Aqui, apresentamos um protocolo para um sistema automatizado de cultura de células. Este sistema de cultura automatizado reduz o trabalho e beneficia os usuários, incluindo pesquisadores não familiarizados com o manuseio de células-tronco pluripotentes induzidas (iPS), desde a manutenção de células iPS até a diferenciação em vários tipos de células.
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Artigo de método
Um Sistema de Cultura Automatizado para Manutenção e Diferenciação de Células-Tronco Pluripotentes Induzidas por Humanos
Neste artigo
Resumo
Resumo
Espera-se que as células-tronco pluripotentes induzidas pelo ser humano (hiPSCs) com infinita capacidade de autoproliferação tenham aplicações em vários campos, incluindo a elucidação de patologias de doenças raras, o desenvolvimento de novos medicamentos e a medicina regenerativa com o objetivo de restaurar órgãos danificados. Apesar disso, a implementação social de hiPSCs ainda é limitada. Isso se deve, em parte, à dificuldade de reproduzir a diferenciação na cultura, mesmo com conhecimentos avançados e habilidades técnicas sofisticadas, devido à alta sensibilidade das iPSCs a mudanças ambientais diminutas. A aplicação de um sistema de cultura automatizado pode resolver essa questão. Experimentos com alta reprodutibilidade, independentemente da habilidade do pesquisador, podem ser esperados de acordo com um procedimento compartilhado entre vários institutos. Embora vários sistemas de cultura automatizados que podem manter culturas iPSC e induzir diferenciação tenham sido desenvolvidos anteriormente, esses sistemas são pesados, grandes e caros, pois fazem uso de braços robóticos humanizados e multiarticulados. Para melhorar as questões acima, desenvolvemos um novo sistema usando um sistema simples de trilho deslizante de eixo x-y-z, permitindo que ele seja mais compacto, leve e barato. Além disso, o usuário pode facilmente modificar parâmetros no novo sistema para desenvolver novas tarefas de manuseio. Uma vez que uma tarefa é estabelecida, tudo o que o usuário precisa fazer é preparar o iPSC, fornecer os reagentes e consumíveis necessários para a tarefa desejada com antecedência, selecionar o número da tarefa e especificar o tempo. Confirmamos que o sistema poderia manter as iPSCs em um estado indiferenciado através de várias passagens sem células alimentadoras e diferenciar-se em vários tipos celulares, incluindo cardiomiócitos, hepatócitos, progenitores neurais e queratinócitos. O sistema permitirá experimentos altamente reprodutíveis em todas as instituições sem a necessidade de pesquisadores qualificados e facilitará a implementação social de hiPSCs em uma gama mais ampla de campos de pesquisa, diminuindo os obstáculos para novas entradas.
Introdução
Este artigo tem como objetivo fornecer procedimentos reais e detalhados de manejo para um sistema automatizado de cultura de células-tronco pluripotentes induzidas humanas (iPSC), que produzimos em colaboração com uma empresa, e mostrar resultados representativos.
Desde a publicação do artigo em 2007, o iPSC vem chamando a atenção em todo o mundo1. Devido à sua maior característica de poder diferenciar-se em qualquer tipo de célula somática, espera-se que seja aplicado em vários campos, como a medicina regenerativa, a elucidação das causas de doenças intratáveis e o desenvolvimento de novos fármacosterapêuticos2,3. Além disso, o uso de células somáticas humanas derivadas de iPSC poderia reduzir os experimentos com animais, que estão sujeitos a restrições éticas significativas. Embora inúmeras iPSCs homogêneas sejam constantemente necessárias para pesquisar novos métodos com iPSCs, é muito trabalhoso gerenciá-las. Além disso, o manuseio de iPSC é difícil devido à sua alta sensibilidade, mesmo a mudanças culturais e ambientais sutis.
