Este protocolo apresenta um método abrangente e eficiente para a produção de organoides renais a partir de células-tronco pluripotentes induzidas (iPSCs) utilizando condições de cultura em suspensão. A ênfase primária deste estudo reside na determinação da densidade celular inicial e da concentração do agonista WNT, beneficiando assim os investigadores interessados na pesquisa de organoides renais.
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Artigo de método
Geração de Organoides Renais em Suspensão a partir de Células-Tronco Pluripotentes Induzidas
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Neste artigo
Resumo
Resumo
Os organoides renais podem ser gerados a partir de células-tronco pluripotentes induzidas (iPSCs) através de várias abordagens. Esses organoides são uma grande promessa para modelagem de doenças, triagem de drogas e potenciais aplicações terapêuticas. Este artigo apresenta um procedimento passo a passo para a criação de organoides renais a partir de iPSCs, partindo da estria primitiva posterior (SP) até o mesoderma intermediário (IM). A abordagem baseia-se no meio APEL 2, que é um meio definido e livre de componentes animais. É suplementado com uma alta concentração de agonista WNT (CHIR99021) por uma duração de 4 dias, seguido por fator de crescimento de fibroblastos 9 (FGF9)/heparina e uma baixa concentração de CHIR99021 por mais 3 dias. Durante esse processo, ênfase é dada à seleção da densidade celular e da concentração CHIR99021 ideais no início das iPSCs, pois esses fatores são críticos para o sucesso da geração de organoides renais. Um aspecto importante desse protocolo é a cultura da suspensão em placa de baixa aderência, permitindo que o MI evolua gradualmente para estruturas néfrons, englobando estruturas glomerulares, tubulares proximais e tubulares distais, todas apresentadas em um formato visualmente compreensível. Em geral, este protocolo detalhado oferece uma técnica eficiente e específica para produzir organoides renais a partir de diversas iPSCs, garantindo resultados bem-sucedidos e consistentes.
Introdução
O rim desempenha um papel crítico na manutenção da homeostase fisiológica, dependendo de sua unidade funcional. Néfrons, que excretam produtos residuais, podem regular a composição dos fluidos corporais. A doença renal crônica (DRC), causada por mutações hereditárias ou outros fatores de alto risco, eventualmente evoluirá para doença renal terminal (DRCT)1,2. A DRCT é aparentemente devida à limitada capacidade de regeneração dos néfrons. Assim, a terapia renal substitutiva é necessária. A diferenciação dirigida de iPSCs humanas permite a geração in vitro de organoides renais 3D específicos para o paciente, que podem ser usados para estudar o desenvolvimento renal, modelar doenças específicas do paciente e realizar triagem de drogas nefrotóxicas 3,4.
Durante o desenvolvimento embrionário, os rins originam-se do mesoderma intermediário (IM), que se diferencia da estria primitiva (SP). A via de sinalização WNT clássica pode induzir diferenciação adicional de MI com a participação coordenada de FGF (FGF9, FGF20) e BMP (sinalização Bmp7 através de JNK)5,6,7. Produzem duas importantes populações celulares de células progenitoras nefrônicas (NPC): o broto ureteral (UB) e o mesênquima metanéfrico (MM), formando os ductos coletores e o néfron, respectivamente 8,9. Cada néfron é composto por segmentos glomerulares e tubulares, como os túbulos proximal e distal, e a alça de Henle10,11. De acordo com a teoria mencionada acima, os protocolos atualmente publicados mimetizam as cascatas de sinal e a estimulação do fator de crescimento para induzir organoides renais5,12.
Nos últimos anos, muitos protocolos foram desenvolvidos para diferenciar iPSCs humanas em organoides renais 5,6,7,12. Takasato et al.7 otimizaram a duração do tratamento com CHIR (agonista WNT) antes da reposição por FGF9. De acordo com seu protocolo, a exposição a CHIR por 4 dias, seguida de FGF9 por 3 dias, é a maneira mais eficaz de induzir IM a partir de iPSCs. Filtros transwell foram utilizados como formato de cultura em seu procedimento; no entanto, este método é difícil para iniciantes. Por isso, Kumar et al.13 tentaram mudar o formato da cultura e optaram por suspendê-la. Eles dissociaram as células aderentes no Dia 7 para semeadura em placas de baixa aderência para ajudá-las a se agrupar em corpos embrionários (EBs) que contêm estruturas semelhantes a néfrons. No entanto, o efeito em lote desses métodos foi aparente, especialmente em diferentes iPSCs. Além disso, diferentes literaturas relataram que a concentração de CHIR variou de 7 μM a 12 μM 5,13,14.
