Um Sistema de Cultura Automatizado para Manutenção e Diferenciação de Células-Tronco Pluripotentes Induzidas por Humanos

Resumo

Aqui, apresentamos um protocolo para um sistema automatizado de cultura de células. Este sistema de cultura automatizado reduz o trabalho e beneficia os usuários, incluindo pesquisadores não familiarizados com o manuseio de células-tronco pluripotentes induzidas (iPS), desde a manutenção de células iPS até a diferenciação em vários tipos de células.

Resumo

Espera-se que as células-tronco pluripotentes induzidas pelo ser humano (hiPSCs) com infinita capacidade de autoproliferação tenham aplicações em vários campos, incluindo a elucidação de patologias de doenças raras, o desenvolvimento de novos medicamentos e a medicina regenerativa com o objetivo de restaurar órgãos danificados. Apesar disso, a implementação social de hiPSCs ainda é limitada. Isso se deve, em parte, à dificuldade de reproduzir a diferenciação na cultura, mesmo com conhecimentos avançados e habilidades técnicas sofisticadas, devido à alta sensibilidade das iPSCs a mudanças ambientais diminutas. A aplicação de um sistema de cultura automatizado pode resolver essa questão. Experimentos com alta reprodutibilidade, independentemente da habilidade do pesquisador, podem ser esperados de acordo com um procedimento compartilhado entre vários institutos. Embora vários sistemas de cultura automatizados que podem manter culturas iPSC e induzir diferenciação tenham sido desenvolvidos anteriormente, esses sistemas são pesados, grandes e caros, pois fazem uso de braços robóticos humanizados e multiarticulados. Para melhorar as questões acima, desenvolvemos um novo sistema usando um sistema simples de trilho deslizante de eixo x-y-z, permitindo que ele seja mais compacto, leve e barato. Além disso, o usuário pode facilmente modificar parâmetros no novo sistema para desenvolver novas tarefas de manuseio. Uma vez que uma tarefa é estabelecida, tudo o que o usuário precisa fazer é preparar o iPSC, fornecer os reagentes e consumíveis necessários para a tarefa desejada com antecedência, selecionar o número da tarefa e especificar o tempo. Confirmamos que o sistema poderia manter as iPSCs em um estado indiferenciado através de várias passagens sem células alimentadoras e diferenciar-se em vários tipos celulares, incluindo cardiomiócitos, hepatócitos, progenitores neurais e queratinócitos. O sistema permitirá experimentos altamente reprodutíveis em todas as instituições sem a necessidade de pesquisadores qualificados e facilitará a implementação social de hiPSCs em uma gama mais ampla de campos de pesquisa, diminuindo os obstáculos para novas entradas.

Introdução

Este artigo tem como objetivo fornecer procedimentos reais e detalhados de manejo para um sistema automatizado de cultura de células-tronco pluripotentes induzidas humanas (iPSC), que produzimos em colaboração com uma empresa, e mostrar resultados representativos.

Desde a publicação do artigo em 2007, o iPSC vem chamando a atenção em todo o mundo¹. Devido à sua maior característica de poder diferenciar-se em qualquer tipo de célula somática, espera-se que seja aplicado em vários campos, como a medicina regenerativa, a elucidação das causas de doenças intratáveis e o desenvolvimento de novos fármacos^{terapêuticos2,3}. Além disso, o uso de células somáticas humanas derivadas de iPSC poderia reduzir os experimentos com animais, que estão sujeitos a restrições éticas significativas. Embora inúmeras iPSCs homogêneas sejam constantemente necessárias para pesquisar novos métodos com iPSCs, é muito trabalhoso gerenciá-las. Além disso, o manuseio de iPSC é difícil devido à sua alta sensibilidade, mesmo a mudanças culturais e ambientais sutis.

Para resolver esse problema, espera-se que os sistemas de cultura automatizados executem tarefas em vez de humanos. Alguns grupos desenvolveram alguns sistemas automatizados de cultura de células-tronco pluripotentes humanas para manutenção e diferenciação celular e publicaram suas conquistas ^4,5,6. Estes sistemas equipam braço(s) robótico(s) multiarticulado(s). Os braços robóticos têm não apenas mérito por imitar altamente os movimentos dos braços humanos, mas também demérito por exigirem custos mais altos para o(s) braço(s), embalagens de sistemas maiores e mais pesadas e esforços demorados de educação por parte dos engenheiros para obter os movimentos visados ^7,8. A fim de facilitar a introdução do aparelho em mais instalações de pesquisa nos pontos de consumo econômico, espacial e de recursos humanos, desenvolvemos um novo sistema de cultura automatizado para a manutenção e diferenciação de iPSC em vários tipos de células⁹.

