Artigo de método

Analisando a função mitocondrial em um mutanteB9-nulo de Drosophila melanogaster PINK1 usando respirometria de alta resolução

DOI:

10.3791/65664

⸱

10 de novembro de 2023

 ,  , 
1Laboratory of Experimental Biochemistry and Toxicology, Department of Biochemistry and Molecular Biology, Center of Natural and Exact Sciences, Federal University of Santa Maria, 2Graduate Program in Biological Sciences: Toxicological Biochemistry, Federal University of Santa Maria

* These authors contributed equally

Neste artigo

Resumo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Apresentamos aqui um protocolo de respirometria de alta resolução para análise bioenergética em mutantes PINK1B9-null. O método utiliza o protocolo Substrate-Uncoupler-Inhibitor-Titration (SUIT).

Resumo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Doenças neurodegenerativas, incluindo a doença de Parkinson (DP), e distúrbios celulares, como o câncer, são alguns dos distúrbios que interrompem o metabolismo energético com comprometimento das funções mitocondriais. As mitocôndrias são organelas que controlam tanto o metabolismo energético quanto os processos celulares envolvidos na sobrevivência e morte celular. Por esta razão, abordagens para avaliar a função mitocondrial podem oferecer informações importantes sobre as condições celulares em processos patológicos e fisiológicos. Nesse sentido, protocolos de respirometria de alta resolução (HRR) permitem avaliar toda a função da cadeia respiratória mitocondrial ou a atividade de complexos mitocondriais específicos. Além disso, o estudo da fisiologia mitocondrial e da bioenergética requer modelos geneticamente e experimentalmente tratáveis, como Drosophila melanogaster.

Esse modelo apresenta várias vantagens, como sua semelhança com a fisiologia humana, seu rápido ciclo de vida, fácil manutenção, custo-benefício, alta capacidade de rendimento e um número minimizado de preocupações éticas. Esses atributos coletivamente o estabelecem como uma ferramenta inestimável para dissecar processos celulares complexos. O presente trabalho explica como analisar a função mitocondrial utilizando o mutante Drosophila melanogaster PINK1 B9-null. O gene pink1 é responsável por codificar a putativa quinase 1 induzida por PTEN, através de um processo reconhecido como mitofagia, que é crucial para a remoção de mitocôndrias disfuncionais da rede mitocondrial. Mutações nesse gene têm sido associadas a uma forma familiar autossômica recessiva de início precoce da DP. Esse modelo pode ser utilizado para estudar as disfunções mitocondriais envolvidas na fisiopatologia da DP.

Introdução

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

As mitocôndrias são organelas celulares que controlam funções importantes, incluindo regulação apoptótica, homeostase do cálcio e participação em vias biossintéticas. Por possuírem material genético autônomo, são capazes de contribuir para os processos de manutenção e reparo celular. Sua estrutura abriga a cadeia de transporte de elétrons e a fosforilação oxidativa, ambas cruciais para a energia celular 1,2,3. Em particular, o controle energético é obtido através da produção de adenosina trifosfato (ATP) via fosforilação oxidativa (OXPHOS)2. A interrupção do metabolismo energético com comprometimento das funções mitocondriais ocorre tanto na sobrevivência quanto na mortecelular4,5, frequentemente associada a uma ampla gama de patologias humanas, como o câncer, e doenças neurodegenerativas, como a Doença de Parkinson (DP)3,6.

A DP é uma doença crônica, progressiva e neurológica. A causa primária dessa doença é a morte das células cerebrais, principalmente da substância negra, responsáveis pela produção do neurotransmissor dopamina, que controla o movimento 6,7,8. A primeira observação que ligava o parkinsonismo à disfunção mitocondrial foi feita em 1988, em modelos experimentais utilizando toxinas inibidoras da cadeia respiratória do Complexo I9.

Atualmente, existem vários métodos para avaliar a disfunção mitocondrial 10,11,12,1 3; no entanto, comparada às abordagens convencionais, a respirometria de alta resolução (FCR) apresenta sensibilidade e vantagens superiores 13,14. Por exemplo, protocolos de FCR permitem avaliar toda a função da cadeia respiratória mitocondrial ou a atividade de complexos mitocondriais específicos14,15. As disfunções mitocondriais podem ser avaliadas em células intactas, mitocôndrias isoladas ou mesmo ex vivo 10,11,13,14.

