Microscopia de dois fótons sensível à polarização para caracterização estrutural amiloide livre de marcação

Resumo

Este trabalho descreve como a microscopia de dois fótons sensível à polarização pode ser aplicada para caracterizar a organização local dentro de superestruturas-esferulitos amiloides livres de marcação. Também descreve como preparar e medir a amostra, montar a configuração necessária e analisar os dados para obter informações sobre a organização local das fibrilas amiloides.

Resumo

Em comparação com sua contraparte de um fóton, a excitação de dois fótons é benéfica para experimentos de bioimagem devido à sua menor fototoxicidade, penetração mais profunda do tecido, operação eficiente em sistemas densamente compactados e fotoseleção angular reduzida de fluoróforos. Assim, a introdução da análise de polarização em microscopia de fluorescência de dois fótons (MAP2) fornece uma determinação mais precisa da organização molecular em uma amostra em comparação com métodos de imagem padrão baseados em processos ópticos lineares. Neste trabalho, enfocamos a 2PFM sensível à polarização (ps-2PFM) e sua aplicação na determinação da ordenação molecular dentro de bioestruturas complexas-esferulitos amiloides. Doenças neurodegenerativas como Alzheimer ou Parkinson são frequentemente diagnosticadas através da detecção de agregados de proteínas amiloides-formadas devido a um processo de enovelamento incorreto de proteínas. A exploração de sua estrutura leva a uma melhor compreensão de seu caminho de criação e, consequentemente, ao desenvolvimento de métodos diagnósticos mais sensíveis. Este trabalho apresenta os ps-2PFM adaptados para a determinação da ordenação de fibrilas locais no interior de esferulitos insulínicos bovinos e agregados proteicos amiloidogênicos esféricos. Além disso, comprovamos que a técnica proposta pode resolver a organização tridimensional das fibrilas no interior da esferulite.

Introdução

Nas últimas décadas, embora tenha havido um desenvolvimento significativo de inúmeras técnicas de microscopia de fluorescência para bioimagem de proteínas e seus^agregados1, poucas têm sido utilizadas para resolver sua ordenação local dentro da amostra ^2,3. A microscopia de imagem de tempo de vida de fluorescência⁴ foi usada para estudar a heterogeneidade estrutural intrínseca de superestruturas-esferulitos amiloides. Além disso, a determinação quantitativa da ordenação local dentro de bioestruturas complexas e densamente compactadas, como esferulitos, poderia ser resolvida usando métodos sensíveis à polarização³. No entanto, as técnicas padrão de fluorescência com penetração de tecido superficial são limitadas, uma vez que o uso de comprimentos de onda UV-VIS para excitar fluoróforos in vivo leva a um alto espalhamento de luz tecidual⁵. Além disso, essas imagens geralmente requerem o projeto e a ligação de sondas fluorescentes específicas a uma biomolécula alvo, aumentando assim o custo e a quantidade de trabalho necessário para realizar imagens.

Recentemente, para abordar essas questões, nossa equipe adaptou microscopia de fluorescência excitada de dois fótons sensível à polarização (ps-2PFM) para imagens livres de marcação de estruturas biológicas ^6,7. A MAPP Ps-2 permite medir a dependência da intensidade de fluorescência de dois fótons na direção de polarização linear do feixe de excitação e analisar a polarização da fluorescência emitida⁸. A implementação desta técnica requer a complementação do caminho de excitação padrão do microscópio multifóton (Figura 1) com uma placa de meia-onda para controlar o plano de polarização da luz. Em seguida, gráficos polares, retratando a dependência da intensidade de fluorescência excitada de dois fótons na polarização do feixe de laser de excitação, são criados a partir de sinais coletados por dois fotodiodos de avalanche, coletando assim os dois componentes mutuamente perpendiculares da polarização de fluorescência.