Para resolver esse problema, espera-se que os sistemas de cultura automatizados executem tarefas em vez de humanos. Alguns grupos desenvolveram alguns sistemas automatizados de cultura de células-tronco pluripotentes humanas para manutenção e diferenciação celular e publicaram suas conquistas 4,5,6. Estes sistemas equipam braço(s) robótico(s) multiarticulado(s). Os braços robóticos têm não apenas mérito por imitar altamente os movimentos dos braços humanos, mas também demérito por exigirem custos mais altos para o(s) braço(s), embalagens de sistemas maiores e mais pesadas e esforços demorados de educação por parte dos engenheiros para obter os movimentos visados 7,8. A fim de facilitar a introdução do aparelho em mais instalações de pesquisa nos pontos de consumo econômico, espacial e de recursos humanos, desenvolvemos um novo sistema de cultura automatizado para a manutenção e diferenciação de iPSC em vários tipos de células9.
Nossa justificativa para o novo sistema foi adotar um sistema de trilhos com eixo X-Y-Z em vez de braços robóticos multiarticulados9. Para substituir as complexas funções manuais dos braços robóticos, aplicamos uma nova ideia a este sistema, que pode alterar automaticamente três tipos de pontas de braço funcionais específicas. Aqui, também indicamos como os usuários podem facilmente fazer agendamentos de tarefas com pedidos simples em software devido à falta de requisitos para contribuições de engenheiros durante todo o processo.
Um dos sistemas robóticos de cultura demonstrou a confecção de corpos embrionários utilizando placas de 96 poços como agregados celulares 3D paradiferenciação4. O sistema relatado aqui não pode lidar com placas de 96 poços. Um deles alcançou o grau atual de boas práticas de fabricação (GMPc) usando uma linhagem celular, embora não fosse uma célula-tronco pluripotente humana5. O sistema de cultura automatizado aqui detalhado foi desenvolvido com o objetivo específico de auxiliar os experimentos laboratoriais (Figura 1). No entanto, tem sistemas suficientes para manter limpos níveis equivalentes a um gabinete de segurança de nível IV.
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Protocolo
O Comitê de Ética da Universidade de Medicina de Kansai aprovou a geração e o uso das iPSCs derivadas de voluntários saudáveis chamadas KMUR001 (aprovação nº 2020197). O doador, que foi recrutado abertamente, forneceu consentimento informado formal e concordou com o uso científico das células.
NOTA: A interface atual (o software especial chamado "ccssHMI" em execução no sistema operacional Windows XP) é a tela de operação fundamental. Sob a interface acima mencionada, uma série de abas são organizadas, permitindo que os usuários iniciem várias operações.
1. Operações de carregamento
- Clique no botão Carregando na tela superior do software. Clique no botão Iniciar Preparação de Carregamento .
- Coloque o(s) prato(s) ou prato(s) a introduzir no aparelho em posição no aparelho.
NOTA: As informações necessárias para a identificação do prato devem ser escritas em cada tampa. - Feche manualmente a janela deslizante frontal e pressione o botão mecânico de confirmação de segurança.
- Selecione o tipo e a quantidade do(s) prato(s) ou prato(s) no software.
- Clique no botão Carregando preparação concluída . Clique no botão Carregando Iniciar .
- Depois que um prato é carregado no sistema, selecione as informações sobre o prato, como com células iPS ou sem células iPS, no software. Registre anotações sobre cada prato no software.
- Clique no botão Registro no final para concluir a operação de carregamento.
2. Operação de descarga
- Clique no botão Descarregar na tela superior do software. Selecione o(s) prato(s) a ser removido(s) no software.
- Depois de selecionar o(s) prato(s), clique no botão Início da Preparação de Descarga . Clique no botão Descarregando Iniciar .
- Depois que o(s) prato(s) for(em) transferido(s) da incubadora para a bancada de trabalho no sistema, pressione o botão Remoção do prato .