As disfunções mitocondriais estão intimamente associadas a muitos processos patológicos e fisiológicos. Portanto, é importante estudar a fisiologia mitocondrial e a bioenergética usando sistemas modelo geneticamente e experimentalmente tratáveis. Nesse sentido, a pesquisa sobre Drosophila melanogaster, a mosca-da-fruta, tem várias vantagens. Esse modelo compartilha características e processos celulares fundamentais com humanos, incluindo o uso de DNA como material genético, organelas comuns e vias moleculares conservadas envolvidas no desenvolvimento, imunidade e sinalização celular. Além disso, as moscas-das-frutas apresentam ciclo de vida rápido, fácil manutenção, baixo custo, alto rendimento e menos preocupações éticas, constituindo-se em uma ferramenta valiosa para dissecar processos celulares complexos 16,17,18,19,20.

Além disso, um homólogo do gene putativo quinase 1 (pink1) induzido por PTEN é expresso em D. melanogaster. Desempenha um papel crucial na remoção de mitocôndrias danificadas através do processo de mitofagia8. Em humanos, mutações nesse gene predispõem a uma forma familiar autossômica recessiva de DP associada à disfunção mitocondrial 8,21,22,23. Consequentemente, a mosca-da-fruta é um poderoso modelo animal para estudos sobre a fisiopatologia da DP e triagem de candidatos a fármacos com foco na disfunção mitocondrial e bioenergética. Portanto, o presente trabalho explica como analisar a função mitocondrial em um modelo de DP de D. melanogaster utilizando a técnica de HRR no OROBOROS com o protocolo Substrate-Uncoupler-Inhibitor-Titration (SUIT).

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Protocolo

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Foram utilizadas as cepas w1118 (branca) e w[*] Pink1[B9]/FM7i, P{w[+mC]=ActGFP}JMR3 (referida como Pink1B9) (FlyBase ID: FBgn0029891) do centro de estoque Bloomington Drosophila (número de identificação: 34749). Neste estudo, mutantes machos de D. melanogasterPINK1 B9-null são comparados com machos de D. melanogaster da cepa w1118, que é usada como grupo controle (background genético). Outros parâmetros devem ser analisados concomitantemente aos experimentos de respirometria para garantir que as moscas tenham o genótipo correto (Pink1B9/Y), como deformidades torácicas e problemas de locomoção, que são bem descritos para moscas mutantes Pink1 B924,25,26.

1. Animais e alojamento

  1. Manter as moscas em frascos de vidro contendo 10 mL de dieta padrão (levedura 1,73%, farinha de soja 0,9%, farinha de milho 7,3%, ágar 0,5%, xarope de milho 7,6% e ácido propiônico 0,48%) em temperatura e umidade constantes (25 °C e 60%, respectivamente), com ciclo claro/escuro de 12 h:12 h.
  2. Para cada experimento, utilizar duas moscas com idade entre 1 e 3 dias pós-eclosão.
    NOTA: As moscas virgens mutantes PINK1B9-null foram cruzadas com w1118 machos para obter os machos F1 com genótipo Pink1B9/Y.

2. Preparo da amostra

  1. Prepare o buffer MiR05 conforme descrito na Tabela 1.
  2. Anestesiar as moscas no gelo e transferi-las para tubos de microcentrífuga (duas moscas por tubo).
  3. Em cada tubo, adicionar 200 μL de tampão MiR05 refrigerado e homogeneizar as moscas. Homogeneizar manualmente, aplicando pressão suave (aproximadamente 4-6 golpes do pilão) para evitar a desintegração das mitocôndrias.

3. Calibração por respirometria de alta resolução de sensores polarográficos de oxigênio

NOTA: As câmaras OROBOROS têm um volume total de aproximadamente 2 mL. A calibração é necessária para garantir que o fluxo de oxigênio seja próximo de 0 pmol para iniciar o ensaio.