Especulamos que a concentração da densidade celular e o CHIR poderiam afetar a geração de organoides em diferentes iPSCs, e isso foi verificado inúmeras vezes em nossos experimentos. O presente protocolo modificou um pouco o método de estudo de Kumar et al.13 e forneceu aos usuários um procedimento passo a passo. O cronograma e o esquema da abordagem são mostrados na Figura 1.
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Protocolo
As iPSCs utilizadas no presente estudo foram obtidas de fonte comercial. As células foram mantidas com meio mTeSR em placas revestidas com matriz de membrana basal comercialmente disponíveis (ver Tabela de Materiais). A Tabela 1 contém todas as composições dos meios utilizados no estudo.
1. Plating iPSCs para diferenciação e indução de estria primitiva posterior (PS)
- Lave as iPSCs na placa de 6 poços revestida com matriz de membrana com 2 mL de DPBS. Aspirar o DPBS usando uma pipeta.
- Adicionar 1 ml da solução de descolamento celular comercialmente disponível (ver Tabela de Materiais) para separar iPSC e incubar a 37 °C durante 5 minutos.
- Adicione 1 mL de mTeSR às iPSCs e verifique se as células se retiraram da superfície plástica.
- Centrifugar as células a 400 x g durante 3 minutos à temperatura ambiente (TR). Ressuspenda a pastilha de células e conte o número de células usando um hemocitômetro.
- Semeando uma variedade de densidades celulares em uma placa de 24 ou 6 poços revestida com matriz de membrana e cultura com mTeSR suplementado com inibidor de Rho quinase de 10 μM (Y-27632) (ver Tabela de Materiais). Cultivá-los durante a noite em uma incubadora CO2 a 37 °C.
NOTA: Para induzir PS, a concentração ótima de CHIR99021 e as densidades celulares adequadas variam de diferentes linhagens de iPSC. Semear uma faixa de densidades (por exemplo, 0,6, 0,9, 1,2, 1,5, 1,8, 2,4 * 103 células únicas por centímetro quadrado) e uma faixa de concentração de CHIR99021 de 7 μM-12 μM. Iniciar a diferenciação de cada densidade e cada CHIR no mesmo dia. Encontre a concentração ideal de CHIR99021 e as densidades celulares adequadas em uma placa de 24 poços e, em seguida, expanda a cultura em placas de 6 poços. Aqui nós fornecemos um protocolo baseado em uma placa de 6 poços. - No dia seguinte, aspirar o mTeSR e lavar as células com 2 mL de DPBS.
- Adicionar 2 mL de meio estágio I (meio de diferenciação de células-tronco contendo 8-12 μM CHIR99021) (Tabela 1), referido como Dia 0.
- Cultivá-los em incubadora a 37 °C por 4 dias, atualizar o meio estágio I a cada dois dias.
2. Indução de mesoderma intermediário nefrogênico (MI)
- No dia 4, retirar o meio estágio I e lavar com 2 mL de DPBS.
- Adicionar 2 mL de meio estágio II às células (meio de diferenciação de células-tronco contendo 200 ng/mL de FGF9, 1 μg/mL de heparina e 1 μM de CHIR99021) (Tabela 1).
- Cultivá-los em uma incubadora de 37 °C e refrescar o meio a cada 2 dias até o dia 7.
3. Geração de organoides renais em cultura de suspensão
NOTA: Durante o período de observação do Dia 0 ao Dia 7, o estado das células é crítico. Se as células exibem expansão bem-sucedida e se acumulam sem debris celulares significativos, isso demonstra a derivação bem-sucedida do mesoderma intermediário (IM), indicando a prontidão para prosseguir para o próximo estágio. No entanto, se as células apresentarem sinais de apoptose inicial, seguida de necrose ou quebra, isso pode ser indicativo de concentrações inadequadas de CHIR99021 ou densidades celulares.