- Abra manualmente a janela deslizante frontal e retire o(s) prato(s). Feche manualmente a janela deslizante frontal e pressione o botão mecânico de confirmação de segurança.
3. Suplemento de consumíveis: pipetas, tubos e meio
- Para reabastecer consumíveis, como pipetas, tubos e suportes, clique no botão Consumíveis na tela superior do software e selecione o item a ser reabastecido.
- Pipetas
- Clique no botão Pipeta . Selecione o botão Reabastecer .
- Selecione um rack que o usuário deseja reabastecer no software. Clique no botão Reabastecer Iniciar .
- Depois de confirmar que a tampa da área de armazenamento da pipeta na bancada de trabalho está aberta, abra manualmente a janela deslizante frontal e reabasteça as pipetas conforme necessário.
- Feche manualmente a janela deslizante frontal e pressione o botão mecânico de confirmação de segurança. Clique no botão Reabastecer concluído .
- Clique no botão Configuração de reabastecimento e insira as informações para o reabastecimento e, em seguida, clique no botão Registro .
- Clique no botão Reabastecer concluído .
- Tubos
- Clique no botão Tubo . Selecione o botão Reabastecer .
- Selecione um rack que o usuário deseja reabastecer no software. Clique no botão Reabastecer Iniciar .
- Depois de confirmar que o rack foi movido para a parte superior, clique no botão Reabastecer tubo .
- Abra manualmente a janela deslizante frontal e reabasteça os tubos conforme necessário.
- Feche manualmente a janela deslizante frontal e pressione o botão mecânico de confirmação de segurança.
- Clique no botão Reabastecer concluído .
- Clique no botão Configuração de reabastecimento e insira as informações para o reabastecimento e, em seguida, clique no botão Registro . Clique no botão Fechar .
- Média
- Clique no botão Médio . Selecione o botão Reabastecer no software.
- Selecione um rack de três que os usuários desejam reabastecer. Clique no botão Reabastecer Iniciar .
- Depois de confirmar que a tampa da área de armazenamento média foi aberta, abra manualmente a janela deslizante frontal e reabasteça o meio.
- Feche manualmente a janela deslizante frontal e pressione o botão mecânico de confirmação de segurança.
- Clique no botão Reabastecer concluído .
- Clique no botão Reabastecer e insira as informações da mídia, incluindo o nome e a quantidade da mídia. Insira comentários adicionais, se necessário.
- Clique no botão Registro .
- Clique no botão Fechar .
- Pipetas
4. Seleção da tarefa
- Clique no botão Tarefa na tela superior do software.
- Selecione o botão Configuração da tarefa . Selecione a tarefa desejada na lista de tarefas e clique no botão Próxima etapa .
- Especifique a data e a hora para executar a tarefa e clique no botão Registro . Selecione um prato ou prato para executar a tarefa e clique no botão Registro .
- Depois de reconfirmar a tarefa selecionada, clique no botão Registro . Confirme se a tarefa foi registrada na próxima tela.
- Se necessário, defina a próxima tarefa da mesma maneira.
- Clique no botão Iniciar no final. Em seguida, a tarefa será iniciada automaticamente na data e hora especificadas.
NOTA: Imediatamente após terminar cada tarefa, as luzes UV (localizadas em dois lados do capô) acendem-se automaticamente e, após 5-30 min, de acordo com a configuração auxiliar, são desligadas para manter o exaustor em condições assépticas. Para parar, os usuários podem clicar no botão Iniciar . - Se os usuários quiserem cancelar uma tarefa agendada com antecedência, clique no botão Parar .
- Depois de selecionar a tarefa a ser anulada, clique no botão Editar tarefa .
- Clique no botão Cancelar tarefa . Confirme se a tarefa foi excluída na próxima tela.
5. Verifique as imagens da célula
- Cada tarefa inclui observações microscópicas (tirar fotos) antes e depois do trabalho da tarefa. Observe o progresso da cultura celular fotograficamente incorporando uma tarefa de fotografia microscópica antes ou depois de cada tarefa.