  1. Iniciando a calibração, adicionar 2 mL de MiR05 à câmara. Cubra a câmara com a rolha não deixando bolhas de ar; Em seguida, puxe cuidadosamente a rolha para formar uma única bolha de ar.
  2. Abra o software OROBOROS Dat.Lab. Insira uma temperatura de 25 °C no campo Temperatura do bloco e clique em Conectar ao Oxygraph-2k (Figura 1A).
  3. Clique e selecione a pasta onde a calibração deve ser salva e clique em Salvar.
  4. Quando uma nova janela se abrir, nomeie o experimento e as amostras (se estiver calibrando, basta digitar o nome calibração) e clique em Salvar.
  5. Vá para o menu Layout e escolha a primeira opção: 01 Calibration Exp. Gr.3 - Temp como mostra a Figura 1B.
  6. Aguarde até que o programa redirecione para o layout de calibração, aguarde até que a linha vermelha mostre uma linha reta padrão com pontos em torno de 0 pmol. Em seguida, selecione dois pontos: um para a câmara A e outro para a câmara B (Figura 1C) quando a linha vermelha estiver exatamente em zero.
    NOTA: Os pontos selecionados devem ter fluxo de oxigênio (linha vermelha) em torno de 0.
    1. Para marcar os pontos de ambas as câmaras, selecione a concentração O2 à direita da tela, selecione o ponto marcado e copie os valores de temperatura e pressão barométrica relativos ao ponto. Cole esses valores nas caixas abaixo e clique em Calibrar e Copiar para Área de Transferência no canto inferior direito da tela, como mostra a Figura 2.
    2. Execute esse processo para ambas as câmaras (A e B), vá para o menu Arquivo e selecione Salvar e Desconectar.
      NOTA: Após o processo de calibração, o programa redirecionará o usuário para a tela inicial para que o software esteja pronto para iniciar o teste HRR. Para este teste, utilizaremos o protocolo SUIT.

4. Protocolo SUIT

  1. Com a calibração concluída, retire as rolhas e abra as câmaras.
  2. Lave as rolhas (segurando a ponta que não toca na amostra) e as câmaras com etanol 100%, etanol 70% e água destilada, nessa ordem.
    Observação : repita o processo para cada alteração de amostra.
  3. Homogeneizar as moscas em 200 μL de tampão, colocar todo o conteúdo da amostra na câmara usando uma micropipeta e realocar a rolha na câmara, tomando cuidado para não criar bolhas de ar.
    NOTA: Se se formarem bolhas de ar, remova a rolha suavemente e adicione 100 μL de tampão MIR05.
  4. Clique no menu Layout e selecione a opção 05 Fluxo por Volume Corrigido como mostra a Figura 1B.
  5. Aguarde para ser redirecionado para uma nova janela. Clique em Salvar para selecionar a pasta onde o experimento será salvo.
  6. Aguarde a abertura de outra nova janela. Nomeie o experimento no espaço Código Experimental. Em seguida, nomeie cada amostra em sua respectiva câmara A e B no campo Amostra e defina o campo Unidade como unidade.
    NOTA: Outras unidades também podem ser escolhidas, por exemplo, Milhões de células ou mg.
  7. Considerando que este protocolo utiliza duas moscas (2 unidades) e o volume da câmara é de 2 mL, no campo Concentração , defina 1 por mL (Figura 1D).
    NOTA: Aqui, a quantidade de amostra foi normalizada pelo número de moscas; no entanto, essa normalização pode ser realizada pelo conteúdo proteico da amostra, quantificação do DNA mitocondrial ou atividade da citrato sintase.
  8. Quando o sinal do fluxo de oxigênio (linha vermelha) estiver estável no valor positivo, inicie o protocolo de FCR com a titulação de substratos, inibidores e desacopladores (Figura 3). Todos os reagentes e equipamentos subsequentes são mostrados na Tabela 1.
    1. Adicionar digitonina (5 μg/mL) para permeabilizar a membrana mitocondrial.
    2. Adicione os substratos piruvato (5 mM), malato (2 mM) e prolina (10 mM) e aguarde até que o fluxo de oxigênio aumente e se estabilize. Para marcar o evento para cada adição de reagente, pressione a tecla F4 no teclado e digite o nome de cada reagente.
    3. Adicionar ADP (5mM) para acoplar a cadeia respiratória mitocondrial e aguardar o aumento e estabilização do fluxo de oxigênio.
    4. Adicionar succinato (10 mM) e aguardar o aumento e estabilização do fluxo de oxigênio.
    5. Adicionar oligomicina (2,5 μM) para inibir a ATP sintase e procurar uma diminuição no fluxo de oxigênio.
    6. Aguarde até que a linha vermelha se estabilize e desacople a transferência de elétrons mitocondriais usando cianeto de fenilhidrazona carbonil-4-(trifluorometoxi) (FCCP) com títulos de 0,25 μM até que o consumo máximo de oxigênio seja atingido, demonstrado pelo aumento da linha vermelha. Após a estabilização do fluxo de oxigênio, comece a adicionar os inibidores de cada complexo, um de cada vez.
    7. Adicionar rotenona (0,5 μM), um inibidor do complexo I. Aguarde a diminuição e estabilização do fluxo de oxigênio para adicionar o próximo inibidor.
    8. Adicionar Malonato (5 mM), um inibidor do complexo II. Aguarde a diminuição e estabilização do fluxo de oxigênio para adicionar o próximo inibidor.
    9. Finalmente, adicionar Antimicina (2,5 μM), um inibidor do complexo III. Aguarde a diminuição seguida do aumento e estabilização do fluxo de oxigênio.
      NOTA: O fluxo de oxigénio deve estabilizar-se num valor positivo, mas abaixo do valor para a última inibição dos complexos proteicos mitocondriais.
  9. Ao final da análise, remova todo o conteúdo das câmaras usando uma micropipeta. Conservar a -20 °C para análises futuras, quando necessário.