A última etapa é o processo de análise dos dados, levando em conta o impacto dos elementos ópticos, como espelhos dicroicos ou uma objetiva de alta abertura numérica, na polarização. Devido à natureza do processo de dois fótons, este método fornece tanto uma foto-seleção angular reduzida quanto uma resolução axial aprimorada, já que a excitação de dois fótons de fluoróforos fora do plano focal é probabilisticamente limitada. Também foi comprovado que métodos semelhantes poderiam ser implementados com sucesso para imagens in vivo de sondas de infravermelho próximo (NIR) para imagens de tecidos profundos⁹. A Ps-2PFM foi previamente aplicada em fluoróforos de imagem em membranas celulares¹⁰ e DNA^11,12, bem como marcadores fluorescentes não padronizados de sistemas biológicos, como nanopartículas de ouro¹³. No entanto, em todos esses exemplos, as informações sobre a organização de biomoléculas foram obtidas indiretamente e exigiram uma orientação mútua pré-definida entre um fluoróforo e uma biomolécula.

Em um de nossos trabalhos recentes, mostramos que a ps-2PFM pode ser aplicada com sucesso para determinar a polarização local da autofluorescência de superestruturas amiloides e fluorescência a partir de tioflavina T, um corante amilóide-específico, ligado a fibrilas amiloides em esferulitos⁶. Além disso, em outro, comprovamos que a ps-2PFM poderia ser utilizada para detectar a orientação da fibrila amiloide dentro de esferulitos amiloides em um regime de tamanho sub-mícron, o que foi confirmado pela correlação com imagens de microscopia eletrônica de transmissão (MET)⁷. A obtenção deste resultado foi possível graças a i) autofluorescência intrínseca de esferulitos-amiloides, quando excitadas com um ou dois fótons, exibem autofluorescência intrínseca com máximos de emissão localizados em uma faixa de 450 a 500 nm e seções transversais de absorção de dois fótons comparáveis com corantes fluorescentes padrão¹⁴, ii) modelos matemáticos introduzidos anteriormente para descrever como ps-2PEF de corantes marcando membranas biológicas e estruturas de DNA poderiam ser aplicados a fluorescência exibida por esferulitos e corantes a eles ligados ^8,11,15. Assim, antes de prosseguir com a análise, é altamente recomendável examinar a teoria necessária descrita no texto principal e nas informações de apoio de nosso primeiro artigo sobre este tópico⁶. Apresentamos aqui o protocolo de aplicação da técnica de ps-2PFM para a caracterização estrutural amiloide livre de rótulos de esferulitos de insulina bovina.

Protocolo

1. Preparar as lâminas do microscópio com esferulites totalmente crescidos

NOTA: Consulte a Tabela de Materiais para obter detalhes sobre todos os materiais, reagentes e equipamentos usados neste protocolo. Todas as soluções foram preparadas com água deionizada (18,2 MΩ·cm a 25 °C) obtida do sistema de purificação de água.

1. Incubar os esferulitos amiloides com base no protocolo descrito por Krebs e cols.16, com algumas modificações, conforme descrito a seguir.
   1. Pesar 10 mg de insulina em pó num tubo de 1,5 ml.
   2. Dissolver o pó com uma alíquota de 1 ml da solução deionizada de H₂O/HCl (pH 1,5).
   3. Selar a amostra com a fita adesiva e colocá-la em um misturador térmico para incubar por 24 h a 70 °C (0 rpm).
      NOTA: Para realizar imagens de amiloides em seu ambiente nativo (isto é, hidratado) e evitar a deformação da amostra devido à desidratação, é necessário preparar lâminas de microscópio de acordo com a seguinte descrição (esquema mostrado na Figura 2).
2. Lave bem a lâmina de vidro do microscópio com água.
3. Mergulhe as lâminas em metanol e deixe-as secar em condições ambientais em um lenço sem poeira.
4. Retirar uma alíquota de 100 μL da solução de esferulito do tubo com uma pipeta automática (passo 1.1.2) e adicioná-la ao poço localizado na área central da lâmina do microscópio.
5. Cubra a solução com uma lamínula, evitando a formação de bolhas de ar.
6. Deposite o suporte ao longo das bordas da tampa na corrediça com uma pipeta automática para selar a solução nativa dos esferulitos.
   NOTA: É de grande importância depositar o suporte deslizante tanto na tampa como nas superfícies deslizantes. Faça isso sob o capô de fumo por causa da toxicidade do solvente volátil (xileno). Veja o inset na Figura 2.
7. Deixe a amostra do microscópio em condições ambientais para que o suporte endureça.
   NOTA: O processo de endurecimento depende da temperatura e umidade, mas deve ser concluído dentro de 12 h.
8. Verifique se os esferulitos de insulina foram formados corretamente usando um microscópio óptico polarizado (POM) com polarizadores cruzados. Examine a amostra procurando um padrão característico de áreas brilhantes, chamado de cruz de Malta, como mostrado na Figura 3.
   NOTA: Os esferulitos amiloides podem ser definidos como superestruturas esféricas caracterizadas por uma morfologia heterogênea com uma estrutura núcleo-casca. Em detalhes, são compostos por núcleo amorfo e fibrilas amiloides de crescimento radial¹⁶. Devido ao caráter anisotrópico das estruturas esferulitas, elas podem interagir distintamente com a luz polarizada (por exemplo, por refração) e alterar sua fase, o que pode ser facilmente observado sob POM com polarizadores cruzados. Este método foi usado para estudar apenas esferulitos completamente desenvolvidos caracterizados por um padrão cruzado Maltase semelhante ao modelo. Consequentemente, agregados ou esferulitos estruturalmente distorcidos foram excluídos de investigações posteriores.