- Selecione programas de tarefas predefinidos, incluindo a seleção de vários locais específicos do prato ou da placa do poço com antecedência para observação de ponto fixo para monitorar o mesmo local ao longo do tempo.
6. Passagem e diferenciação
- Siga as etapas nas seções 1-5 e defina o sistema automatizado de cultura de células para realizar a passagem e diferenciação. As configurações do instrumento para passagem, diferenciação de cardiomiócitos, diferenciação de hepatócitos, diferenciação de células precursoras neurais e diferenciação de queratinócitos são mostradas na Tabela 1, Tabela 2, Tabela 3, Tabela 4 e Tabela 5, respectivamente.
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Resultados
Manutenção de células-tronco pluripotentes induzidas pelo homem
Foram utilizadas três linhagens de hPSC (RIKEN-2F, 253G1 e KMUR001). Otimizamos o protocolo de manutenção através de experimentos manuais diários e otimizamos ainda mais os programas detalhados através dos sete experimentos preliminares realizados pelo sistema. Por exemplo, as tensões de cisalhamento causadas pelas velocidades do líquido do fluxo do espeto de diferentes pipets manuseadas por humanos e pelo sistema são bastante diferentes;...
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Discussão
Uma etapa crítica no protocolo é que, se um usuário encontrar alguma falha, clique no botão cancelar, parar ou redefinir a qualquer momento e recomeçar a partir da primeira etapa. O software pode evitar erros humanos, incluindo reserva dupla, abertura de portas enquanto as tarefas do sistema estão ativas e falta de reabastecimento. Outro ponto crítico para o sucesso e a diferenciação eficiente da célula somática desejada é a seleção adequada de linhagens de células-tronco pluripotentes, pois cada célula-tronco pluripoten...
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Divulgações
O autor não tem nada a revelar.
Agradecimentos
Este estudo foi apoiado por uma bolsa do New Business Promotion Center, Panasonic Production Engineering Co., Ltd., Osaka, Japão.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| 0,15% fração de albumina de soro bovino V | Fuji Film Wako Chemical Inc., Miyazaki, Japão | 9048-46-8 | |
| 1% GlutaMAX | Thermo Fisher Scientific | 35050061 | |
| placas de plástico de 10 cm | Corning Inc., NY, Estados Unidos | 430167 | |
| 253G1 | RKEN Bioresource Research Center | HPS0002 | |
| 2-mercaptoetanol | Thermo Fisher Scientific | 21985023 | |
| Actinina camundongo | Abcam | ab9465 | |
| Activin A | Nacali Tesque | 18585-81 | |
| Adenine | Thermo Fisher Scientific | A14906.30 | |
| Albumina coelho | Dako | A0001 | |
| Ácido retinóico totalmente trans | Fuji Film Wako Chemical Inc. | 186-01114 | |
| Sistema de cultura automatizado | Suplemento Panasonic | ||
| B-27 | Thermo Fisher Scientific | 17504044 | |
| bFGF | Fuji Film Wako Chemical Inc. | 062-06661 | |
| BMP4 | Thermo Fisher Scientific | PHC9531 | |
| Soro bovino albumina | Merck | 810037 | |
| CHIR-99021 | MCE, NJ, Estados Unidos #HY-10182 | 252917-06-9 | |
| Queratinócitos Definidos-SFM | Thermo Fisher Scientific | 10744019 | Meio de queratinócitos humanos |
| Dexametasona | Merck | 266785 | |
