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Artigo de método

Analisando a função mitocondrial em um mutanteB9-nulo de Drosophila melanogaster PINK1 usando respirometria de alta resolução

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DOI:

10.3791/65664

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10 de novembro de 2023

 ,  , 
1Laboratory of Experimental Biochemistry and Toxicology, Department of Biochemistry and Molecular Biology, Center of Natural and Exact Sciences, Federal University of Santa Maria, 2Graduate Program in Biological Sciences: Toxicological Biochemistry, Federal University of Santa Maria

* These authors contributed equally

Neste artigo

Resumo

Apresentamos aqui um protocolo de respirometria de alta resolução para análise bioenergética em mutantes PINK1B9-null. O método utiliza o protocolo Substrate-Uncoupler-Inhibitor-Titration (SUIT).

Resumo

Doenças neurodegenerativas, incluindo a doença de Parkinson (DP), e distúrbios celulares, como o câncer, são alguns dos distúrbios que interrompem o metabolismo energético com comprometimento das funções mitocondriais. As mitocôndrias são organelas que controlam tanto o metabolismo energético quanto os processos celulares envolvidos na sobrevivência e morte celular. Por esta razão, abordagens para avaliar a função mitocondrial podem oferecer informações importantes sobre as condições celulares em processos patológicos e fisiológicos. Nesse sentido, protocolos de respirometria de alta resolução (HRR) permitem avaliar toda a função da cadeia respiratória mitocondrial ou a atividade de complexos mitocondriais específicos. Além disso, o estudo da fisiologia mitocondrial e da bioenergética requer modelos geneticamente e experimentalmente tratáveis, como Drosophila melanogaster.

Esse modelo apresenta várias vantagens, como sua semelhança com a fisiologia humana, seu rápido ciclo de vida, fácil manutenção, custo-benefício, alta capacidade de rendimento e um número minimizado de preocupações éticas. Esses atributos coletivamente o estabelecem como uma ferramenta inestimável para dissecar processos celulares complexos. O presente trabalho explica como analisar a função mitocondrial utilizando o mutante Drosophila melanogaster PINK1 B9-null. O gene pink1 é responsável por codificar a putativa quinase 1 induzida por PTEN, através de um processo reconhecido como mitofagia, que é crucial para a remoção de mitocôndrias disfuncionais da rede mitocondrial. Mutações nesse gene têm sido associadas a uma forma familiar autossômica recessiva de início precoce da DP. Esse modelo pode ser utilizado para estudar as disfunções mitocondriais envolvidas na fisiopatologia da DP.

Introdução

As mitocôndrias são organelas celulares que controlam funções importantes, incluindo regulação apoptótica, homeostase do cálcio e participação em vias biossintéticas. Por possuírem material genético autônomo, são capazes de contribuir para os processos de manutenção e reparo celular. Sua estrutura abriga a cadeia de transporte de elétrons e a fosforilação oxidativa, ambas cruciais para a energia celular 1,2,3. Em particular, o controle energético é obtido através da produção de adenosina trifosfato (ATP) via fosforilação oxidativa (OXPHOS)2. A interrupção do metabolismo energético com comprometimento das funções mitocondriais ocorre tanto na sobrevivência quanto na mortecelular4,5, frequentemente associada a uma ampla gama de patologias humanas, como o câncer, e doenças neurodegenerativas, como a Doença de Parkinson (DP)3,6.

A DP é uma doença crônica, progressiva e neurológica. A causa primária dessa doença é a morte das células cerebrais, principalmente da substância negra, responsáveis pela produção do neurotransmissor dopamina, que controla o movimento 6,7,8. A primeira observação que ligava o parkinsonismo à disfunção mitocondrial foi feita em 1988, em modelos experimentais utilizando toxinas inibidoras da cadeia respiratória do Complexo I9.

Atualmente, existem vários métodos para avaliar a disfunção mitocondrial 10,11,12,1 3; no entanto, comparada às abordagens convencionais, a respirometria de alta resolução (FCR) apresenta sensibilidade e vantagens superiores 13,14. Por exemplo, protocolos de FCR permitem avaliar toda a função da cadeia respiratória mitocondrial ou a atividade de complexos mitocondriais específicos14,15. As disfunções mitocondriais podem ser avaliadas em células intactas, mitocôndrias isoladas ou mesmo ex vivo 10,11,13,14.