Nossa justificativa para o novo sistema foi adotar um sistema de trilhos com eixo X-Y-Z em vez de braços robóticos multiarticulados⁹. Para substituir as complexas funções manuais dos braços robóticos, aplicamos uma nova ideia a este sistema, que pode alterar automaticamente três tipos de pontas de braço funcionais específicas. Aqui, também indicamos como os usuários podem facilmente fazer agendamentos de tarefas com pedidos simples em software devido à falta de requisitos para contribuições de engenheiros durante todo o processo.

Um dos sistemas robóticos de cultura demonstrou a confecção de corpos embrionários utilizando placas de 96 poços como agregados celulares 3D para^{diferenciação4}. O sistema relatado aqui não pode lidar com placas de 96 poços. Um deles alcançou o grau atual de boas práticas de fabricação (GMPc) usando uma linhagem celular, embora não fosse uma célula-tronco pluripotente humana⁵. O sistema de cultura automatizado aqui detalhado foi desenvolvido com o objetivo específico de auxiliar os experimentos laboratoriais (Figura 1). No entanto, tem sistemas suficientes para manter limpos níveis equivalentes a um gabinete de segurança de nível IV.

Protocolo

O Comitê de Ética da Universidade de Medicina de Kansai aprovou a geração e o uso das iPSCs derivadas de voluntários saudáveis chamadas KMUR001 (aprovação nº 2020197). O doador, que foi recrutado abertamente, forneceu consentimento informado formal e concordou com o uso científico das células.

NOTA: A interface atual (o software especial chamado "ccssHMI" em execução no sistema operacional Windows XP) é a tela de operação fundamental. Sob a interface acima mencionada, uma série de abas são organizadas, permitindo que os usuários iniciem várias operações.

1. Operações de carregamento

1. Clique no botão Carregando na tela superior do software. Clique no botão Iniciar Preparação de Carregamento .
2. Coloque o(s) prato(s) ou prato(s) a introduzir no aparelho em posição no aparelho.
   NOTA: As informações necessárias para a identificação do prato devem ser escritas em cada tampa.
3. Feche manualmente a janela deslizante frontal e pressione o botão mecânico de confirmação de segurança.
4. Selecione o tipo e a quantidade do(s) prato(s) ou prato(s) no software.
5. Clique no botão Carregando preparação concluída . Clique no botão Carregando Iniciar .
6. Depois que um prato é carregado no sistema, selecione as informações sobre o prato, como com células iPS ou sem células iPS, no software. Registre anotações sobre cada prato no software.
7. Clique no botão Registro no final para concluir a operação de carregamento.

2. Operação de descarga

1. Clique no botão Descarregar na tela superior do software. Selecione o(s) prato(s) a ser removido(s) no software.
2. Depois de selecionar o(s) prato(s), clique no botão Início da Preparação de Descarga . Clique no botão Descarregando Iniciar .
3. Depois que o(s) prato(s) for(em) transferido(s) da incubadora para a bancada de trabalho no sistema, pressione o botão Remoção do prato .
4. Abra manualmente a janela deslizante frontal e retire o(s) prato(s). Feche manualmente a janela deslizante frontal e pressione o botão mecânico de confirmação de segurança.

3. Suplemento de consumíveis: pipetas, tubos e meio

1. Para reabastecer consumíveis, como pipetas, tubos e suportes, clique no botão Consumíveis na tela superior do software e selecione o item a ser reabastecido.
   1. Pipetas
      1. Clique no botão Pipeta . Selecione o botão Reabastecer .
      2. Selecione um rack que o usuário deseja reabastecer no software. Clique no botão Reabastecer Iniciar .
      3. Depois de confirmar que a tampa da área de armazenamento da pipeta na bancada de trabalho está aberta, abra manualmente a janela deslizante frontal e reabasteça as pipetas conforme necessário.
      4. Feche manualmente a janela deslizante frontal e pressione o botão mecânico de confirmação de segurança. Clique no botão Reabastecer concluído .
      5. Clique no botão Configuração de reabastecimento e insira as informações para o reabastecimento e, em seguida, clique no botão Registro .
      6. Clique no botão Reabastecer concluído .
   2. Tubos
      1. Clique no botão Tubo . Selecione o botão Reabastecer .
      2. Selecione um rack que o usuário deseja reabastecer no software. Clique no botão Reabastecer Iniciar .
      3. Depois de confirmar que o rack foi movido para a parte superior, clique no botão Reabastecer tubo .
      4. Abra manualmente a janela deslizante frontal e reabasteça os tubos conforme necessário.
      5. Feche manualmente a janela deslizante frontal e pressione o botão mecânico de confirmação de segurança.
      6. Clique no botão Reabastecer concluído .
      7. Clique no botão Configuração de reabastecimento e insira as informações para o reabastecimento e, em seguida, clique no botão Registro . Clique no botão Fechar .
   3. Média
      1. Clique no botão Médio . Selecione o botão Reabastecer no software.
      2. Selecione um rack de três que os usuários desejam reabastecer. Clique no botão Reabastecer Iniciar .
      3. Depois de confirmar que a tampa da área de armazenamento média foi aberta, abra manualmente a janela deslizante frontal e reabasteça o meio.
      4. Feche manualmente a janela deslizante frontal e pressione o botão mecânico de confirmação de segurança.
      5. Clique no botão Reabastecer concluído .
      6. Clique no botão Reabastecer e insira as informações da mídia, incluindo o nome e a quantidade da mídia. Insira comentários adicionais, se necessário.
      7. Clique no botão Registro .
      8. Clique no botão Fechar .