2. Construção e alinhamento do sistema

NOTA: Uma representação esquemática de um microscópio de dois fótons sensível à polarização pode ser encontrada na Figura 1.

1. Instale um laser de femtossegundo com a sintonia de comprimento de onda de saída na faixa de 690-1.080 nm, por exemplo, operando em um laser Ti: Safira bloqueado por modo com pulsos de ~100 fs de taxa de repetição de 80 MHz.
2. Adicione uma placa de meia-onda montada em um estágio de rotação ao caminho de excitação do setup para controlar a polarização da luz incidente no plano de amostra do microscópio XY.
3. Instale o espelho dicroico para cortar o feixe de excitação da óptica de detecção.
   NOTA: As características ópticas de um espelho dicroico devem permitir reflectir o feixe de excitação (para a amostra) na gama de comprimentos de onda NIR e ser simultaneamente transparentes para a gama de comprimentos de onda correspondente à emissão das amostras.
4. Instale um estágio de varredura piezoelétrica para varreduras raster dentro do plano XY para um Z escolhido.
5. Monte a objetiva de imersão de alto NA, por exemplo, uma objetiva de imersão em óleo apocromático 100x/1,4 NA.
   NOTA: Como toda a configuração opera em um modo de epifluorescência, os sinais incidentes e emitidos estão passando pelo mesmo objetivo.
6. No caminho de emissão, adicione um divisor de feixe polarizante que divide a emissão excitada de dois fótons em dois componentes ortogonalmente polarizados (I,_X e I,_Y)
7. Instalar dois fotodiodos de avalanche (APDs) de contagem de fótons em uma configuração que permita coletar a luz transferida e refletida usando o divisor de feixes, respectivamente (Figura 1).
8. Monte filtros de corte dependentes do comprimento de onda corretos no caminho de excitação e emissão do sistema, por exemplo, um filtro passa-longa de 800 nm diretamente no caminho óptico de excitação e um filtro passa-curta de 700 no caminho de emissão.
   NOTA: Analisar os espectros de emissão da esferulita para que qualquer contribuição potencial da segunda geração harmônica (SHG) ou da luz laser possa ser excluída usando os filtros de emissão corretos. Também é importante notar que este sistema também deve permitir medições de SHG sensível à polarização, que poderia ser usada para resolver a ordenação de biomoléculas dentro das amostras. No entanto, a análise dos dados do sinal de SHG difere da fluorescência, que, mais detalhadamente, foi descrita por Aït-Belkacem et ^al.17.
9. Alinhe todo o sistema (usando o modo de alinhamento construído em muitos lasers) até que intensidades de sinal semelhantes sejam coletadas usando ambos os fotodiodos.
10. Verifique se o feixe de excitação focalizado pela objetiva alta do NA e fotografado em uma câmera tem uma forma circular concêntrica, conforme apresentado na Figura 4A.
11. Ajuste o tempo de varredura e a potência correspondente para minimizar o dano induzido pelo laser incidente na amostra. A queima pontual exemplar é apresentada na Figura 4B. Meça a potência nominal usando um medidor de potência portátil digital conectado a um sensor de potência de fotodiodo localizado na entrada do corpo do microscópio.
    NOTA: Espécimes biológicos podem ser facilmente queimados devido à iluminação a laser. Neste caso, a faixa de potência de 100 -900 μW (no ponto focal da lente objetiva) mostrou-se um excelente trade-off entre estabilidade da amostra e emissão intensa.
12. Antes da medição da amostra, teste a qualidade do alinhamento da óptica com uma amostra de referência isotrópica (por exemplo, fluoresceína incorporada no polímero amorfo). Para efectuar a verificação da calibração, siga o procedimento descrito na secção 3 utilizando uma referência isotrópica em vez de uma amostra amiloide.
    NOTA: Partindo do pressuposto de que o arranjo da microscopia é idealmente ajustado para a amostra com propriedades isotrópicas, ambos os componentes de emissão de 2P (I_{, X} e_{I, Y}) detectados com duas DPAs devem ser caracterizados pela mesma intensidade (Figura 4C).