As disfunções mitocondriais estão intimamente associadas a muitos processos patológicos e fisiológicos. Portanto, é importante estudar a fisiologia mitocondrial e a bioenergética usando sistemas modelo geneticamente e experimentalmente tratáveis. Nesse sentido, a pesquisa sobre Drosophila melanogaster, a mosca-da-fruta, tem várias vantagens. Esse modelo compartilha características e processos celulares fundamentais com humanos, incluindo o uso de DNA como material genético, organelas comuns e vias moleculares conservadas envolvidas no desenvolvimento, imunidade e sinalização celular. Além disso, as moscas-das-frutas apresentam ciclo de vida rápido, fácil manutenção, baixo custo, alto rendimento e menos preocupações éticas, constituindo-se em uma ferramenta valiosa para dissecar processos celulares complexos 16,17,18,19,20.

Além disso, um homólogo do gene putativo quinase 1 (pink1) induzido por PTEN é expresso em D. melanogaster. Desempenha um papel crucial na remoção de mitocôndrias danificadas através do processo de mitofagia8. Em humanos, mutações nesse gene predispõem a uma forma familiar autossômica recessiva de DP associada à disfunção mitocondrial 8,21,22,23. Consequentemente, a mosca-da-fruta é um poderoso modelo animal para estudos sobre a fisiopatologia da DP e triagem de candidatos a fármacos com foco na disfunção mitocondrial e bioenergética. Portanto, o presente trabalho explica como analisar a função mitocondrial em um modelo de DP de D. melanogaster utilizando a técnica de HRR no OROBOROS com o protocolo Substrate-Uncoupler-Inhibitor-Titration (SUIT).

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Protocolo

Foram utilizadas as cepas w1118 (branca) e w[*] Pink1[B9]/FM7i, P{w[+mC]=ActGFP}JMR3 (referida como Pink1B9) (FlyBase ID: FBgn0029891) do centro de estoque Bloomington Drosophila (número de identificação: 34749). Neste estudo, mutantes machos de D. melanogasterPINK1 B9-null são comparados com machos de D. melanogaster da cepa w1118, que é usada como grupo controle (background genético). Outros parâmetros devem ser analisados concomitantemente aos experimentos de respirometria para garantir que as moscas tenham o genótipo correto (Pink1B9/Y), como deformidades torácicas e problemas de locomoção, que são bem descritos para moscas mutantes Pink1 B924,25,26.

1. Animais e alojamento

  1. Manter as moscas em frascos de vidro contendo 10 mL de dieta padrão (levedura 1,73%, farinha de soja 0,9%, farinha de milho 7,3%, ágar 0,5%, xarope de milho 7,6% e ácido propiônico 0,48%) em temperatura e umidade constantes (25 °C e 60%, respectivamente), com ciclo claro/escuro de 12 h:12 h.
  2. Para cada experimento, utilizar duas moscas com idade entre 1 e 3 dias pós-eclosão.
    NOTA: As moscas virgens mutantes PINK1B9-null foram cruzadas com w1118 machos para obter os machos F1 com genótipo Pink1B9/Y.

2. Preparo da amostra

  1. Prepare o buffer MiR05 conforme descrito na Tabela 1.
  2. Anestesiar as moscas no gelo e transferi-las para tubos de microcentrífuga (duas moscas por tubo).
  3. Em cada tubo, adicionar 200 μL de tampão MiR05 refrigerado e homogeneizar as moscas. Homogeneizar manualmente, aplicando pressão suave (aproximadamente 4-6 golpes do pilão) para evitar a desintegração das mitocôndrias.

3. Calibração por respirometria de alta resolução de sensores polarográficos de oxigênio

NOTA: As câmaras OROBOROS têm um volume total de aproximadamente 2 mL. A calibração é necessária para garantir que o fluxo de oxigênio seja próximo de 0 pmol para iniciar o ensaio.