5. Análise dos dados

  1. Utilizar um pacote de software estatístico apropriado para análise de dados.
  2. Realizar testes t para avaliar as diferenças entre os dois grupos. Para situações envolvendo múltiplos tratamentos, utilizar a Análise de Variância (ANOVA) como teste estatístico27.
  3. Extraia os valores de fluxo de O2 do gráfico gerado pelo software. OXPHOS CI refere-se ao valor do fluxo de O2 após a adição de ADP. OXPHOS CII é obtido subtraindo-se OXPHOS CI&CII - OXPHOS CI. OXPHOS CI&CII é o valor do fluxo de O2 extraído após a adição de succinato. ETS CI&CII é o valor de fluxo O2 após a adição de FCCP. ETS CI = FCCP - Rotenone e ETS CII = Rotenone - Malonate.
  4. Calcular a síntese de ATP como a diferença entre o OXPHOS (P) e o LEAK (L) (P - L)28.
  5. Determinar a Razão de Controle Respiratório (RCR) calculando a razão OXPHOS/LEAK, onde RCR = P/L.11

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Resultados

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Aqui, nós que o fluxo de O2 nos estados OXPHOS CI (P = 0,0341) e OXPHOS CI&II (P = 0,0392) é reduzido em moscas nulas PINK1B9 quando comparado com moscas controle (Figura 4). Esse resultado também foi observado em achados anteriores do nosso grupo 29,30.

CI e CII são componentes-chave do sistema de transporte de elétrons (ETS), no qual o CI é responsável ...

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Discussão

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A HRR é uma técnica poderosa para estudar a respiração mitocondrial e o metabolismo energético em D. melanogaster e outros organismos. Ele fornece uma avaliação detalhada e quantitativa da função mitocondrial, permitindo que os pesquisadores obtenham informações sobre a bioenergética das células. O protocolo aqui apresentado descreve a avaliação da função da cadeia respiratória mitocondrial e da atividade de complexos mitocondriais específicos utilizando o protocolo SUIT em D. melanogaster. O protocolo ...

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Divulgações

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Os autores declaram não haver interesses concorrentes.