- No dia 7, retirar o meio estágio II e lavar as células com 2 mL de DPBS.
- Adicionar 1 ml da solução de descolamento celular a cada poço e incubar a 37 °C durante 5 minutos até que as células sejam refractivas sob contraste de fase.
- Pipetar 1 mL do meio estágio II para as células, misturar e garantir que as células tenham se retirado da superfície.
- Recolher a suspensão celular num tubo de 15 ml e centrifugar a 400 x g durante 3 minutos à temperatura ambiente.
- Remover o sobrenadante e ressuspender o pellet de células em 2 mL de meio estágio III (meio de diferenciação de células-tronco contendo 200 ng/mL de FGF9, 1 μg/mL de heparina e 1 μM de CHIR99021 em metilcelulose (MC) a 0,1%, álcool polivinílico (PVA) a 0,1%) suplementado com 10 μM de inibidor de Rho quinase (Y-27632) (ver Tabela de Materiais). Misture delicadamente.
- Misture a suspensão celular e a semente em uma placa de baixa adesão de 6 poços na proporção de 1:3. Colocar a placa num agitador orbital (resistente ao CO 2, girando a 60 rpm) numa incubadora a 37 °C e 5% de CO2.
- 24 h depois, remover o inibidor de Rho quinase (Y-27632) e adicionar meio estágio III (suplemento de meio de diferenciação de células-tronco com 200 ng/mL FGF9, 1 μg/mL de heparina, 1 μM CHIR99021, 0,1% MC, 0,1% PVA). Cultura por 2 dias. Mude o meio na cultura de suspensão seguindo os passos abaixo:
- Cortar a ponta da pipeta de 1 ml com tesoura asséptica.
- Agite suavemente a placa de 6 poços para organizar os organoides no meio da placa.
- Aspirar os organoides com as pipetas preparadas para um tubo de 15 mL e deixá-los repousar por 5 min.
- Aspirar o sobrenadante e deixar os organoides no fundo do tubo.
- Adicione o meio fresco para ressuspender os organoides e volte para uma placa de baixa adesão de 6 poços.
- Continue agitando a placa de baixa adesão a 60 rpm na incubadora. Troque o meio estágio III a cada dois dias até o dia 12.
- No dia 12, trocar o meio para o estágio IV (meio de diferenciação de células-tronco contendo 0,1% de MC e 0,1% de PVA).
- Troque o meio a cada dois dias até o dia 25. Os organoides podem gradualmente se desenvolver em estruturas de néfrons maduros do Dia 12-25.
4. Coloração por imunofluorescência de organoides renais
- Recolher organoides renais num tubo de 15 ml e lavar com 2 ml PBS.
- Depois de deixá-lo ajustado por 5-10 min, fixe os organoides renais em PFA a 2% recém-preparado por 20 min a 4 °C.
- Remova o PFA e lave os organoides com 1 mL de PBS contendo Triton X-100 a 0,3% (0,3% PBST), agite-o uniformemente em um agitador (com velocidade de rotação não superior a 60 rpm) por 8 min, deixe repousar por 5 min e, em seguida, retire o sobrenadante. Repita três vezes.
NOTA: Os organoides podem ser armazenados em 0,3% PBST a 4° C por 2-4 semanas. - Incubar os organoides fixos com 10% de soro de burro em PBST (tampão de bloqueio) (ver Tabela de Materiais) durante a noite a 4 °C.
- Diluir os anticorpos primários (listados na Tabela de Materiais) em um tampão de bloqueio com uma proporção de 1:300.
- Incubar os organoides com anticorpos primários durante a noite a 4 °C com agitação.
NOTA: Certifique-se de que os glomérulos e os túbulos possam ser corados simultaneamente em um organoide. - Lave os organoides com 1 mL de PBST a 0,3%, agite-o uniformemente em um agitador (com uma velocidade de rotação não superior a 60 rpm) por 8 min, deixe repousar por 5 min e, em seguida, remova o sobrenadante. Repita três vezes.
- Incubar os organoides com anticorpos secundários (listados na Tabela de Materiais) e DAPI durante a noite a 4 °C com agitação. Em seguida, repita a etapa 4.7.
