs baseados no HIV-1 sobre outras plataformas é o seu processo intrínseco de integração no genoma da célula-alvo8. Embora o HIV-1 seja um vírus altamente contagioso e seja o agente causador da AIDS, esses vetores lentivirais são seguros de usar devido às extensas etapas de otimização ao longo dos anos. Condições ótimas de segurança foram alcançadas com a introdução de vetores lentivirais de2ª geração, nos quais os genes virais foram esgotados sem influenciar a capacidade de transdução9. A3ª e4ª gerações contribuíram para o aumento da segurança do manuseio do vetor lentiviral com a divisão posterior do genoma viral em plasmídeos separados10,11. As últimas gerações de PVs são geralmente empregadas para produzir vetores lentivirais para terapia gênica.

Os PVs podem ser usados para estudar interações entre vírus e células hospedeiras, tanto durante a fase de produção quanto na de infecção. Os PVs são especialmente empregados em ensaios de neutralização de pseudovírus (PVNA). Os PVNAs são amplamente validados para avaliar o potencial de neutralização do soro ou plasma visando a glicoproteína viral no envelope do PV12,13. A atividade de neutralização, expressa como a concentração inibitória 50 (IC50), é definida como a diluição do soro/plasma que bloqueia 50% da entrada da partícula viral14. Neste protocolo, descrevemos a configuração de um PVNA para testar a atividade do anticorpo contra a Síndrome Respiratória Aguda Grave - Coronavirus 2 (SARS-CoV-2) em soros coletados antes e depois de receber uma dose de vacina de reforço.

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Protocolo

O presente protocolo foi aprovado e segue as diretrizes do Comitê de Ética da Universidade de Verona (protocolo de aprovação número 1538). Consentimento informado por escrito foi obtido dos sujeitos humanos participantes do estudo. Amostras de sangue total foram coletadas de voluntários de profissionais de saúde que estavam no processo de receber vacinas anti-SARS-CoV-2. Essas amostras foram coletadas em tubos plásticos contendo anticoagulantes para posterior isolamento do soro15.

Todos os processos a seguir devem ser realizados em uma capa biológica Classe 2, trabalhando em condições estéreis. O manuseio do vírus deve ser realizado com cuidado, e todos os resíduos devem ser neutralizados em uma solução de água sanitária diluída. Uma visão geral do protocolo é exibida na Figura 1.

figure-protocol-1
Figura 1: Representação gráfica de um ensaio de neutralização. (A) produção de PV, (B) titulação de PV e (C) ensaio de neutralização. Todos os procedimentos são realizados em capuz biológico classe 2 em condições estéreis. A etapa de titulação (B) precisa ser realizada para padronizar os níveis de infectividade dos PVs antes do uso no ensaio de neutralização (C). Esta figura foi criada com o BioRender. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