3. Medição dos esferulitos de insulina bovina

OBS: Para realizar todas as medidas descritas do ps-2PF, foi utilizado um software manuscrito, que controla as posições do estágio piezelétrico e da placa de meia-onda e coleta o sinal de ambos os fotodiodos, permitindo a plotagem dos scans XY (varreduras raster) de áreas selecionadas em lâminas de microscópio, bem como gráficos polares a partir de coordenadas específicas da amostra. Notas adicionais também foram adicionadas ao protocolo, o que permitirá que os usuários realizem a medição sem ele, uma vez que tanto o estágio piezo-estágio quanto o estágio de rotação usados para girar a placa de meia-onda podem ser controlados usando seus próprios controladores ou software correspondente. Ainda assim, é altamente recomendável escrever um algoritmo combinando o ângulo de rotação de uma placa de meia-onda com a intensidade de 2PEF coletada com ambos os fotodiodos, uma vez que essa correlação (gráficos polares) é crucial para a análise adequada dos dados, resultando em informações estruturais.

1. Monte o espécime com os esferulitos no palco piezoelétrico (imobilize a lâmina de vidro com fita adesiva). Certifique-se de montá-lo de forma que um lado de vidro fino (lamínula) esteja voltado para o objetivo, pois objetivos numéricos altos são caracterizados por distâncias de trabalho relativamente curtas.
   NOTA: Como a imersão em óleo é usada, uma pequena gota de óleo mineral deve ser aplicada na objetiva antes da montagem e focalização do espécime.
2. Ao mudar as posições XY e Z usando botões de microscópio, concentre a objetiva em um dos esferulitos encontrados na solução, mas esteja ciente de que, como os diâmetros da esferulita estão tipicamente na faixa de dezenas de μm, concentre-se dentro da área central de toda a estrutura. Procure halos pretos e brancos ao redor da esferulita específica como sinais de foco inferior e superior, respectivamente. Ajuste o eixo "Z" para estar entre esses extremos.
   OBS: É importante encontrar uma amostra isolada sem defeitos estruturais. Esferulitos extremamente pequenos podem se afastar devido à tensão do material introduzida pelo objetivo, enquanto as maiores estruturas são provavelmente agregadas ou altamente distorcidas.
3. Centralize a esferulito no campo de visão do plano microscópico observado e determine o tamanho da varredura XY observando quantos passos de piezoestágio nas direções X e Y (exibidos no controlador de piezoestágio ou em seu software) são necessários para cobrir a área de toda a estrutura.
   NOTA: Recomenda-se configurar o sistema de tal forma que o início da varredura XY esteja localizado perto de um dos cantos da esferulito e coincida com a posição zero do estágio (X e Y = 0)
4. Ajuste os seguintes parâmetros de varredura:
   1. Ajustar a polarização do feixe de excitação e girar a placa de meia-onda para obter a polarização correspondente aos eixos "X" e "Y" do plano da amostra do microscópio.
      NOTA: Isso pode ser feito medindo os gráficos polares de meio fluorescente isotrópico, como a fluoresceína. Para tais materiais, a intensidade máxima de fluorescência é paralela à polarização do feixe de excitação; assim, a rotação da placa de meia-onda ajusta a polarização com os eixos X e Y no plano de observação, também denotados como eixo X e Y em gráficos polares como na Figura 4C. Gráficos polares completos podem ser medidos coletando a intensidade medida de 2PEF em ambos os fotodiodos para rotação de 180° da placa de meia-onda (rotação de 360° da polarização da luz de excitação) e correlacionando a intensidade com o ângulo de polarização da luz de excitação. Isso pode ser feito manualmente, medindo a intensidade de emissão para cada ângulo de placa de meia-onda separadamente e, em seguida, montando-o em um gráfico polar em um software de análise de dados ou automaticamente, usando software dedicado ou auto-escrito.