4. Seleção da tarefa

1. Clique no botão Tarefa na tela superior do software.
2. Selecione o botão Configuração da tarefa . Selecione a tarefa desejada na lista de tarefas e clique no botão Próxima etapa .
3. Especifique a data e a hora para executar a tarefa e clique no botão Registro . Selecione um prato ou prato para executar a tarefa e clique no botão Registro .
4. Depois de reconfirmar a tarefa selecionada, clique no botão Registro . Confirme se a tarefa foi registrada na próxima tela.
5. Se necessário, defina a próxima tarefa da mesma maneira.
6. Clique no botão Iniciar no final. Em seguida, a tarefa será iniciada automaticamente na data e hora especificadas.
   NOTA: Imediatamente após terminar cada tarefa, as luzes UV (localizadas em dois lados do capô) acendem-se automaticamente e, após 5-30 min, de acordo com a configuração auxiliar, são desligadas para manter o exaustor em condições assépticas. Para parar, os usuários podem clicar no botão Iniciar .
7. Se os usuários quiserem cancelar uma tarefa agendada com antecedência, clique no botão Parar .
8. Depois de selecionar a tarefa a ser anulada, clique no botão Editar tarefa .
9. Clique no botão Cancelar tarefa . Confirme se a tarefa foi excluída na próxima tela.

5. Verifique as imagens da célula

1. Cada tarefa inclui observações microscópicas (tirar fotos) antes e depois do trabalho da tarefa. Observe o progresso da cultura celular fotograficamente incorporando uma tarefa de fotografia microscópica antes ou depois de cada tarefa.
2. Selecione programas de tarefas predefinidos, incluindo a seleção de vários locais específicos do prato ou da placa do poço com antecedência para observação de ponto fixo para monitorar o mesmo local ao longo do tempo.

6. Passagem e diferenciação

1. Siga as etapas nas seções 1-5 e defina o sistema automatizado de cultura de células para realizar a passagem e diferenciação. As configurações do instrumento para passagem, diferenciação de cardiomiócitos, diferenciação de hepatócitos, diferenciação de células precursoras neurais e diferenciação de queratinócitos são mostradas na Tabela 1, Tabela 2, Tabela 3, Tabela 4 e Tabela 5, respectivamente.

Resultados

Manutenção de células-tronco pluripotentes induzidas pelo homem
Foram utilizadas três linhagens de hPSC (RIKEN-2F, 253G1 e KMUR001). Otimizamos o protocolo de manutenção através de experimentos manuais diários e otimizamos ainda mais os programas detalhados através dos sete experimentos preliminares realizados pelo sistema. Por exemplo, as tensões de cisalhamento causadas pelas velocidades do líquido do fluxo do espeto de diferentes pipets manuseadas por humanos e pelo sistema são bastante diferentes; Portanto, otimizamos o tempo de digestão enzimática e o número de pipetagem para dispersão celular pelo sistema.