1. Produção de PVs SARS-CoV-2 e teste de infecciosidade

  1. Sementes 5 x 105 células HEK293T em meio Dulbecco Modified Eagle Medium completo (DMEM, alta glicose, 10% de soro fetal bovino (FBS), 1% L-glutamina, 1% penicilina/estreptomicina) em uma placa de 6 poços (6WP) para atingir uma densidade celular adequada compatível com o reagente de transfecção utilizado. No caso de realizar a transfecção com polietilenonimina (PEI) (preparar o reagente seguindo as instruções do fabricante), certifique-se de que as células atinjam 40-60% de densidade no dia da transfecção (passo 1.3). Manter as células em estufa umidificada a 37 °C e 5% de CO2.
  2. Antes da transfecção, substitua o meio celular gasto por meio fresco sem antibióticos (DMEM, alta glicose, 10% FBS, 1% L-glutamina) para alcançar maior eficiência de transfecção.
    NOTA: No dia seguinte à semeadura, HEK293T células estão prontas para serem transfectadas.
  3. Transfect aderente HEK293T células com um reagente de transfecção adequado de acordo com as instruções do fabricante. Se estiver usando PEI, prepare duas misturas e siga os passos abaixo.
    1. Para preparar a mistura A, adicione 500 ng de pCMV-dR8.91 empacotando plasmídeo16, 750 ng de pCSFLW plasmídeorepórter 16, e 450 ng de Spike SARS-CoV-2 expressando plasmídeo em 100 μL de meio de soro reduzido.
    2. Para preparar a mistura B, adicionar 17,5 μL de PEI (concentração: 1 mg/mL) a 100 μL do meio de soro reduzido.
    3. Deixe ambas as misturas incubarem à temperatura ambiente (TR) por 5 min. Em seguida, misture o conteúdo de ambos os tubos adicionando a mistura de PEI B à mistura de DNA A.
    4. Incube o tubo por 20-30 min no RT. Agite o tubo suavemente a cada 3-4 min para melhorar a mistura. Finalmente, adicione a mistura às células HEK293T.
  4. 16-20 h após a transfecção, substituir o meio de cultura por DMEM fresco e completo. Incubar a 37 °C e 5% CO2, para permitir a produção de PVs por células transfectadas.
  5. 72 h após a transfecção, colher o sobrenadante contendo PVs. Em seguida, centrifugar a 1600 x g por 7 min à temperatura ambiente para remover restos celulares e células mortas e filtrá-lo através de um filtro de acetato de celulose de 0,45 μm.
  6. ETAPA OPCIONAL: Para aumentar o rendimento final do título PV, realizar múltiplas transfecções, agrupar o meio celular contendo PVs e concentrá-lo usando tubos concentradores.
  7. Prosseguir directamente com os passos seguintes ("titulação PV", secção 2) ou alicitar o meio contendo PV em tubos adequados para armazenar a -80 °C até à utilização. Preparar uma alíquota adicional (400-500 μL) para ser usada para titulação.
    NOTA: A confecção de alíquotas múltiplas garantirá a reprodutibilidade entre os experimentos, evitando ciclos excessivos de congelamento de degelo.

2. Titulação dos PVs

  1. Use o meio fresco contendo PV para as próximas etapas ou descongele a alíquota de teste (etapa 1.7) para realizar a titulação do novo estoque viral. O congelamento de alíquotas do mesmo estoque fotovoltaico garantirá a reprodutibilidade.
  2. Adicionar 50 μL de DMEM completo (ou meio completo compatível com a linhagem celular alvo em uso) em todos os poços de uma placa de poço de 96 (96WP) necessários para testar em duplicado o estoque fotovoltaico, deixando a linha "A" vazia. Adicione 100 μL de estoque de PVs à linha "A". Com base no número de preparações a serem testadas, deixar uma coluna sem o vírus como controle "somente célula" (Figura 2).
  3. Pipetar 50 μL da linha A para a linha B e repetir este processo até à linha G para obter diluições em série do stock inicial. Descarte o volume excedente da última linha.
  4. Destacar as células usando tripsina/ácido etilenodiaminotetracético 1x (EDTA) no tampão fosfato salino 1x (DPBS 1x) de Dulbecco, após remover o meio gasto e lavar as células com DPBS 1x duas vezes. Preparar as células para uma densidade de 4 x 105 células/mL.
    OBS: Neste protocolo, a infecção por PVs foi testada na linhagem celular suscetível HEK293T/ACE2; tais células foram derivadas de HEK293T, transduzidas usando um vetor lentiviral para expressar o receptor ACE2.
  5. Adicione 50 μL da suspensão celular em cada poço para garantir uma contagem de células de 2 x 104 células por poço.
  6. Incubar a 37 °C e 5% CO2, durante 48 h.
  7. Após a incubação, realizar o ensaio Luciferase para obter a leitura de acordo com as instruções do fabricante. Adicionar 100 μL do reagente luciferase aos poços e incubar no escuro em TR por 2 min. Mova o conteúdo de cada poço para uma placa preta de 96 poços (compatível com o leitor de placas disponível) e leia as placas em um leitor de placas de 96 poços.
    NOTA: O luminômetro usado para a leitura da luciferase produzirá um arquivo de planilha com os dados brutos e não processados que serão usados para análise a jusante (neste caso, um arquivo Excel). A infectividade do vírus será expressa em unidades de luminescência relativa (RLU) (descritas no ponto 4.1).

figure-protocol-2
Figura 2: Layout representativo de uma placa de 96 poços para titulação de PVs. Um volume fixo de sobrenadante contendo PV é adicionado à linha A, colunas 1-11, e diluído em série. A última coluna é deixada como o controle "somente célula". Esta figura foi criada com o BioRender. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