NOTA: Tanto o anticorpo secundário quanto o DAPI são diluídos em solução de bloqueio, anticorpo secundário (1:400) e DAPI (1:1000). - Após a coloração, desidratar os organoides com metanol (25%, 50%, 75% e 100% por 5 min cada), em seguida, permear com álcool benzílico e benzoato de benzila (BABB, proporção 1:2) (ver Tabela de Materiais) por 5 min.
- Moute os organoides limpos em um prato com fundo de vidro (ver Tabela de Materiais) e examine-os por microscopia confocal.
OBS: Na hora da imagem, escolha a placa de Petri no fundo da placa de vidro e, ao permear, coloque o BABB diretamente na placa de Petri para manter o fundo da placa úmido.
5. Ensaio in vitro de captação de dextran
- No dia 25, incubar os organoides com 100 μg/mL de dextran marcado com fluorescência (ver Tabela de Materiais) por 4 h em uma estufa a 37 °C e 5% CO2.
- 4 horas depois, mude para um meio fresco e capture imagens de cultura de células vivas usando um microscópio de fluorescência de campo largo.
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Resultados
A produção de IM é obtida pela ativação da sinalização canônica WNT usando o inibidor de GSK3 CHIR99021, seguido de FGF9/heparina. Do Dia 0 ao Dia 4, as iPSCs se expandem rapidamente e assumem formas romboides ou triangulares. A confluência atinge 90%-100% e se acumula uniformemente até o 7º dia. Após a cultura da suspensão, os agregados formam espontaneamente estruturas de néfrons após dissociação no 7º dia. Os organoides renais criados através da cultura de suspensão apresentam estruturas tubulares e são facilmente obs...
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Discussão
Um protocolo detalhado foi descrito para a geração de organoides renais a partir de iPSCs, envolvendo pequenas modificações no meio basal, densidade celular inicial e concentração de CHIR99021. Em vários experimentos, os fatores críticos para o sucesso da geração de organoides renais foram a diferenciação inicial do mesoderma intermediário (IM) e o estado celular no Dia 7. Além disso, diferentes linhagens de iPSC exibiram variações na proliferação celular e potencial de diferenciação, resultando em densidades celulares ó...
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Divulgações
Os autores declararam a inexistência de potenciais conflitos de interesse.
Agradecimentos
Somos extremamente gratos a todos os membros do Mao e Hu Lab, do passado e do presente, pelas interessantes discussões e grandes contribuições para o projeto. Agradecemos ao National Clinical Research Center for Child Health pelo grande apoio. Este estudo foi financiado pela Fundação Nacional de Ciências Naturais da China (U20A20351 para Jianhua Mao, 82200784 para Lidan Hu), a Fundação de Ciências Naturais da Província de Zhejiang da China (No. LQ22C070004 a Lidan Hu) e a Fundação de Ciências Naturais da Província de Jiangsu (Subsídios nº. BK20210150 para Gang Wang).