Células-tronco pluripotentes induzidas por humanos foram mantidas em uma placa de 10 cm revestida com matriz de cultura de células 0,5 μg/^cm2 com meio de cultura hiPSC (por exemplo, Neutristem ou StemFit AK02N). Para a passagem, o sistema foi programado para lavar a hiPSC três vezes com 5 mL de solução salina tampão fosfato sem cálcio (PBS[-]), em seguida, tratar com 3 mL da enzima expressa de TrypLE suplementada com 10 μM do inibidor de Rho quinase (Y-27632) por 15 min a 37 °C. Em seguida, o sistema adicionou 9 mL de PBS(-) com 0,15% de albumina V (BSA) de soro bovino à placa e realizou duas séries de movimento que aspiraram 10 mL de líquido contendo células e dispensaram o líquido da ponta da pipeta em um movimento em zigue-zague na parte superior da placa, que foi inclinada 20° mais perto da superfície da placa, e repetiu a sequência de operações acima com a placa inclinada a 20° no lado oposto. Em seguida, o sistema coletou o meio contendo células em um tubo de 15 mL e o tamparam, após o que foi centrifugado a 115 x g por 5 min para depositar as células. Em seguida, o sistema aspirava o sobrenadante e dispersava o pellet celular em células únicas usando 10 mL de meio de cultura com 10 μM Y-27632 por pipetagem 10 vezes. O sistema transferiu 1 mL de solução de azul de tripano para um novo tubo de 15 mL, em seguida, adicionou 1 mL da suspensão celular e misturou-os por pipetagem cinco vezes. Em seguida, 100 μL da solução de células coradas com azul de Trypan foram aspirados e dispensados na janela de entrada do hemocitômetro descartável no suporte. O sistema moveu o suporte do hemocitômetro para a área de observação microscópica e capturou uma foto, que foi imediatamente analisada por software, e a concentração celular obtida foi aplicada na etapa seguinte. Para a manutenção da iPSC, o sistema semeou as células a uma densidade celular de 15.000 células/^cm2 em novas placas plásticas de 10 cm de diâmetro revestidas com matriz de cultura de células de 0,5 μg/^cm2 . Para os experimentos de diferenciação, o sistema semeou as células na densidade celular requerida no meio preparado para cada tipo de célula somática em placas de 6 poços revestidas com uma matriz de cultura celular diluída em 1/100. Por fim, o sistema realizou o travamento cruzado cinco vezes antes de transferir as placas para a incubadora. Três novas placas de 10 cm contendo iPSCs e três placas pré-revestidas com matriz de cultura celular foram carregadas no sistema, e outros itens necessários também foram preparados de acordo com os respectivos procedimentos mencionados acima. Um ciclo de cultura de manutenção consiste em uma tarefa de passagem no dia 1 seguida por uma troca de meio de cultura uma vez por dia durante 3 dias. Durante todo o experimento, esse ciclo foi estabelecido em cinco ciclos. Além disso, os consumíveis foram reabastecidos por sua vez.

De acordo com o cronograma ordenado, cinco ciclos de cultura de manutenção foram realizados com sucesso, conforme planejado pelo sistema. A partir das fotografias celulares tiradas automaticamente durante cada tarefa, confirmou-se que as células proliferaram suavemente ao longo do tempo. A expansão celular (n = 3) foi calculada e mostrada na Figura 2. Para confirmar se o estado indiferenciado das iPSCs permanece inalterado mesmo após a cultura de manutenção no sistema de cultura automatizado, a análise imunocitometórica (Oct3/4 e SSEA4) foi realizada usando as amostras restantes a cada passagem (Figura 3A). Além disso, após cinco ciclos, as três placas foram descarregadas do sistema, e a análise imunoistoquímica (Oct3/4, SSEA4 e Tra1-81) também foi realizada (Figura 3B). Ambas as análises por imunomarcação fluorescente mostraram que o estado indiferenciado das células iPS foi preservado. O cariótipo das iPSCs também foi realizado antes e após a cultura de manutenção em um sistema de cultura automatizado. Embora uma anormalidade tenha sido observada em um alelo do cromossomo 17 antes do início da cultura de manutenção, nenhuma alteração particular foi observada pelo sistema após 5 culturas de manutenção, incluindo a anormalidade (Figura 3C). As configurações utilizadas para manutenção das iPSCs estão resumidas na Tabela 1.

Diferenciação
Cardiomiócitos
O protocolo de diferenciação de uma publicação anterior foi seguido aqui¹⁰. O sistema semeou hiPSCs indiferenciadas (KMUR001) a uma densidade de 30.000 células/^cm2 em placas de 6 poços revestidas com matriz de cultura celular em meio de cultura hiPSC suplementado com 10 μM de Y-27632. O sistema mudou o meio para meio de células-tronco pluripotentes humanas com 6 μM do inibidor de GSK-3ß CHIR-99021, 20 ng/mL de Activin A e 10 ng/mL BMP4 após 3 dias (dia de diferenciação 1). No dia 3 de diferenciação, o sistema mudou para meio CDM3: RPMI 1640, albumina humana recombinante de 500 μg/mL e 213 μg/mL de ácido L-ascórbico 2-fosfato com 2 μM Wnt-C59. No 5º dia de diferenciação, o sistema mudou para meio CDM3 fresco; depois disso, repetiu a mudança para o meio CDM3 fresco a cada dois dias. As configurações utilizadas para a diferenciação dos cardiomiócitos das iPSCs estão resumidas na Tabela 2.