  1. Iniciando a calibração, adicionar 2 mL de MiR05 à câmara. Cubra a câmara com a rolha não deixando bolhas de ar; Em seguida, puxe cuidadosamente a rolha para formar uma única bolha de ar.
  2. Abra o software OROBOROS Dat.Lab. Insira uma temperatura de 25 °C no campo Temperatura do bloco e clique em Conectar ao Oxygraph-2k (Figura 1A).
  3. Clique e selecione a pasta onde a calibração deve ser salva e clique em Salvar.
  4. Quando uma nova janela se abrir, nomeie o experimento e as amostras (se estiver calibrando, basta digitar o nome calibração) e clique em Salvar.
  5. Vá para o menu Layout e escolha a primeira opção: 01 Calibration Exp. Gr.3 - Temp como mostra a Figura 1B.
  6. Aguarde até que o programa redirecione para o layout de calibração, aguarde até que a linha vermelha mostre uma linha reta padrão com pontos em torno de 0 pmol. Em seguida, selecione dois pontos: um para a câmara A e outro para a câmara B (Figura 1C) quando a linha vermelha estiver exatamente em zero.
    NOTA: Os pontos selecionados devem ter fluxo de oxigênio (linha vermelha) em torno de 0.
    1. Para marcar os pontos de ambas as câmaras, selecione a concentração O2 à direita da tela, selecione o ponto marcado e copie os valores de temperatura e pressão barométrica relativos ao ponto. Cole esses valores nas caixas abaixo e clique em Calibrar e Copiar para Área de Transferência no canto inferior direito da tela, como mostra a Figura 2.
    2. Execute esse processo para ambas as câmaras (A e B), vá para o menu Arquivo e selecione Salvar e Desconectar.
      NOTA: Após o processo de calibração, o programa redirecionará o usuário para a tela inicial para que o software esteja pronto para iniciar o teste HRR. Para este teste, utilizaremos o protocolo SUIT.

4. Protocolo SUIT

  1. Com a calibração concluída, retire as rolhas e abra as câmaras.
  2. Lave as rolhas (segurando a ponta que não toca na amostra) e as câmaras com etanol 100%, etanol 70% e água destilada, nessa ordem.
    Observação : repita o processo para cada alteração de amostra.
  3. Homogeneizar as moscas em 200 μL de tampão, colocar todo o conteúdo da amostra na câmara usando uma micropipeta e realocar a rolha na câmara, tomando cuidado para não criar bolhas de ar.
    NOTA: Se se formarem bolhas de ar, remova a rolha suavemente e adicione 100 μL de tampão MIR05.
  4. Clique no menu Layout e selecione a opção 05 Fluxo por Volume Corrigido como mostra a Figura 1B.
  5. Aguarde para ser redirecionado para uma nova janela. Clique em Salvar para selecionar a pasta onde o experimento será salvo.
  6. Aguarde a abertura de outra nova janela. Nomeie o experimento no espaço Código Experimental. Em seguida, nomeie cada amostra em sua respectiva câmara A e B no campo Amostra e defina o campo Unidade como unidade.
    NOTA: Outras unidades também podem ser escolhidas, por exemplo, Milhões de células ou mg.
  7. Considerando que este protocolo utiliza duas moscas (2 unidades) e o volume da câmara é de 2 mL, no campo Concentração , defina 1 por mL (Figura 1D).
    NOTA: Aqui, a quantidade de amostra foi normalizada pelo número de moscas; no entanto, essa normalização pode ser realizada pelo conteúdo proteico da amostra, quantificação do DNA mitocondrial ou atividade da citrato sintase.
  8. Quando o sinal do fluxo de oxigênio (linha vermelha) estiver estável no valor positivo, inicie o protocolo de FCR com a titulação de substratos, inibidores e desacopladores (Figura 3). Todos os reagentes e equipamentos subsequentes são mostrados na Tabela 1.
    1. Adicionar digitonina (5 μg/mL) para permeabilizar a membrana mitocondrial.
    2. Adicione os substratos piruvato (5 mM), malato (2 mM) e prolina (10 mM) e aguarde até que o fluxo de oxigênio aumente e se estabilize. Para marcar o evento para cada adição de reagente, pressione a tecla F4 no teclado e digite o nome de cada reagente.
    3. Adicionar ADP (5mM) para acoplar a cadeia respiratória mitocondrial e aguardar o aumento e estabilização do fluxo de oxigênio.
    4. Adicionar succinato (10 mM) e aguardar o aumento e estabilização do fluxo de oxigênio.
    5. Adicionar oligomicina (2,5 μM) para inibir a ATP sintase e procurar uma diminuição no fluxo de oxigênio.
    6. Aguarde até que a linha vermelha se estabilize e desacople a transferência de elétrons mitocondriais usando cianeto de fenilhidrazona carbonil-4-(trifluorometoxi) (FCCP) com títulos de 0,25 μM até que o consumo máximo de oxigênio seja atingido, demonstrado pelo aumento da linha vermelha. Após a estabilização do fluxo de oxigênio, comece a adicionar os inibidores de cada complexo, um de cada vez.
    7. Adicionar rotenona (0,5 μM), um inibidor do complexo I. Aguarde a diminuição e estabilização do fluxo de oxigênio para adicionar o próximo inibidor.
    8. Adicionar Malonato (5 mM), um inibidor do complexo II. Aguarde a diminuição e estabilização do fluxo de oxigênio para adicionar o próximo inibidor.
    9. Finalmente, adicionar Antimicina (2,5 μM), um inibidor do complexo III. Aguarde a diminuição seguida do aumento e estabilização do fluxo de oxigênio.
      NOTA: O fluxo de oxigénio deve estabilizar-se num valor positivo, mas abaixo do valor para a última inibição dos complexos proteicos mitocondriais.
  9. Ao final da análise, remova todo o conteúdo das câmaras usando uma micropipeta. Conservar a -20 °C para análises futuras, quando necessário.