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Placa de Cultura de Células de 96 Poços, Fundo Plano | NEST | Cat #701003 | |
| Accutase | STEMCELL Technologies | Cat #07920 | |
| Anticorpos | |||
| Álcool benzílico | Sigma-Aldrich | Cat #100-51-6 | |
| Benzoato de benzila | Gabinete de Segurança Biológica Sigma-Aldrich | Cat #120-51-4 | |
Haier Cat #HR40  A2 | |||
| Biotina anti-humano LTL (1:300) | Vector Laboratories | Cat #B-1325 | |
| Células mononucleares sanguíneas hiPS-B1 (iPSc, fêmea) | N/A | N/A | |
| Agitador de nível de dióxido de carbono | HAMANY | Cat #C0-06UC6 | |
| Produtos químicos, peptídeos e proteínas | |||
| CHIR99021 (ativador da via Wnt) | STEMCELL Technologies | Cat #72054 | |
| Costar Placa de Cultura de Células Múltiplas de 6 Poços | Corning | Cat #3516 | |
| Costar Ultra-Low Attachment Placa de 6 Poços | Corning | Cat #3471 | |
| CryoStor CS10 | STEMCELL Technologies | Cat #07930 | |
| Solução de coloração DAPI | Coolaber | Cat #SL7102 | |
| Dextran, Alexa Fluor 647 | Thermo SCIENTIFIC | Cat #D22914 | |
| DMEM/F-12 Livre de HEPES | Servicebio Cat #G4610 | ||
| Donkey Anti-Sheep IgG H& L (Alexa Fluor 647) | Abcam | Cat #ab150179 | |
| Donkey serum stoste | Meilunbio | Cat #MB4516-1 | |
| D-PBS (sem cálcio, magnésio, vermelho de fenol) | Incubadora de Banho Seco Solarbio Life Science | Cat #D1040 | |
| Shanghai Jingxin | Cat #JX-10 | ||
| Dylight 488-Goat Anti-Mouse IgG (1:400) | Earthox | Cat #E032210 | |
| Dylight 488-Goat Anti-Rabbit IgG (1:400) | Earthox | Cat #E032220 | |
| Dylight 549-Goat Anti-Mouse IgG (1:400) | Earthox | Cat #E032310 | |
| Dylight 549-Goat Anti-Rabbit IgG (1:400) | Earthox | Cat #E032320 | |
| Dylight 649-Goat Anti-Rabbit IgG (1:400) | Earthox | Cat #E032620 | |
| Modelos experimentais: Linhas celulares | |||
| Incubadora Forma Steri-Cycle CO2 Thermo | SCIENTIFIC | Cat #370 | |
| Geltre LDEV-Free | Gibco | Cat #A1413202 | |
| Pratos de Cultura com Fundo de Vidro | NEST | Cat #801002 | |
| Cabra anti-humano CUBN (1:300) | Santa Cruz Biotechnology | Cat #sc-20607 | |
| Solução de Heparina (Suplemento de cultura celular) | STEMCELL Technologies | Cat #07980 | |
| Humano Recombinante FGF-9 | STEMCELL Technologies | Cat #78161 | |
| Microscópio Invertido | OLYMPUS | Cat #CKX53 | |
| Microscópio Confocal de Varredura a Laser | OLYMPUS | Cat #FV3000 | |
| Metilcelulose | Microcentrífuga | ||
| HENGNUO | Cat #2-4B | ||
| Rato anti-humano CD31 (1:300) | BD Biosciences | Cat #555444 | |
| Rato anti-humano ECAD (1:300) | BD Biosciences | Cat #610182 | |
| Rato anti-humano Integrin beta 1 (1:300) | Abcam | Cat #ab30394 | |
| Mouse anti-humano MEIS 1/2/3 (1:300) | Thermo SCIENTIFIC | Cat #39795 | |
| Mowiol 4-88 ( Polivinilálcool 4-88) | Sigma-Aldrich | Cat #81381 | |
| mTeSR1 5X Suplemento | STEMCELL Technologies | Cat #85852 | |
| mTeSR1 Basal Medium | STEMCELL Technologies | Cat #85851 | |
| Nunc CryoTube Vials | Thermo SCIENTIFIC | Cat #377267 | |
| Outros | |||
| Coelho anti-humano GATA3 (1:300) | Tecnologia de Sinalização Celular | Cat #5852S | |
| Rabbit anti-humano LRP2 (1:300) | Sapphire Bioscience | Cat #NBP2-39033 | |
| Rabbit anti-humano Synaptopodin (1:300) | Abcam | Cat #ab224491 | |
| Rabbit anti-humano WT1 (1:300) | Abcam | Cat #ab89901 | |
| Rabbit anti-mouse PDGFR (1:300) | Abcam | Cat #ab32570 | |
| Albumina sérica humana recombinante (rHSA) | YEASEN | Cat #20901ES03 | |
| Sheep NPHS1 anti-humano (1:300) | R& D Systems | Cat #AF4269 | |
| STEMdiff APEL 2 Médio | STEMCELL Technologies | Cat #05275 | |
| Streptavidin Cy3 (1:400) | Gene Tex | Cat #GTX85902 | |
| Versene (1X) | Gibco | Cat #15040066 | |
| Y-27632 (Dicloridrato) | STEMCELL Technologies | Cat #72304 |
Referências
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Reimpressões e permissões