Hepatócitos
O protocolo de diferenciação de uma publicação anterior foi seguido aqui¹¹. O sistema semeou hiPSCs indiferenciadas (RIKEN2F) a uma densidade de 25.000 células/^cm2 em placas de 6 poços revestidas com matriz de cultura celular em meio de cultura hiPSC suplementado com 10 μM de Y-27632. Após 2 dias (dia de diferenciação 1), o sistema mudou o meio para RPMI-1640 mais 2% B27 menos insulina (RPMI-B27) contendo 100 ng/mL de Activin A, 6 μM CHIR-99021 e suplemento de glutamina a 1% (por exemplo, GlutaMAX) por 24 h. No dia 2 de diferenciação, mudamos o meio para RPMI-B27 com 50 ng/mL de Activin A. No 5º dia de diferenciação, o sistema trocou o meio para RPMI-B27, contendo suplemento de glutamina a 1% e BMP-4 a 10 ng/mL. No 9º dia de diferenciação, o sistema trocou o meio de maturação do hepatócito: meio L-15 de Leibovitz contendo 8,3% de caldo fosfato de triptose, 21-hemisuccinato de hidrocortisona 10 μM, L-ascorbato de sódio 50 μg/mL, dexametasona 100 nM, insulina transferrina-selênio 0,58%, suplemento de glutamina 2 mM, soro fetal bovino 8,3% e 100 nM rac-1,2-dihexadecilglicerol. Depois disso, o sistema repetiu a troca do meio para um meio fresco a cada dois dias. As configurações utilizadas para diferenciação dos hepatócitos das iPSCs estão resumidas na Tabela 3.

Células precursoras neuronais
O protocolo de diferenciação de uma publicação anterior foi seguido aqui¹². O sistema semeou hiPSCs indiferenciadas (RIKEN2F) a uma densidade de 25.000 células/^cm2 em placas de 6 poços revestidas com matriz de membrana basal em meio Eagle modificado de Dulbecco (DMEM)/F12 e meio neurobasal (1:1) suplementado com 10% de reposição sérica knockout, aminoácidos não essenciais 0,1 mM, suplemento de glutamina 1 mM com 10 μM inibidor do receptor de TGF-beta (SB431542), 10 μM inibidor do sinal BMP (dorsomorfina), e 10 μM Y-27632 (dia de diferenciação 1). No dia de diferenciação 5, o sistema mudou o meio para DMEM/F12 e meio Neurobasal 1:1 suplementado com aminoácidos não essenciais 0,1mM, suplemento glutamina 1mM, suplemento N-2 1%, suplemento B-27 1%, 2-fosfato 50 μg/mL ácido ascórbico, SB431542 10 μM e dorsomorfina 10 μM. No 9º dia de diferenciação, o sistema mudou o meio para DMEM/F12 e meio neurobasal 1:1 suplementado com aminoácidos não essenciais 0,1 mM, suplemento de glutamina 1 mM, suplemento N-2 1%, suplemento B-27 1%, 2-fosfato de ácido ascórbico 50 μg/mL e ácido all-trans-retinóico 1 μM. No dia de diferenciação 13-16, o sistema trocou o meio todos os dias com DMEM/F12 e meio neurobasal 1:1 suplementado com aminoácidos não essenciais 0,1 mM, suplemento de glutamina 1 mM, suplemento N-2 1%, suplemento B-27 1%, 2-fosfato de ácido ascórbico 50 μg/mL e 10 ng/mL de bFGF e 10 ng/mL de EGF. As configurações utilizadas para a diferenciação das células precursoras neurais das iPSCs estão resumidas na Tabela 4.