   2. Ajuste os parâmetros do piezoestágio: velocidade de varredura, passo e alcance para cobrir a área de todo o esferulito.
      NOTA: O intervalo de varredura deve ser maior do que o diâmetro da esferulita para enquadrar totalmente toda a superestrutura dentro da varredura raster. Baixa velocidade de digitalização e passo permitem que os usuários obtenham imagens de alta qualidade; no entanto, isso pode resultar na queima da amostra. Portanto, um trade-off dependente do tamanho da esferulita é necessário. Esses parâmetros não podem ser aplicados universalmente. Parâmetros exemplares usados na Figura 5A: faixa de varredura 45 x 45 μm, etapa de varredura de 1 μm e velocidade de varredura de 2 μm/s.
5. Abra o obturador, ligue os fotodiodos e colete componentes de emissão 2P para cada passo da área de varredura selecionada - para o feixe de excitação polarizado correspondentemente ao X e, em seguida, aos eixos Y. Imagens exemplares de esferulitos de insulina por autofluorescência excitada de dois fótons (2PAF) são apresentadas na Figura 5A.
   NOTA: A medição de varreduras raster requer a correlação das coordenadas do estágio piezo com os componentes de emissão coletados e coletados, o que pode ser feito manualmente, medindo a intensidade em cada ponto da área selecionada e, em seguida, montando-a em uma matriz 2D, ou automaticamente, através de um software auto-escrito. As varreduras raster podem ser apresentadas como uma soma da intensidade e dos componentes de emissão ou distintamente para um componente de emissão específico. Como são altamente dependentes da estrutura, distorções estruturais dentro dos esferulitos são facilmente visíveis. No entanto, devido ao movimento do estágio do microscópio, algumas amostras podem se afastar do campo de visão. Portanto, as imagens precisam ser rastreadas em busca de artefatos. É necessário verificar a posição da esferulita antes e depois da varredura.
6. Para realizar a análise de polarização total a partir do ponto específico da amostra, desligue o feixe de excitação.
7. Posteriormente, escolher coordenadas específicas de piezoestágio correspondentes ao local escolhido na esferulito onde a informação sobre a orientação das moléculas é requerida com a resolução sub-μm.
8. Ajuste o estágio piezoelétrico para centralizar o campo de visão no indicado (X, Y).
9. Ligue o feixe de excitação e realize a análise completa (360°) da polarização e da emissão ligando a rotação da placa de meia-onda (rotação de 180°). Apresentar componentes 2PF Ix e Iy na forma de um gráfico polar (como mostrado na Figura 5B).
   Observação : esta etapa pode ser repetida em locais diferentes na amostra para coletar uma quantidade suficiente de dados.

4. Determinação da ordenação local de fibrilas no interior dos esferulitos de insulina bovina

NOTA: Todos os cálculos numéricos ligados à análise dos dados foram feitos utilizando a linguagem de programação Python e baseados nas funções disponíveis nas bibliotecas NumPy e SciPy. A plotagem dos dados requer a biblioteca Matplotlib. Todos os cálculos são baseados em fórmulas apresentadas em informações de apoio em um dos artigos de Obstarczyk et ^al.6.

