Aqui, fornecemos um protocolo completo para padronizar e implementar o método de detecção do vírus SARS-CoV-2 em amostras humanas por amplificação isotérmica mediada por loop de transcrição reversa (RT-LAMP). Este método, feito em 60 min, pode ser adaptado a qualquer laboratório ou ponto de atendimento a baixo custo e usando equipamentos baratos.
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Artigo de método
Detecção do vírus SARS-CoV-2 por amplificação isotérmica mediada por loop de transcrição reversa
Neste artigo
Resumo
Resumo
O vírus coronavírus 2 da síndrome respiratória aguda grave (SARS-CoV-2) afetou drasticamente a saúde humana. Continua a ser uma ameaça para a sociedade moderna porque muitas pessoas morrem como resultado de uma infecção. A doença é diagnosticada por meio de testes sorológicos e moleculares, como a reação em cadeia da polimerase em tempo real padrão-ouro (RT-PCR). Este último tem várias desvantagens porque requer infraestrutura especializada, equipamentos caros e pessoal treinado. Aqui, apresentamos um protocolo descrevendo as etapas necessárias para detectar o vírus SARS-CoV-2 usando amplificação isotérmica mediada por loop de transcrição reversa (RT-LAMP) em amostras humanas. O protocolo inclui instruções para projetar primers in silico, preparar reagentes, amplificação e visualização. Uma vez padronizado, esse método pode ser facilmente implementado e adaptado a qualquer laboratório ou ponto de atendimento em 60 minutos a baixo custo e usando equipamentos baratos. É adaptável à detecção de diferentes patógenos. Assim, pode potencialmente ser usado no campo e nos centros de saúde para realizar vigilância epidemiológica oportuna.
Introdução
O coronavírus 2 da síndrome respiratória aguda grave (SARS-CoV-2) causa a doença do coronavírus 2019 (COVID-19). A Organização Mundial da Saúde declarou uma emergência de saúde pública de interesse internacional em 30 de janeiro de 2020 e uma pandemia em 11 de março de 2020. A pandemia resultou em mais de 760 milhões de casos e 6,87 milhões de mortes na data em que este artigo foi escrito1.
O impacto desse vírus destacou a necessidade de ferramentas de vigilância melhores, mais precisas, mais rápidas e mais amplamente disponíveis para melhorar a detecção e o controle de doenças infecciosas
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Protocolo
As amostras utilizadas foram fornecidas pelo laboratório clínico do Hospital Universitário Fundación Valle del Lili e corresponderam ao RNA purificado de pacientes que testaram positivo para COVID-19 usando a técnica de RT-qPCR. Todos os pacientes assinaram o termo de consentimento livre e esclarecido para a pesquisa, e este estudo foi aprovado pelo comitê de bioética para estudos em seres humanos do Hospital Universitário Fundación Valle del Lili.
1. Projeto e preparação do primer RT-LAMP
NOTA: Os primers LAMP podem ser usados com uma variedade de plataformas, incluindo LAMP da New England BioLabs....
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Resultados
A implementação do protocolo começa com o desenho do conjunto de primers para cada gene alvo seguindo o protocolo descrito acima. Em junho de 2020, 5.000 genomas de SARS-CoV-2 foram obtidos do banco de dados NextStrain, com 10% de representatividade dos genomas colombianos. Essas sequências foram alinhadas para obter a sequência de consenso que foi usada no processo de design do primer. A Tabela 1 mostra o conjunto de primers escolhido para os primers RdRp/Hel e RdRp. O conjunto de primers para amplifica.......
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Discussão
Embora o RT-LAMP seja considerado uma metodologia complementar para a realização de diagnósticos moleculares, ele também apresenta algumas limitações e etapas críticas que devem ser consideradas quando o protocolo é padronizado e implementado.
A padronização LAMP para a detecção de SARS-CoV-2 avaliou os seguintes parâmetros e componentes no master mix: (a) concentração e temperatura de alinhamento dos primers; b) Concentração das enzimas; c) Concentração de magnésio; d) Tempo de reacção; e) In.......
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Divulgações
Natalia Campillo-Pedroza é CEO da empresa BioDx: Diagnóstico y Soluciones Biotecnológicas S.A.S. O restante dos autores declara não haver conflito de interesses.
Agradecimentos
Este trabalho foi financiado pelo Sistema General de Regalías da Colômbia, número de processo BPIN 2020000100092, e Universidad Icesi - Convocatoria Interna, número de processo CA0413119. O MFVT também foi financiado pelos Fundos de Professor Assistente da Universidad de los Andes. As entidades financiadoras não participaram da concepção, execução das atividades, coleta de dados e análise e preparação dos dados do manuscrito. Agradecemos ao Hospital Universitário Fundación Valle del Lili pelo RNA viral das amostras de Sars-CoV-2 e ao Dr. Alvaro Barrera-Ocampo pelos comentários sobre o manuscrito.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| 1 kb DNA Ladder | SOLIS BIODYNE | 07-12-00050 | Armazenar em -20 ° C |
| 50x TAE Tampão de Eletroforese | ThermoScientific | B49 | Armazene à temperatura ambiente |
| Accuris High Fidelity Polymerase | ACCURIS LIFE SCIENCE REAGENTS | PR1000-HF-200 | Pode ser usado no caso de a DNA polimerase de alta fidelidade Q5 não poder ser comprada. Para a enzima, fazer alíquotas de volume adequado e conservar a -20 graus; C até o uso. |
| Agarose | PanReacAppliChem | A8963,0100 | N/A |
| Bst 3.0 DNA Polimerase 8000 UI/mL | New England BioLabs | M0374S/M0374L | Para a enzima, faça alíquotas de um volume apropriado e armazene a -20 &graus; C até o uso. |
| Conjunto de solução de desoxinucleotídeo (dNTP) | New England BioLabs | N0446S | Loja a -20 ° C |
| Dietilpirocarbonato | Sigma-Aldrich | 159220-25G | Manuseie-o com cuidado sob um armário de extração |
| GeneRuler 100 bp Plus DNA Ladder, pronto para uso | ThermoScientific | SM0322 | Armazene a -20 ° C |
| Hidroxi naftol azul sal dissódico | Santa Cruz Biotechnology | sc-215156B | N/A |
| Q5 DNA polimerase de alta fidelidade 2000 IU/mL | New England BioLabs | M0491S / M0491L | Para a enzima, faça alíquotas de um volume apropriado e armazene a -20 & C até o uso. |
| WarmStart RTx Transcriptase Reversa 15000 UI/mL | New England BioLabs | M0380S/M0380L | Para a enzima, faça alíquotas de um volume apropriado e armazene a -20 &graus; C até o uso. |
Referências
- World Health Organization. Who coronavirus (COVID-19) dashboard (no date). , https://covid19.who.int/ (2023).
- Ibrahim, N. K. Epidemiologic surveillance for controlling Covid-19 pandemic: types, challenges and implications. Journal of Infection and Public Health. 13
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Reimpressões e permissões