Queratinócitos
O protocolo de diferenciação de uma publicação anterior foi seguido aqui¹³. O sistema semeou hiPSCs indiferenciadas (253G1) a uma densidade de 15.000 células/^cm2 em placas de 6 poços revestidas com matriz de cultura celular em meio de cultura hiPSC com 10 μM Y-27632. Após 2 dias (dia de diferenciação 1), o sistema mudou o meio para meio Eagle modificado de Dulbecco (DMEM)/F12 e meio Neurobasal (1:1) com aminoácidos não essenciais 0,1 mM, glutamina 1 mM, 2-mercaptoetanol 55 μM, suplemento N-2 1%, suplemento B-27 a 2%, 2 μg/mL de ácido ascórbico 2-fosfato, 0,05% de albumina de soro bovino e 100 ng/mL de FGF-básico. No dia de diferenciação 3, e posteriormente, o meio foi trocado para meio de queratinócitos humanos (sem suplemento para o dia 3 e com um suplemento no/após o dia 5) com a adição de 0,5 μg/mL de hidrocortisona, 1 μM de ácido all-trans retinóico, 25 ng/mL de hBMP-4, 2,4 μg/mL de adenina, 1,37 ng/mL de triiodotironina, 0,3 mM de ácido ascórbico 2-fosfato, e 2 μM de forskolina, a cada 2 dias pelo sistema. As configurações utilizadas para a diferenciação dos queratinócitos das iPSCs estão resumidas na Tabela 5.

Como mencionado acima, todo o processo foi realizado utilizando apenas equipamentos de cultura automatizados, desde a semeadura das células iPS até a subsequente série de protocolos de diferenciação. A expressão dos marcadores característicos em cada célula foi avaliada (Figura 4). Demonstrou-se que a diferenciação pode ser induzida usando apenas um sistema de cultura automatizado.

Figura 1: Resumo do sistema de cultura automatizado. (A) Imagem do sistema mostrando tamanho e esboço de layout 1. (B) Imagem da bancada e esboço de layout 2. (C) Ferramentas manuais: prato, tubo e pipeta. Esse valor foi modificado com permissão de Bando et ^al.9. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2: Tarefa de passagem e crescimento celular. (A) O quadrado ilustra cada processo. (B) expansão iPSC calculada usando cada contagem automatizada de células nos três experimentos independentes. (C) Imagens representativas capturadas automaticamente de passagem em passagem. Barras de escala = 400 μm e 100 μm (inset). Esse valor foi modificado com permissão de Bando et ^al.9. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3: Manutenção automatizada a longo prazo da iPSC. (A) Todas as análises imunocitometóricas dos três experimentos independentes para Oct-3/4 e SSEA-4. Cada histograma azul indica que não há controle primário de anticorpos. Cada histograma vermelho representa o sinal antígeno-específico indicado. (B) Imagens representativas de células coradas imunohistoquimicamente para Oct-3/4, SSEA-4 e Tra 1-81. Barras de escala = 50 μm. (C) Cariótipo do RIKEN2F-iPSC após a quinta passagem. Esse valor foi modificado com permissão de Bando et ^al.9. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 4: Coloração imuno-histoquímica. Imagens imuno-histoquímicas de hepatócitos (barras de escala = 100 μm), cardiomiócitos (barras de escala = 100 μm), células progenitoras neuronais (barras de escala = 100 μm) e queratinócitos (barras de escala = 200 μm). Esse valor foi modificado com permissão de Bando et ^al.9. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Tabela 1: Preparações de passagem e configurações do sistema. Clique aqui para baixar esta tabela.

Tabela 2: Preparações de diferenciação de cardiomiócitos e configurações do sistema. Clique aqui para baixar esta tabela.

Tabela 3: Preparações para diferenciação de hepatócitos e configurações do sistema. Clique aqui para baixar esta tabela.

Tabela 4: Preparações de diferenciação de células precursoras neurais e configurações do sistema. Clique aqui para baixar esta tabela.

Tabela 5: Preparações para diferenciação de queratinócitos e configurações do sistema. Clique aqui para baixar esta tabela.

Discussão

Uma etapa crítica no protocolo é que, se um usuário encontrar alguma falha, clique no botão cancelar, parar ou redefinir a qualquer momento e recomeçar a partir da primeira etapa. O software pode evitar erros humanos, incluindo reserva dupla, abertura de portas enquanto as tarefas do sistema estão ativas e falta de reabastecimento. Outro ponto crítico para o sucesso e a diferenciação eficiente da célula somática desejada é a seleção adequada de linhagens de células-tronco pluripotentes, pois cada célula-tronco pluripotente apresenta um viés incontrolável em suas propriedades de diferenciação^14,15.

Este sistema automatizado de cultura de células-tronco pluripotentes induzidas pode mantê-las e diferenciá-las em vários tipos de células somáticas. O tamanho deste sistema é de 200 cm (largura), 110 cm (profundidade) e 233 cm (altura), com um peso total de 1,2 toneladas. A incubadora embutida no dispositivo pode conter simultaneamente trinta e seis pratos de 10 cm e nove placas multipoço.