1. Simulando a intensidade da fluorescência de dois fótons excitada para a distribuição especificada de moléculas com uma direção selecionada da polarização da luz incidente (denotada por α)
   NOTA: As fórmulas apresentadas baseiam-se na suposição de momentos dipolares paralelos de absorção e emissão de um fluoróforo. Para uma discussão de outros casos (por exemplo, diferentes direções dos momentos dipolares de absorção e emissão, transferência de energia entre os fluoróforos), ver o artigo de Le Floc'h et al⁸.
   1. Encontre os parâmetros que explicam a variação do campo elétrico por polarização, mistura e efeitos de despolarização causados pelo espelho dicroico montado em uma configuração:
      1. γ representa o fator de amplitude entre a refletividade e a luz polarizada de um espelho dicroico.
      2. δ representa o deslocamento de fase (elipse) entre a luz polarizada e a luz.
         NOTA: A definição correta desses dois parâmetros é crucial para o sucesso da caracterização estrutural devido à sua forte influência na forma dos gráficos polares medidos^11,18. No caso do sistema apresentado, ambos os parâmetros foram determinados durante medidas de elipsometria de um espelho dicroico aplicado em um sistema.
   2. Calcular os vetores de campo elétrico incidentes que se propagam nos eixos X e Y de cada ângulo medido durante a medição do ps-TPFM usando equações (1-5).
      (1º)
      (2º)
      (3º)
      (4º)
      (5º)
      NOTA Se a intensidade for medida ao longo de todo o 360° com o passo 1°, calcule os vetores de campo elétrico para todos os 360°. Todos os ângulos devem ser em radianos. O parâmetro ρ está ligado à frequência óptica ω do campo elétrico simulado (ρ=ω·t) e utilizados integrados de 0 a 2π durante os cálculos dos vetores de campo elétrico incidentes que se propagam nos eixos X e Y para cada ângulo α medido durante a medição do ps-TPFM.
   3. Definir as funções para momentos dipolares de transição em direções de três eixos de um sistema cartesiano de acordo com equações (6-8):
      (6)
      (7º)
      (8º)
      NOTA: φ é o ângulo de orientação do eixo longo da fibrila amiloide no quadro de amostra XY. θ e φ ângulos são os ângulos polar e azimutal usados para definir a orientação do momento dipolar de transição de um fluoróforo.
   4. Use as funções definidas na etapa 4.1.3. definir funções para J_x (Φ,θ,φ) e J_Y(Φ,θ,φ), que explicam a contribuição da focalização apertada da luz com objetivo de abertura numérica alta para a detecção da polarização da fluorescência na direção X e Y usando equações (9, 10).
      (9º)
      (10)
      NOTA: Os fatores K₁, K₂, K₃ estão relacionados com a objetiva do microscópio usada durante a medição do ps-TPFM. Nesses experimentos, utilizou-se objetiva de imersão em óleo apocromático de 100x/1,4 NA e os fatores K₁, K₂, K₃ foram 2,945, 0,069 e 1,016, respectivamente.
   5. Definir uma função para f(Ω), que é uma distribuição angular molecular, dependendo da meia abertura de um cone de fluoróforo Ψ, com uma espessura variável ΔΨ; Use a equação (11). A representação gráfica dos três ângulos em relação à fibrila amiloide é apresentada na Figura 6.
      (11)
      NOTA: Tenha cuidado ao escrever o expoente - o poder de 2 funciona no argumento da função, não na função inteira!
   6. Defina todos os fatores f_WWIJKL como mostrado nas equações (12-21).
      (12)
      (13)
      (14)
      (15)
      (16)
      (17)
      (18)
      (19)
      (20)
      (21)
   7. Calcular as intensidades de fluorescência excitada de dois fótons e para cada ângulo medido (da mesma forma que no ponto 4.1.2) utilizando equações (22, 23).
      = (22)
      = (23)
   8. Verifique se a simulação está funcionando corretamente utilizando os seguintes valores de variáveis (colocados na legenda da Figura 7) e compare os resultados obtidos com a Figura 7A-C.
      NOTA: Todos os graus devem ser escritos em radianos.
2. Ajustar as intensidades simuladas à intensidade de autofluorescência excitada por dois fótons de esferulitos de insulina bovina coletados durante as medições de ps-2PFM.
   NOTA: A resolução da estrutura esferulítica baseada em medidas de ps-2PFM requer o uso das equações escritas no protocolo para simular a intensidade teórica da fluorescência excitada de dois fótons e o ajuste de todos os parâmetros ligados à ordenação do fluoróforo molecular. Requer múltiplas iterações sobre os vários valores de Φ, um ângulo descrevendo a rotação da fibrila na amostra do microscópio XY, e ΔΨ, aberrações da distribuição cônica do dipolo de emissão Ψ devido às rotações moleculares em filamentos para Ψ fixo até atingir o maior coeficiente R² possível entre a intensidade de sinal de fluorescência excitada de dois fótons normalizada coletada durante a medição e intensidades normalizadas simuladas de acordo com Etapa 4.1 do protocolo.
   1. Determine o meio-ângulo Ψ .
      NOTA: Para os esferulitos de insulina bovina, deve ser igual a Ψ = 29°⁶.
   2. Fluxo de trabalho de ajuste:
      1. Escolha o valor de Φ de 0° a 180° (nas Figuras 8A e 8B Φ = 16° e 127°, respectivamente).
      2. Escolha o valor de ΔΨ de 0° a 90° (na Figura 8A,B, ΔΨ = 24° e 1°, respectivamente).
      3. Calcular (equação 22) e (equação 23) para toda a faixa medida de ângulos θ usando os valores escolhidos de Φ e ΔΨ.
      4. Comparar as intensidades calculadas durante as simulações (ambas normalizadas para o valor máximo de
      5. Calcular ) com intensidades normalizadas de
      6. Calcular e (ambos normalizados para o valor máximo de ) medidos durante a medição da MAPP ps-2.
         NOTA: Nos experimentos apresentados, os coeficientes de correlação produto-momento de Pearson foram calculados usando a função "corrcoef" da biblioteca NumPy Python.
   3. Ao final, escolha os valores de Φ e ΔΨ levando aos maiores coeficientes de correlação e convergência entre as intensidades simuladas e o sinal medido semelhante ao que é mostrado na Figura 8.