5. Análise dos dados

  1. Utilizar um pacote de software estatístico apropriado para análise de dados.
  2. Realizar testes t para avaliar as diferenças entre os dois grupos. Para situações envolvendo múltiplos tratamentos, utilizar a Análise de Variância (ANOVA) como teste estatístico27.
  3. Extraia os valores de fluxo de O2 do gráfico gerado pelo software. OXPHOS CI refere-se ao valor do fluxo de O2 após a adição de ADP. OXPHOS CII é obtido subtraindo-se OXPHOS CI&CII - OXPHOS CI. OXPHOS CI&CII é o valor do fluxo de O2 extraído após a adição de succinato. ETS CI&CII é o valor de fluxo O2 após a adição de FCCP. ETS CI = FCCP - Rotenone e ETS CII = Rotenone - Malonate.
  4. Calcular a síntese de ATP como a diferença entre o OXPHOS (P) e o LEAK (L) (P - L)28.
  5. Determinar a Razão de Controle Respiratório (RCR) calculando a razão OXPHOS/LEAK, onde RCR = P/L.11

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Resultados

Aqui, nós que o fluxo de O2 nos estados OXPHOS CI (P = 0,0341) e OXPHOS CI&II (P = 0,0392) é reduzido em moscas nulas PINK1B9 quando comparado com moscas controle (Figura 4). Esse resultado também foi observado em achados anteriores do nosso grupo 29,30.

CI e CII são componentes-chave do sistema de transporte de elétrons (ETS), no qual o CI é responsável ...

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Discussão

A HRR é uma técnica poderosa para estudar a respiração mitocondrial e o metabolismo energético em D. melanogaster e outros organismos. Ele fornece uma avaliação detalhada e quantitativa da função mitocondrial, permitindo que os pesquisadores obtenham informações sobre a bioenergética das células. O protocolo aqui apresentado descreve a avaliação da função da cadeia respiratória mitocondrial e da atividade de complexos mitocondriais específicos utilizando o protocolo SUIT em D. melanogaster. O protocolo ...

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Divulgações

Os autores declaram não haver interesses concorrentes.