| Dihexa | TRC, Ontário, Canadá | 13071-60-8 | rac-1,2-Dihexadecilglicerol |
| Hemocitômetro descartável | CountessTM Cell Counting Chamber Slides, Thermo Fisher Scientific | C10228 | |
| Dorsomorfina | Thermo Fisher Scientific | 1219168-18-9 | |
| Dulbecco' s Eagle modificado médio/F12 | Fuji Film Wako Chemical Inc. | ||
| EGF | Fuji Film Wako Chemical Inc. | 053-07751 | |
| Essencial 8 | Thermo Fisher Scientific | A1517001 | Meio de células-tronco pluripotentes humanas |
| Soro fetal bovino | Biowest, FL, Estados Unidos | S140T | |
| FGF-basic | Nacalai Tesque Inc. | 19155-07 | |
| Forskolin | Thermo Fisher Scientific | J63292. | |
| Glutamina | Thermo Fisher Scientific | 25030081 | Suplemento de Glutamina |
| IgG de Cabra(H+L) AlexaFluo546 | Thermo Scientific | A11056 | |
| HNF-4A cabra | Santacruz | 6556 | |
| Hidrocortisona | Thermo Fisher Scientific | A16292.06 | |
| Hidrocortisona 21-hemisuccinato | Merck | H2882 | |
| iMatrix511 Seda | Nippi Inc., Tóquio, Japão | 892 021 | Matriz de cultura celular |
| Insulina-transferrina-selênio | Thermo Fisher Scientific | 41400045 | |
| Queratina 1 camundongo | Santacruz | 376224 | |
| Queratina 10 coelho | BioLegend | 19054 | |
| KMUR001 | Kansai Medical University | iPSCs derivadas de pacientes | |
| Substituição de soro knockout | Thermo Fisher Scientific | 10828010 | |
| ácido L-ascórbico 2-fosfato | A8960, Merck | A8960 | |
| Leibovitz' s L-15 médio | Fuji Film Wako Chemical Inc. | 128-06075 | |
| Matrigel | Corning Inc. | ||
| Mouse IgG(H+L) AlexaFluo488 | Thermo Scientific | A21202 | |
| Suplemento N-2 | Thermo Fisher Scientific | 17502048 | |
| Nestin mouse | Santacruz | 23927 | |
| Meio neurobasal | Thermo Fisher Scientific | 21103049 | |
| Neurofilamento coelho | Chemicon | AB1987 | |
| Neutristem | Sartrius AG, Gö ttingen, Alemanha | 05-100-1A | meio de cultura de células |
| 3/4 de outubro camundongo | BD | 611202 | |
| PBS(-) | Nacalai Tesque Inc., Kyoto, Japão | 14249-24 | |
| Rabbit IgG(H+L) AlexaFluo488 | Thermo Scientific | A21206 | |
| Rabbit IgG(H+L) AlexaFluo546 | Thermo Scientific | A10040 | |
| Albumina humana recombinante | A0237, Merck, Darmstadt, Alemanha | A9731 | |
| Inibidor de Rho quinase, Y-27632 | Sellec Inc., Tóquio, Japão | 129830-38-2 | |
| RIKEN 2F | RKEN Bioresource Research Center | HPS0014 | hiPSCs indiferenciados |
| RPMI 1640 | Thermo Fisher Scientific #11875 | 12633020 | |
| SB431542 | Thermo Fisher Scientific | 301836-41-9 | |
| L-ascorbato de Sódio | Merck | A4034-100G | |
| SSEA-4 mouse | Millipore | MAB4304 | |
| StemFit AK02N | Ajinomoto, Tóquio, Japão | AK02 | meio de cultura de células |
| TnT coelho | Abcam | ab92546 | |
| TRA 1-81 camundongo | Millipore | MAB4381 | |
| Triiodotironina | Thermo Fisher Scientific | H34068.06 | |
| TripLETM express enzyme | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, Estados Unidos | 12604013 | |
| Solução azul de tripano | Nacalai Tesque, Kyoto, Japão | 20577-34 | |
| Caldo de fosfato de triptose | Merck | T8782-500G | |
| Wnt-C59 | Bio-techne, NB, Reino Unido | 5148 | |
β  Tublin mouse | Promega | G712A |
Referências
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Reimpressões e permissões