Resultados

O protocolo apresentado fornece orientação passo a passo através da preparação de superestruturas amiloides para testes com ps-2PFM, construção do sistema microscópico e medidas da amostra adequada. No entanto, antes do conjunto final de medidas, é vital alinhar adequadamente as DPAs com uma referência isotrópica, o que deve resultar na coleta de um sinal simétrico de forma e intensidade semelhantes em ambos os detectores (Figura 4C). Mesmo diferenças mínimas entre as intensidades medidas no...

Discussão

A microscopia de dois fótons sensível à polarização é uma ferramenta valiosa para estudar a ordenação local de fibrilas dentro das superestruturas amiloides, exigindo apenas pequenas modificações na configuração padrão de multifótons. Uma vez que opera em fenômenos ópticos não lineares, a foto-seleção angular reduzida e a resolução axial aprimorada podem ser obtidas em comparação com métodos de microscopia de fluorescência excitada de um fóton. Além disso, leva a menor espalhamento de luz, menor fototoxicidade e penetraç...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Preparação de amostras
lamínulas, 24 x 24 mm	Montagem	04-298.202.04
DPX para histologia	Sigma-Aldrich	6522	Montagem deslizante
Eppendorf Safe-Lock tubos, 1,5 mL, polipropileno	Chemland	02-63102
Eppendorf ThermoMixer  C	Eppendorf		Usado para incubação de esferulita
HLP 5UV Sistema de purificação de água	Hydrolab		Fonte de água dionizada usada na preparação de amostras
Ácido clorídrico (≥ 37%, APHA ≤ 10),	Sigma-Aldrich	30721-M
Insulina em pó do pâncreas bovino (≥ 25 unidades/mg (HPLC))	Sigma-Aldrich	I5500
Metanol (grau HPLC)	Lâminas de microscópio Sigma-Aldrich	270474
com côncavo, 76 x 26 x 1 mm	Chemland	04-296.202.09
Olympus BX60	Olympus		usado na Figura 2
Fita de vedação de rosca PTFE, 12 mm x 12 mm x 0,1 mm, 60 gm2	Chemland	VIT131097
Microscópio ps-2PFM setup
Chameleon Ultra II	Coherent
FELH0800 - Ø Filtro Longpass	Thorlabs
FESH0700 - Ø Filtro de Passagem Curta de 25,0 mm	Thorlabs
de avalanche com contagem de fótons	multifotônico ID Quantique
720 nm	Montada Semrock
, 690-1200 nm	Thorlabs
Nikon Plan Apo Oil Immersion 100x/1.4 NA	Nikon
piezo 3D stage	Piezosystem Jena
Polarizing Beamsplitter	Thorlabs
S130C - Slim Photodiode Sensor de Potência, Si, 400 - 1100 nm, 500 mW	Thorlabs
Software
LabView 2018	National Instruments		Versão 18.0.1f2
Biblioteca			Versão 3.3.2
Biblioteca			Versão 1.19.2
Biblioteca			Versão 1.5.2
Spyder Python 3 IDE			Versão 4.1.5