As melhorias em relação aos modelos anteriores são que, primeiro, como um braço de manuseio, o sistema de trilhos do eixo X-Y-Z foi recentemente convertido de um braço articulado de 6 eixos, que funciona mudando a ferramenta de ponta do braço para três partes diferentes para pratos, tubos e pipetas. O braço é suspenso do teto do sistema e se move ao longo do eixo X-Y-Z. Em segundo lugar, um sistema de contagem de células foi introduzido para culturas de manutenção livres de alimentadores e protocolos de indução de diferenciação que são realizados continuamente a partir da passagem. Após a mistura da solução de suspensão unicelular com a solução de azul de tripano, a mesma foi transferida para um hemocitômetro descartável para observação microscópica e exames de imagem. O software analisa automaticamente a imagem obtida para contar o número de células vivas e calcular o volume necessário para semear o número necessário de células. A acurácia da contagem de células obtida por esta análise de imagens foi consistente com a obtida manualmente.

O sistema de trilhos de eixos X-Y-Z foi aplicado para lidar com cada tarefa mais rapidamente do que a versão anterior (braço articulado multieixos). Com esse sistema automatizado de cultura, cinco passagens contínuas foram realizadas por 16 dias, e as iPSCs foram expandidas 625 ± 93 vezes. Embora a prova de resistência para o tempo de manutenção celular sem células alimentadoras tenha sido menor do que nossa demonstração anterior com células alimentadoras, a expansão celular foi mais eficiente em comparação com a demonstração anterior⁶. O tempo reduzido da tarefa pareceu contribuir para evitar que o dano celular secasse durante as tarefas.

Além disso, tarefas de diferenciação desde a cultura de manutenção até a diferenciação em cardiomiócitos, hepatócitos, células precursoras neuronais e queratinócitos foram realizadas sem intervenção humana. Após uma série desses cursos, confirmou-se por imunomarcação por fluorescência que as células obtidas apenas no sistema de cultura automatizado haviam se diferenciado nas células desejadas. Portanto, compartilhando um programa de tarefas e usando esse sistema, os pesquisadores que não estão familiarizados com o gerenciamento de células iPS podem obter células somáticas derivadas de iPSC para suas próprias pesquisas. Além disso, diferenças de reprodutibilidade entre pesquisadores ou instituições poderiam ser eliminadas tanto quanto possível, e isso poderia garantir que células de qualidade homogênea sejam obtidas sempre.

Ao adotar um novo sistema ferroviário, o equipamento poderia ser reduzido em peso para 1,2 tonelada, ~200 kg mais leve do que antes. Além disso, os custos de peças e configuração do programa poderiam ser reduzidos em aproximadamente US$ 10.000. Estima-se que os custos de manutenção e programação diminuam em 13%. A fim de motivar mais pesquisadores a ingressar facilmente em pesquisas relacionadas a células iPS, também é importante manter os custos dos equipamentos baixos⁶. Esperamos que os sistemas de cultura automática atuais e de próxima geração sejam uma das contribuições para ajudar a fornecer iPSCs e células diferenciadas derivadas de iPSC de qualidade mais uniforme.

