Artigo de método

Experimentos de Optogenética de Alto Rendimento em Leveduras Usando a Plataforma Automatizada Lustro

DOI:

10.3791/65686

⸱

4 de agosto de 2023

 , 
1Department of Biomedical Engineering, University of Wisconsin-Madison, 2University of Wisconsin Carbone Cancer Center, University of Wisconsin School of Medicine and Public Health

Neste artigo

Resumo

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Este protocolo descreve as etapas para a utilização da plataforma automatizada Lustro para realizar a caracterização de alto rendimento de sistemas optogenéticos em leveduras.

Resumo

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A optogenética oferece controle preciso sobre o comportamento celular utilizando proteínas sensíveis à luz codificadas geneticamente. No entanto, a otimização desses sistemas para alcançar a funcionalidade desejada geralmente requer vários ciclos de projeto-construção-teste, que podem ser demorados e trabalhosos. Para enfrentar esse desafio, desenvolvemos o Lustro, uma plataforma que combina estimulação luminosa com automação laboratorial, permitindo triagem e caracterização eficientes de sistemas optogenéticos de alto rendimento.

A Lustro utiliza uma estação de trabalho de automação equipada com um dispositivo de iluminação, um dispositivo de agitação e um leitor de placas. Ao empregar um braço robótico, o Lustro automatiza o movimento de uma placa de micropoço entre esses dispositivos, permitindo a estimulação de cepas optogenéticas e a medição de sua resposta. Este protocolo fornece um guia passo-a-passo sobre o uso de Lustro para caracterizar sistemas optogenéticos para controle da expressão gênica em levedura brotante Saccharomyces cerevisiae. O protocolo abrange a configuração dos componentes do Lustro, incluindo a integração do dispositivo de iluminação com a estação de trabalho de automação. Ele também fornece instruções detalhadas para a programação do dispositivo de iluminação, leitor de placas e robô, garantindo uma operação suave e aquisição de dados durante todo o processo experimental.

Introdução

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A optogenética é uma técnica poderosa que utiliza proteínas sensíveis à luz para controlar o comportamento das células com alta precisão 1,2,3. No entanto, a prototipagem de construtos optogenéticos e a identificação de condições ótimas de iluminação podem ser demoradas, dificultando a otimização de sistemas optogenéticos 4,5. Métodos de alto rendimento para selecionar e caracterizar rapidamente a atividade de sistemas optogenéticos podem acelerar o ciclo de projeto-construção-teste para prototipar construções e explo....

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Protocolo

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As linhagens de leveduras utilizadas neste estudo estão documentadas na Tabela de Materiais. Essas linhagens apresentam crescimento robusto dentro da faixa de temperatura de 22 °C a 30 °C e podem ser cultivadas em vários meios de levedura padrão.

1. Configurando a estação de trabalho de automação

  1. Equipe a estação de trabalho automatizada com um braço robótico de garra (RGA, ver Tabela de Materiais) capaz de mover placas de micropoços (Figura 1).
  2. Instale um agitador de aquecedor de microplacas (consulte Tabela de Materiais) na estação de trab....

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Resultados

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A Figura 4A mostra os valores de fluorescência ao longo do tempo para uma cepa optogenética que expressa um repórter fluorescente controlado por um fator de transcrição dividido induzível por luz. As diferentes condições de luz utilizadas no experimento são refletidas por variações no ciclo de trabalho, que representa a porcentagem de tempo em que a luz está acesa. Observa-se que o nível de fluorescência global é proporcional ao ciclo de trabalho da estimulação luminosa.

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Discussão

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O protocolo Lustro aqui apresentado automatiza os processos de cultivo, iluminação e medição, permitindo a triagem e caracterização de sistemas optogenéticos de alto rendimento6. Isso é conseguido integrando um dispositivo de iluminação, leitor de microplacas e dispositivo de agitação em uma estação de trabalho de automação. Este protocolo demonstra especificamente a utilidade de Lustro para a triagem de diferentes construtos optogenéticos integrados à levedura S. cerevisiae e comparação .......

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Divulgações

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Os autores não têm nada a revelar.

Agradecimentos

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Este trabalho foi apoiado pelo National Institutes of Health grant R35GM128873 e pelo National Science Foundation grant 2045493 (concedido ao M.N.M.). Megan Nicole McClean, Ph.D. tem um Prêmio de Carreira na Interface Científica do Burroughs Wellcome Fund. Z.P.H. foi apoiado por uma bolsa de treinamento do NHGRI para o Programa de Treinamento em Ciências Genômicas 5T32HG002760. Reconhecemos discussões frutíferas com os membros do laboratório McClean e, em particular, somos gratos a Kieran Sweeney por fornecer comentários sobre o manuscrito.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Placa de fundo de vidro de 96 poços com  #1.5 vidro de coberturaCellvisP96-1.5H-N
BioShake 3000-T elm (agitador de aquecimento)QINSTRUMENTS
Fluent Automation WorkstationTecan
LITOS (dispositivo de iluminação alternativo)Hohener, et al. Relatórios Científicos. 2022
optoPlate-96 (dispositivo de iluminação)Bugaj, et al. Protocolos da Natureza. 2019
Braço de Garra RobóticaTecan
Spark (leitor de placas)Tecan
Sintético Mídia completaSigmaAldrichY1250
Tecan Connect (aplicativo de alerta do usuário)Tecan
yMM1734 (BY4741 Matα ura3Δ 0::5' Homologia Ura3, pRPL18B-Gal4DBD-eMagA-tENO1, pRPL18B-eMagB-Gal4AD-tENO1, pGAL1-mScarlet-I-tENO1, Ura3, Homologia Ura 3'  his3D1 leu2D0 lys2D0 gal80::KANMX gal4::spHIS5)Harmer, et al. ACS Syn Bio. 2023
yMM1763 (BY4741 Matα ura3Δ 0::5' Homologia Ura3, pRPL18B-Gal4DBD-CRY2(535)-tENO1, pRPL18B-Gal4AD-CIB1-tENO1, pGAL1-mScarlet-I-tENO1, Ura3, Ura 3' homologia  his3D1 leu2D0 lys2D0 gal80::KANMX gal4::spHIS5)Harmer, et al. ACS Syn Bio. 2023
yMM1765 (BY4741 Matα ura3Δ 0::5' Homologia Ura3, pRPL18B-Gal4DBD-eMagA-tENO1, pRPL18B-eMagBM-Gal4AD-tENO1, pGAL1-mScarlet-I-tENO1, Ura3, Homologia Ura 3'  his3D1 leu2D0 lys2D0 gal80::KANMX gal4::spHIS5)Harmer, et al. ACS Syn Bio. 2023
YPD AgarSigmaAldrichY1500

Referências

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Pérez, A. L. A., et al. Optogenetic strategies for the control of gene expression in yeasts. Biotechnology Advances. 54, 107839(2022).
  2. Lan, T. -H., He, L., Huang, Y., Zhou, Y. Optogenetics for transcriptional programming and genetic engineering. Tre....

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