Agradecimentos

Os autores agradecem à Coordenação de Aperfeiçoamento de Pesquisa Pessoal de Nível Superior (CAPES EPIDEMIAS 09 #88887.505377/2020). P.M. (#88887.512821/2020-00) e T.D. (#88887.512883/2020-00) são bolsistas de pesquisa.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
ADPSigma-AldrichA5285Adenosina 5′-difosfato de sódio sal (número CAS 72696-48-1); ≥ 95%; peso molecular = 501,31 g/mol.
Á garKasvK25-1800Para uso bacteriologal
Antimicina-ASigma-AldrichA8674Antimicina A de Streptomyces sp. (número CAS 1397-94-0); peso molecular  540 g/mol;
Albumina de soro bovino (BSA)Sigma-AldrichA7030Albumina de soro bovino (número CAS 9048-46-8); pH 7,0 ≥ 98%
Software DatlabOroboros Instruments, Innsbruck, Áustria20700Software para aquisição e análise de dados
DigitoninSigma-AldrichD 5628Número CAS 11024-24-1
Água
destiladaDrosophila melanogaster cepa w[*] Pink1[B9]/FM7i, P{w[+mC]=ActGFP}JMR3Obtido de Bloomington Drosophila stock center
Drosophila melanogaster cepa  w1118Obtido  da Universidade Federal de Santa Maria
EGTASigma-AldrichE8145Ácido etilenoglicol-bis(2-aminoetiléter)-N,N,N',N'-tetracético (número CAS 13638-13-3); ≥ 97%; peso molecular =468,28 g/mol
FCCPSigma-AldrichC2920Cianeto de carbonila 4- (trifluorometoxi)fenilhidrazona  (número CAS 370-86-5); ≥ 98% (TLC), pó 
GraphPad Prism versão 8.0.1.Software para aquisição e análise de dados
HepesSigma-AldrichH4034Ácido 4-(2-hidroxietil)piperazina-1-etanossulfônico (número CAS 7365-45-9); ≥ 99,5% (titulação), testados em cultura de células; peso molecular = 238,30 g/mol
Respirômetro de alta resolução Oxígrafo O2KOroboros Instruments, Innsbruck, Áustria10022-02Kit de respirômetro Startup O2K
KH2PO4Sigma-AldrichP5379Fosfato monopotássico (número CAS 7778-77-0); Reagente Plus, peso molecular = 136,09 g/mol
KOHSigma-Aldrich211473hidróxido de potássio (número CAS 1310-58-3); Reagente ACS, ≥ 85%, pellets
MalatoSigma-AldrichM1296Ácido malônico (número CAS 141-82-2); 99%, peso molecular = 104,06 g/mol). Uma solução é ajustada em pH para aproximadamente 7,0.
Ácido málicoSigma-AldrichM1000(S)-(&menos;)-2-Hidroxisuccínico ≥ 95% ; peso molecular = 134,09 g/mol
MESSigma-AldrichM3671ácido 2-(N-morfolino)etanossulfônico (número CAS 4432-31-9); ≥ 99% (titulação); peso molecular = 195,24 g/mol
MgCl2Sigma-AldrichM8266Cloreto de magnésio (número CAS 7786-30-3); anidro, ≥ 98%, peso molecular = 95,21 g/mol
Tubos de microcentrífugaEppendorf
O2KInstrumentos Oroboros, Innsbruck, Áustria20820-03Seringas Hamilton com diferentes volumes
OligomicinaSigma-AldrichO 4876Oligomicina de  Streptomyces diastatochromogenes (número CAS  1404-19-9); ≥ 90% de base de oligomicinas totais (HPLC)
Pistilo para homogeneização
ProlineSigma-AldrichP0380L-Proline (número CAS 147-85-3); pó; 99%; peso molecular = 115,13 g/mol
PiruvatoSigma-AldrichP2256Piruvato de sódio (número CAS 113-24-6), ≥ 99%; peso molecular = 110,04 g/mol
RotenonaSigma-AldrichR8875Rotetone (número CAS 83-79-4); ≥ 95%, peso molecular 394,42 g/mol
SuccinatoSigma-AldrichS 2378Succinato de sódio dibásico hexahidratado (número CAS 6106-21-4); ≥ 99%
de sacaroseMerck107.651.000sacarose para uso em microbiologia (número CAS 57-50-1)
TaurinaSigma-AldrichT0625Número CAS 107-35-7
Conjunto de titulação

Referências

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Analisando a função mitocondrial em um mutanteB9-nulo de Drosophila melanogaster PINK1 usando respirometria de alta resolução
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