3. Ensaio de neutralização

  1. Descongelar soros dos pacientes no gelo. Inativar amostras de soro incubando-as a 56 °C por 30 min.
  2. Em uma placa de 96 poços, adicionar 50 μL do DMEM fresco completo (ou meio completo compatível com a linhagem celular alvo utilizada) em cada um dos seguintes poços: da linha B (colunas 1-10) à linha H (colunas 1-10). Colocar 95 μL do DMEM fresco e completo na linha A (colunas 1-10). Adicionar 50 μL e 100 μL de DMEM completo nos poços das colunas 11 e 12, respectivamente. Estes serão os controles infectados (controle de vírus, ou CV) e não infectados (somente células ou CC), respectivamente (Figura 3).
  3. Adicionar 5 μL de amostras de soro/plasma inactivadas termicamente na linha A (colunas 1-10). Cada amostra será em duplicata. Com uma pipeta multicanal, misture as amostras na primeira fileira e mova 50 μL de meio contendo soro da linha A para a linha B. Repita esse processo até a última linha (Figura 3). Descarte os 50 μL restantes.
  4. Descongelar o número necessário de alíquotas dos PVs e diluir para ≥ 104 RLU/mL. Adicionar 50 μL do meio PV diluído a cada poço (da coluna 1 à coluna 11) utilizando uma pipeta multicanal para atingir uma diluição de 1:1 de soro/plasma inactivado pelo calor para vírus. Incubar a 37 °C e 5% CO2, por 1 h para permitir que os anticorpos nas amostras de soro se liguem à proteína spike do SARS-CoV-2 nos PVs.
  5. Preparar pelo menos 5 ml de suspensão de células suscetíveis (HEK293T/ACE2) a uma densidade celular de 4 x 105 células/ml. Adicionar 50 μL da suspensão celular a cada poço e incubar a 37 °C e 5% CO2, durante 48 h.
  6. Após a incubação, realizar a leitura do ensaio de luciferase de acordo com as instruções do fabricante, conforme descrito no passo 2.7.
    NOTA: O luminômetro usado para leitura de luciferase produzirá um arquivo de planilha (neste caso, .xlsx) com os dados brutos e não processados que serão usados para análise a jusante (o arquivo de ensaio Luciferase).

figure-protocol-3
Figura 3: Representação da placa com base na diluição do soro. O vermelho vivo corresponde a uma maior quantidade de soro, e a faixa azul brilhante (coluna 11) corresponde ao controle de células infectadas (CV, controle do vírus). A faixa azul clara (coluna 12) corresponde a células não infectadas (CC, controle celular). Esta figura foi criada com o BioRender. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

4. Análise de titulação

  1. No arquivo de ensaio Luciferase, atribua os nomes/títulos às amostras correspondentes.
  2. Multiplique a medida de RLU pelos fatores de diluição (de cima para baixo da grade: 20x, 40x, 80x, 160x, 320x, 640x, 1.280x, 2.560x) para obter RLU/mL. Se forem utilizados diferentes factores de diluição, altere os factores de multiplicação em conformidade.
  3. Calcular a RLU/mL média para cada preparação fotovoltaica.

5. Análise do ensaio de neutralização de PVs

  1. No arquivo de planilha do ensaio Luciferase (neste caso, .xlsx), atribua os títulos correspondentes às amostras testadas. Insira o fator de diluição da amostra (40s, 80x, 160x, 320x, 640x, 1.280x, 2.560x, 5.120x). Calcular o Log10 dos fatores de diluição.
  2. Calcular a RLU média dos controles não infectados e infectados (Figura 3, colunas 11 e 12, respectivamente). Esses valores serão úteis para a normalização na etapa 5.5.
  3. Abra um novo documento para análise de dados. Selecione Análise X/Y, insira X como Números e Y como Insira 2 valores de replicação em subcolunas lado a lado.
  4. Insira os valores Log10 (diluição) como números X. Insira a RLU duplicada das amostras.
  5. Vá para Analisar > Normalizar > Sinalizar todas as amostras na mesma folha. Insira os valores médios de VC e CC em Como é definido 0%?, e Como é definido 100%?, respectivamente. Clique em OK.
  6. Na folha de dados normalizada, vá para Analisar análises > XY > Análises não lineares (ajuste de curva). Sinalize todos os exemplos e clique em OK. Para a Dose-resposta - Inibição, selecione log(inibidor) vs resposta normalizada - inclinação variável.
  7. Em Constrain, altere HillSlope para Must menor que 0.
  8. Em Saída, sinalize Criar tabela e gráfico de resumo. Clique em OK para obter as análises finais. Uma folha de trabalho com um modelo para a análise é fornecida no Arquivo Suplementar 1.