Agradecimentos

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Os autores agradecem à Coordenação de Aperfeiçoamento de Pesquisa Pessoal de Nível Superior (CAPES EPIDEMIAS 09 #88887.505377/2020). P.M. (#88887.512821/2020-00) e T.D. (#88887.512883/2020-00) são bolsistas de pesquisa.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
ADPSigma-AldrichA5285Adenosina 5′-difosfato de sódio sal (número CAS 72696-48-1); ≥ 95%; peso molecular = 501,31 g/mol.
Á garKasvK25-1800Para uso bacteriologal
Antimicina-ASigma-AldrichA8674Antimicina A de Streptomyces sp. (número CAS 1397-94-0); peso molecular  540 g/mol;
Albumina de soro bovino (BSA)Sigma-AldrichA7030Albumina de soro bovino (número CAS 9048-46-8); pH 7,0 ≥ 98%
Software DatlabOroboros Instruments, Innsbruck, Áustria20700Software para aquisição e análise de dados
DigitoninSigma-AldrichD 5628Número CAS 11024-24-1
Água
destiladaDrosophila melanogaster cepa w[*] Pink1[B9]/FM7i, P{w[+mC]=ActGFP}JMR3Obtido de Bloomington Drosophila stock center
Drosophila melanogaster cepa  w1118Obtido  da Universidade Federal de Santa Maria
EGTASigma-AldrichE8145Ácido etilenoglicol-bis(2-aminoetiléter)-N,N,N',N'-tetracético (número CAS 13638-13-3); ≥ 97%; peso molecular =468,28 g/mol
FCCPSigma-AldrichC2920Cianeto de carbonila 4- (trifluorometoxi)fenilhidrazona  (número CAS 370-86-5); ≥ 98% (TLC), pó 
GraphPad Prism versão 8.0.1.Software para aquisição e análise de dados
HepesSigma-AldrichH4034Ácido 4-(2-hidroxietil)piperazina-1-etanossulfônico (número CAS 7365-45-9); ≥ 99,5% (titulação), testados em cultura de células; peso molecular = 238,30 g/mol
Respirômetro de alta resolução Oxígrafo O2KOroboros Instruments, Innsbruck, Áustria10022-02Kit de respirômetro Startup O2K
KH2PO4Sigma-AldrichP5379Fosfato monopotássico (número CAS 7778-77-0); Reagente Plus, peso molecular = 136,09 g/mol
KOHSigma-Aldrich211473hidróxido de potássio (número CAS 1310-58-3); Reagente ACS, ≥ 85%, pellets
MalatoSigma-AldrichM1296Ácido malônico (número CAS 141-82-2); 99%, peso molecular = 104,06 g/mol). Uma solução é ajustada em pH para aproximadamente 7,0.
Ácido málicoSigma-AldrichM1000(S)-(&menos;)-2-Hidroxisuccínico ≥ 95% ; peso molecular = 134,09 g/mol
MESSigma-AldrichM3671ácido 2-(N-morfolino)etanossulfônico (número CAS 4432-31-9); ≥ 99% (titulação); peso molecular = 195,24 g/mol
MgCl2Sigma-AldrichM8266Cloreto de magnésio (número CAS 7786-30-3); anidro, ≥ 98%, peso molecular = 95,21 g/mol
Tubos de microcentrífugaEppendorf
O2KInstrumentos Oroboros, Innsbruck, Áustria20820-03Seringas Hamilton com diferentes volumes
OligomicinaSigma-AldrichO 4876Oligomicina de  Streptomyces diastatochromogenes (número CAS  1404-19-9); ≥ 90% de base de oligomicinas totais (HPLC)
Pistilo para homogeneização
ProlineSigma-AldrichP0380L-Proline (número CAS 147-85-3); pó; 99%; peso molecular = 115,13 g/mol
PiruvatoSigma-AldrichP2256Piruvato de sódio (número CAS 113-24-6), ≥ 99%; peso molecular = 110,04 g/mol
RotenonaSigma-AldrichR8875Rotetone (número CAS 83-79-4); ≥ 95%, peso molecular 394,42 g/mol
SuccinatoSigma-AldrichS 2378Succinato de sódio dibásico hexahidratado (número CAS 6106-21-4); ≥ 99%
de sacaroseMerck107.651.000sacarose para uso em microbiologia (número CAS 57-50-1)
TaurinaSigma-AldrichT0625Número CAS 107-35-7
Conjunto de titulação

Referências

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