Este protocolo apresenta um método abrangente e eficiente para a produção de organoides renais a partir de células-tronco pluripotentes induzidas (iPSCs) utilizando condições de cultura em suspensão. A ênfase primária deste estudo reside na determinação da densidade celular inicial e da concentração do agonista WNT, beneficiando assim os investigadores interessados na pesquisa de organoides renais.
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Artigo de método
Geração de Organoides Renais em Suspensão a partir de Células-Tronco Pluripotentes Induzidas
* These authors contributed equally
Neste artigo
Resumo
Resumo
Os organoides renais podem ser gerados a partir de células-tronco pluripotentes induzidas (iPSCs) através de várias abordagens. Esses organoides são uma grande promessa para modelagem de doenças, triagem de drogas e potenciais aplicações terapêuticas. Este artigo apresenta um procedimento passo a passo para a criação de organoides renais a partir de iPSCs, partindo da estria primitiva posterior (SP) até o mesoderma intermediário (IM). A abordagem baseia-se no meio APEL 2, que é um meio definido e livre de componentes animais. É suplementado com uma alta concentração de agonista WNT (CHIR99021) por uma duração de 4 dias, seguido por fator de crescimento de fibroblastos 9 (FGF9)/heparina e uma baixa concentração de CHIR99021 por mais 3 dias. Durante esse processo, ênfase é dada à seleção da densidade celular e da concentração CHIR99021 ideais no início das iPSCs, pois esses fatores são críticos para o sucesso da geração de organoides renais. Um aspecto importante desse protocolo é a cultura da suspensão em placa de baixa aderência, permitindo que o MI evolua gradualmente para estruturas néfrons, englobando estruturas glomerulares, tubulares proximais e tubulares distais, todas apresentadas em um formato visualmente compreensível. Em geral, este protocolo detalhado oferece uma técnica eficiente e específica para produzir organoides renais a partir de diversas iPSCs, garantindo resultados bem-sucedidos e consistentes.
Introdução
O rim desempenha um papel crítico na manutenção da homeostase fisiológica, dependendo de sua unidade funcional. Néfrons, que excretam produtos residuais, podem regular a composição dos fluidos corporais. A doença renal crônica (DRC), causada por mutações hereditárias ou outros fatores de alto risco, eventualmente evoluirá para doença renal terminal (DRCT)1,2. A DRCT é aparentemente devida à limitada capacidade de regeneração dos néfrons. Assim, a terapia renal substitutiva é necessária. A diferenciação dirigida de iPSCs humanas permite a geração in vitro de organoides renais 3D específicos para o paci....
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Protocolo
As iPSCs utilizadas no presente estudo foram obtidas de fonte comercial. As células foram mantidas com meio mTeSR em placas revestidas com matriz de membrana basal comercialmente disponíveis (ver Tabela de Materiais). A Tabela 1 contém todas as composições dos meios utilizados no estudo.
1. Plating iPSCs para diferenciação e indução de estria primitiva posterior (PS)
- Lave as iPSCs na placa de 6 poços revestida com matriz de membrana com 2 mL de DPBS. Aspirar o DPBS usando uma pipeta.
- Adicionar 1 ml da solução de descolamento celular comercialmente disponível (ver
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Resultados
A produção de IM é obtida pela ativação da sinalização canônica WNT usando o inibidor de GSK3 CHIR99021, seguido de FGF9/heparina. Do Dia 0 ao Dia 4, as iPSCs se expandem rapidamente e assumem formas romboides ou triangulares. A confluência atinge 90%-100% e se acumula uniformemente até o 7º dia. Após a cultura da suspensão, os agregados formam espontaneamente estruturas de néfrons após dissociação no 7º dia. Os organoides renais criados através da cultura de suspensão apresentam estruturas tubulares e são facilmente obs.......
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Discussão
Um protocolo detalhado foi descrito para a geração de organoides renais a partir de iPSCs, envolvendo pequenas modificações no meio basal, densidade celular inicial e concentração de CHIR99021. Em vários experimentos, os fatores críticos para o sucesso da geração de organoides renais foram a diferenciação inicial do mesoderma intermediário (IM) e o estado celular no Dia 7. Além disso, diferentes linhagens de iPSC exibiram variações na proliferação celular e potencial de diferenciação, resultando em densidades celulares ó.......
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Divulgações
Os autores declararam a inexistência de potenciais conflitos de interesse.
Agradecimentos
Somos extremamente gratos a todos os membros do Mao e Hu Lab, do passado e do presente, pelas interessantes discussões e grandes contribuições para o projeto. Agradecemos ao National Clinical Research Center for Child Health pelo grande apoio. Este estudo foi financiado pela Fundação Nacional de Ciências Naturais da China (U20A20351 para Jianhua Mao, 82200784 para Lidan Hu), a Fundação de Ciências Naturais da Província de Zhejiang da China (No. LQ22C070004 a Lidan Hu) e a Fundação de Ciências Naturais da Província de Jiangsu (Subsídios nº. BK20210150 para Gang Wang).