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Resultados

Este protocolo descreve a produção de PVs SARS-CoV-2 e uma aplicação a jusante destes PVs para analisar a actividade da neutralização do soro/plasma dos indivíduos que recebem a vacinação anti-COVID-1917. Além disso, este protocolo pode ser aplicado para produzir pseudotipos de cada variante de preocupação SARS-CoV-2 (VOC) para testar a evolução da resposta neutralizante. Apesar desse protocolo facilitar o estudo da resposta imune humoral após a vacinação contra a COVID-19, ele pode ser adaptado p...

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Discussão

Embora o uso de um vírus selvagem simule a infecção real, os PVs lentivirais são uma opção mais segura para estudar os mecanismos associados à entrada e infecção viral sem os rígidos requisitos de segurança necessários para trabalhar com vírus patogênicos 4,20,21. Os PVs são compostos por um núcleo viral defeituoso de replicação circundado pela glicoproteína do envelope de superfície de um vírus patogênico, que é o objetivo do e...

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Divulgações

Os autores declaram não haver conflitos de interesse.

Agradecimentos

Reconhecemos a contribuição dos profissionais de saúde voluntários. Este projeto foi apoiado pelo Departamento de Excelência 2023/2027, MUR, Itália. A AR e a DZ foram apoiadas pela PRIN2022 (fundos da UE; NextGenerationEU)

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
0,45 μ filtro mSARSTEDT83 1826
placa de 6 poçosSARSTEDT83 3920
placa de 96 poçosSARSTEDT8,33,924
Unidades de Filtro Centrífugo Amicon Ultra-15Merck10403892
Preto Opaco Microplaca de 96 poçosPerkin Elmer 60005270
Dulbecco's Modified Eagle Medium SIGMA-ALDRICHD6546 - 500ML
Solução salina tamponada com fosfato de Dulbecco (PBS 1x)AUROGENEAU-L0615-500
Soro fetal bovinoAUROGENEAU-S1810-500
Graphpad Prism versão 7graphpad dotmaticsNANo manuscrito, substituímos o nome comercial por 'programa de análise de dados'HEK293T
célulasATCCCélulas CRL-3216
HEK293T/ACE2ATCCCRL-3216HEK293T foi transduzido para superexpressar ACE2 com um vetor lentiviral.
L-glutamina AUROGENEAU-X0550-100
Luminômetro - Victor3Perkin ElmerHH35000500No manuscrito, substituímos o nome comercial por  'luminômetro' 
Opti-MEMThermo Fisher Scientific11058021No manuscrito, substituímos o nome comercial por 'meio de soro reduzido' 
p8.91 plasmídeo de embalagemDi Genova et al., 2021Um gentil presente do Prof. Nigel Temperton (ref 16.)
plasmídeo repórter pCSFLWDi Genova et al., 2021Um gentil presente do Prof. Nigel Temperton (ref 16.)
Penicilina/estreptomicinaAUROGENEAU-L0022-100
Polietilenimina ramificada (PEI) (25 kDa)SIGMA-ALDRICH408727
RRL.sin.cPPT.SFFV/Ace2.IRES-puro.WPRE (MT126)Addgene145839Este plasmídeo foi usado para gerar HEK293Tcells/ACE2
SARS-CoV-2 Spike expressando plasmídeoAddgenepGBW-m4137382
steadylite plus Sistema de ensaio de gene repórterPerkin Elmer6066759No manuscrito, substituímos o nome comercial por 'reagente de leitura de luciferase'Tripsina
EDTA 1xAUROGENEAU-L0949-100

Referências

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