As principais limitações desse sistema são a capacidade limitada do refrigerador para armazenamento provisório de culturas e sua fraqueza no manuseio de pequenas quantidades (<100 μL) de líquido. Além disso, a falta de inteligência artificial sofisticada desativa a otimização automática de acordo com a condição da célula no tempo. A pequena limitação é a exigência de pontas de pipetas especiais fornecidas pelos fabricantes do sistema ^4,5. Estamos desenvolvendo a próxima geração de sistemas de cultura que serão capazes de lidar com pequenas quantidades de líquido para preparações médias e incluem um sistema de otimização de feedback baseado em inteligência artificial de alto desempenho (aprendizado de sistema). Nosso fabricante colaborador⁹ tem know-how suficiente para construir sistemas feitos sob medida de acordo com as necessidades especiais dos usuários. Além disso, sistemas de próxima geração equipados com funções mais gerais e mais amplas estarão no mercado em breve. Também estamos considerando um sistema de aluguel baseado em assinatura para fornecer sistemas atualizados a todos os usuários.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
0,15% fração de albumina de soro bovino V	Fuji Film Wako Chemical Inc., Miyazaki, Japão	9048-46-8
1% GlutaMAX	Thermo Fisher Scientific	35050061
placas de plástico de 10 cm	Corning Inc., NY, Estados Unidos	430167
253G1	RKEN Bioresource Research Center	HPS0002
2-mercaptoetanol	Thermo Fisher Scientific	21985023
Actinina  camundongo	Abcam	ab9465
Activin A	Nacali Tesque	18585-81
Adenine	Thermo Fisher Scientific	A14906.30
Albumina  coelho	Dako	A0001
Ácido retinóico totalmente trans	Fuji Film Wako Chemical Inc.	186-01114
Sistema de cultura automatizado	Suplemento Panasonic
B-27	Thermo Fisher Scientific	17504044
bFGF	Fuji Film Wako Chemical Inc.	062-06661
BMP4	Thermo Fisher Scientific	PHC9531
Soro bovino albumina	Merck	810037
CHIR-99021	MCE, NJ, Estados Unidos #HY-10182	252917-06-9
Queratinócitos Definidos-SFM	Thermo Fisher Scientific	10744019	Meio de queratinócitos humanos
Dexametasona	Merck	266785
Dihexa	TRC, Ontário, Canadá	13071-60-8	rac-1,2-Dihexadecilglicerol
Hemocitômetro descartável	CountessTM Cell Counting Chamber Slides, Thermo Fisher Scientific	C10228
Dorsomorfina	Thermo Fisher Scientific	1219168-18-9
Dulbecco' s Eagle modificado médio/F12	Fuji Film Wako Chemical Inc.
EGF	Fuji Film Wako Chemical Inc.	053-07751
Essencial 8	Thermo Fisher Scientific	A1517001	Meio de células-tronco pluripotentes humanas
Soro fetal bovino	Biowest, FL, Estados Unidos	S140T
FGF-basic	Nacalai Tesque Inc.	19155-07
Forskolin	Thermo Fisher Scientific	J63292.
Glutamina	Thermo Fisher Scientific	25030081	Suplemento de Glutamina
IgG de Cabra(H+L) AlexaFluo546	Thermo Scientific	A11056
HNF-4A  cabra	Santacruz	6556
Hidrocortisona	Thermo Fisher Scientific	A16292.06
Hidrocortisona 21-hemisuccinato	Merck	H2882
iMatrix511 Seda	Nippi Inc., Tóquio, Japão	892 021	Matriz de cultura celular
Insulina-transferrina-selênio	Thermo Fisher Scientific	41400045
Queratina 1  camundongo	Santacruz	376224
Queratina 10  coelho	BioLegend	19054
KMUR001	Kansai Medical University		iPSCs derivadas de pacientes
Substituição de soro knockout	Thermo Fisher Scientific	10828010
ácido L-ascórbico 2-fosfato	A8960, Merck	A8960
Leibovitz' s L-15 médio	Fuji Film Wako Chemical Inc.	128-06075
Matrigel	Corning Inc.
Mouse IgG(H+L) AlexaFluo488	Thermo Scientific	A21202
Suplemento N-2	Thermo Fisher Scientific	17502048
Nestin mouse	Santacruz	23927
Meio neurobasal	Thermo Fisher Scientific	21103049
Neurofilamento coelho	Chemicon	AB1987
Neutristem	Sartrius AG, Gö ttingen, Alemanha	05-100-1A	meio de cultura de células
3/4 de outubro  camundongo	BD	611202
PBS(-)	Nacalai Tesque Inc., Kyoto, Japão	14249-24
Rabbit IgG(H+L) AlexaFluo488	Thermo Scientific	A21206
Rabbit IgG(H+L) AlexaFluo546	Thermo Scientific	A10040
Albumina humana recombinante	A0237, Merck, Darmstadt, Alemanha	A9731
Inibidor de Rho quinase, Y-27632	Sellec Inc., Tóquio, Japão	129830-38-2
RIKEN 2F	RKEN Bioresource Research Center	HPS0014	hiPSCs indiferenciados
RPMI 1640	Thermo Fisher Scientific #11875	12633020
SB431542	Thermo Fisher Scientific	301836-41-9
L-ascorbato de Sódio	Merck	A4034-100G
SSEA-4  mouse	Millipore	MAB4304
StemFit AK02N	Ajinomoto, Tóquio, Japão	AK02	meio de cultura de células
TnT coelho	Abcam	ab92546
TRA 1-81 camundongo	Millipore	MAB4381
Triiodotironina	Thermo Fisher Scientific	H34068.06
TripLETM express enzyme	Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, Estados Unidos	12604013
Solução azul de tripano	Nacalai Tesque, Kyoto, Japão	20577-34
Caldo de fosfato de triptose	Merck	T8782-500G
Wnt-C59	Bio-techne, NB, Reino Unido	5148
β   Tublin  mouse	Promega	G712A