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Placa de Cultura de Células de 96 Poços, Fundo Plano | NEST | Cat #701003 | |
| Accutase | STEMCELL Technologies | Cat #07920 | |
| Anticorpos | |||
| Álcool benzílico | Sigma-Aldrich | Cat #100-51-6 | |
| Benzoato de benzila | Gabinete de Segurança Biológica Sigma-Aldrich | Cat #120-51-4 | |
Haier Cat #HR40  A2 | |||
| Biotina anti-humano LTL (1:300) | Vector Laboratories | Cat #B-1325 | |
| Células mononucleares sanguíneas hiPS-B1 (iPSc, fêmea) | N/A | N/A | |
| Agitador de nível de dióxido de carbono | HAMANY | Cat #C0-06UC6 | |
| Produtos químicos, peptídeos e proteínas | |||
| CHIR99021 (ativador da via Wnt) | STEMCELL Technologies | Cat #72054 | |
| Costar Placa de Cultura de Células Múltiplas de 6 Poços | Corning | Cat #3516 | |
| Costar Ultra-Low Attachment Placa de 6 Poços | Corning | Cat #3471 | |
| CryoStor CS10 | STEMCELL Technologies | Cat #07930 | |
| Solução de coloração DAPI | Coolaber | Cat #SL7102 | |
| Dextran, Alexa Fluor 647 | Thermo SCIENTIFIC | Cat #D22914 | |
| DMEM/F-12 Livre de HEPES | Servicebio Cat #G4610 | ||
| Donkey Anti-Sheep IgG H& L (Alexa Fluor 647) | Abcam | Cat #ab150179 | |
| Donkey serum stoste | Meilunbio | Cat #MB4516-1 | |
| D-PBS (sem cálcio, magnésio, vermelho de fenol) | Incubadora de Banho Seco Solarbio Life Science | Cat #D1040 | |
| Shanghai Jingxin | Cat #JX-10 | ||
| Dylight 488-Goat Anti-Mouse IgG (1:400) | Earthox | Cat #E032210 | |
| Dylight 488-Goat Anti-Rabbit IgG (1:400) | Earthox | Cat #E032220 | |
| Dylight 549-Goat Anti-Mouse IgG (1:400) | Earthox | Cat #E032310 | |
| Dylight 549-Goat Anti-Rabbit IgG (1:400) | Earthox | Cat #E032320 | |
| Dylight 649-Goat Anti-Rabbit IgG (1:400) | Earthox | Cat #E032620 | |
| Modelos experimentais: Linhas celulares | |||
| Incubadora Forma Steri-Cycle CO2 Thermo | SCIENTIFIC | Cat #370 | |
| Geltre LDEV-Free | Gibco | Cat #A1413202 | |
| Pratos de Cultura com Fundo de Vidro | NEST | Cat #801002 | |
| Cabra anti-humano CUBN (1:300) | Santa Cruz Biotechnology | Cat #sc-20607 | |
| Solução de Heparina (Suplemento de cultura celular) | STEMCELL Technologies | Cat #07980 | |
| Humano Recombinante FGF-9 | STEMCELL Technologies | Cat #78161 | |
| Microscópio Invertido | OLYMPUS | Cat #CKX53 | |
| Microscópio Confocal de Varredura a Laser | OLYMPUS | Cat #FV3000 | |
| Metilcelulose | Microcentrífuga | ||
| HENGNUO | Cat #2-4B | ||
| Rato anti-humano CD31 (1:300) | BD Biosciences | Cat #555444 | |
| Rato anti-humano ECAD (1:300) | BD Biosciences | Cat #610182 | |
| Rato anti-humano Integrin beta 1 (1:300) | Abcam | Cat #ab30394 | |
| Mouse anti-humano MEIS 1/2/3 (1:300) | Thermo SCIENTIFIC | Cat #39795 | |
| Mowiol 4-88 ( Polivinilálcool 4-88) | Sigma-Aldrich | Cat #81381 | |
| mTeSR1 5X Suplemento | STEMCELL Technologies | Cat #85852 | |
| mTeSR1 Basal Medium | STEMCELL Technologies | Cat #85851 | |
| Nunc CryoTube Vials | Thermo SCIENTIFIC | Cat #377267 | |
| Outros | |||
| Coelho anti-humano GATA3 (1:300) | Tecnologia de Sinalização Celular | Cat #5852S | |
| Rabbit anti-humano LRP2 (1:300) | Sapphire Bioscience | Cat #NBP2-39033 | |
| Rabbit anti-humano Synaptopodin (1:300) | Abcam | Cat #ab224491 | |
| Rabbit anti-humano WT1 (1:300) | Abcam | Cat #ab89901 | |
| Rabbit anti-mouse PDGFR (1:300) | Abcam | Cat #ab32570 | |
| Albumina sérica humana recombinante (rHSA) | YEASEN | Cat #20901ES03 | |
| Sheep NPHS1 anti-humano (1:300) | R& D Systems | Cat #AF4269 | |
| STEMdiff APEL 2 Médio | STEMCELL Technologies | Cat #05275 | |
| Streptavidin Cy3 (1:400) | Gene Tex | Cat #GTX85902 | |
| Versene (1X) | Gibco | Cat #15040066 | |
| Y-27632 (Dicloridrato) | STEMCELL Technologies | Cat #72304 |
Referências
- Tekguc, M., et al. Kidney organoids: a pioneering model for kidney diseases. Translational Research. 250, 1-17 (2022).
- Hill, N. R., et al. Global prevalence of chronic kidney disease - a systematic review and meta-analysis. PLOS ONE.
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Reimpressões e permissões
