Descrevemos o isolamento, a cultura e a indução adipogênica de pré-adipócitos derivados da fração vascular estromal do tecido adiposo periaórtico de camundongos, permitindo o estudo da função do tecido adiposo perivascular e sua relação com as células vasculares.
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Artigo de método
Isolamento, Cultura e Indução Adipogênica de Pré-adipócitos Derivados da Fração Vascular Estromal do Tecido Adiposo Periaórtico de Camundongos
* These authors contributed equally
Neste artigo
Resumo
Resumo
O tecido adiposo perivascular (PVAT) é um depósito de tecido adiposo que envolve os vasos sanguíneos e exibe os fenótipos de adipócitos brancos, beges e marrons. Descobertas recentes têm lançado luz sobre o papel central do PVAT na regulação da homeostase vascular e participação na patogênese das doenças cardiovasculares. Uma compreensão abrangente das propriedades e regulação do PVAT é de grande importância para o desenvolvimento de terapias futuras. Culturas primárias de adipócitos periaórticos são valiosas para estudar a função do PVAT e o crosstalk entre adipócitos periaórticos e células vasculares. Este trabalho apresenta um protocolo econômico e viável para o isolamento, cultura e indução adipogênica de pré-adipócitos derivados da fração vascular estromal do tecido adiposo periaórtico de camundongos, que pode ser útil para modelar adipogênese ou lipogênese in vitro. O protocolo descreve o processamento tecidual e a diferenciação celular para a cultura de adipócitos periaórticos de camundongos jovens. Este protocolo fornecerá a pedra angular tecnológica no lado da bancada para a investigação da função PVAT.
Introdução
Acredita-se que o tecido adiposo perivascular (PVAT), uma estrutura perivascular composta por uma mistura de adipócitos maduros e uma fração vascular estromal (FVS), interaja com a parede do vaso adjacente através de seu secretoma paracrineamente1. Como regulador crítico da homeostase vascular, a disfunção do PVAT está implicada na patogênese das doençascardiovasculares2,3,4. A FNS do tecido adipocitário consiste de várias populações celulares esperadas, incluindo células endoteliais, células imunes, células mesoteliais, células neuronais e células-tro....
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Protocolo
Os protocolos em animais foram aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais do Shanghai Chest Hospital, afiliado à Escola de Medicina da Universidade Jiao Tong de Xangai (número de aprovação: KS23010) e estavam em conformidade com os regulamentos éticos relevantes. Camundongos C57BL/6 machos e fêmeas com idade entre 4-8 semanas devem ser preferidos para este experimento.
1. Preparo de instrumentais cirúrgicos, tampões e meios de cultura
- Ferramentas cirúrgicas em autoclave (por exemplo, tesoura cirúrgica e pinça padrão) a 121 °C por 30 min. Desinfetar os instrumentos microcirúrgicos com álcool a....
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Resultados
Usando este protocolo descrito acima, isolamos cuidadosamente os PVATs ao redor de aortas torácicas de camundongos (Figura 1A-D). Após lavagem e picagem dos PVATs em pequenos pedaços com tesoura estéril (Figura 1E,F), os fragmentos de tecido foram digeridos em solução de digestão contendo colagenase tipo 1 (1 mg/mL) e dispase II (4 mg/mL) e incubados a 37 °C em agitador por 30-45 min (Figura 1G).
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Discussão
Propomos uma abordagem prática e viável para o isolamento e indução adipogênica de pré-adipócitos derivados da FSV do tecido adiposo periaórtico de camundongos. As vantagens deste protocolo são que ele é simples e econômico. Um número adequado de camundongos é crítico para o sucesso do isolamento, pois tecido insuficiente pode resultar em baixa densidade de FSV e baixo estado de crescimento, afetando a eficiência lipogênica. Além disso, a idade dos camundongos é um fator importante a ser considerado, pois o potencial adi.......
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Divulgações
Os autores declaram não haver conflitos de interesse, financeiros ou não.
Agradecimentos
Este trabalho foi apoiado pela Fundação Nacional de Ciências Naturais da China (82130012 e 81830010) e pelos projetos Nurture para pesquisa básica do Shanghai Chest Hospital (Número de Bolsa: 2022YNJCQ03).
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| 0,2 μ m filtros de seringa | PALL | 4612 | |
| placa de 12 poços | Labselect | 11210 | |
| 15 mL | Labserv | 310109003 | |
| 3,3',5-triiodo-L-thyronine (T3) | Sigma-Aldrich | T-2877 | 1 nM |
| 50 mL tubo de centrífuga | Labselect | CT-002-50A | |
| anti-adiponectina | Abcam | ab22554 | 1:1,000 concentração de trabalho |
| anti-COX IV | CST | 4850 | 1:1.000 concentração de trabalho |
| anti-FABP4 | CST | 2120 | 1:1.000 concentração de trabalho |
| anti-PGC1α | Abcam | ab191838 | 1:1,000 concentração de trabalho |
| anti-PPARγ | Invitrogen | MA5-14889 | 1:1.000 concentração de trabalho |
| anti-UCP1 | Abcam | ab10983 | 1:1.000 concentração de trabalho |
| anti-&alfa;-Actinina | CST | 6487 | 1:1.000 concentração de trabalho |
| BSA | Beyotime | ST023-200g | 1% |
| C57BL/6 camundongos com idade entre 4-8 semanas de ambos os sexos | Shanghai Model Organisms Center, Inc. | ||
| Filtro de Células 70 µ m, nylon | Falcon | 352350 | |
| Colágeno da pele da panturrilha | Sigma-Aldrich | C8919 | |
| Colagenase, Tipo 1 | Worthington | LS004196 | 1 mg/mL |
| Dexametasona | Sigma-Aldrich | D1756 | 1 μ M |
| Dispase II | Sigma-Aldrich | D4693-1G | 4 mg/mL |
| Soro fetal bovino | Gibco | 16000-044 | 10% |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H4034-25G | 20 mM |
| Alta glicose DMEM | Hyclone | SH30022.01 | |
| IBMX | 0,5 mM | Sigma-Aldrich | I7018 |
| com abanador orbital | Shanghai longyue Instrument Eruipment Co., Ltd. | LYZ-103B | |
| Insulina (bovinos) | Sigma-Aldrich | 11070-73-8 | 1 μ M |
| Isoflurano | RWD | R510-22-10 | |
| Solução Krebs-Ringer's | Pricella | PB180347 | proteger da luz |
| Pinça microcirúrgica | Beyotime | FS233 | |
| Tesoura microcirúrgica | Beyotime | FS217 | |
| Óleo Vermelho O | Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd | A600395-0050 | |
| PBS (solução salina tamponada com fosfato) | Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd | B548117-0500 | |
| Penicilina-Estreptomicina | Gibco | 15140122 | |
| Peroxidase AffiniPure Goat Anti-Mouse IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 115-035-146 | 1:5,000 concentração de trabalho |
| Peroxidase AffiniPure Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 111-035-144 | 1:5.000 concentração de trabalho |
| Rosiglitazone | Sigma-Aldrich | R2408 | 1 μ |
| Pinça M Standard | Beyotime | FS225 | |
| Tesoura cirúrgica | Beyotime | FS001 |
Referências
- Akoumianakis, I., Antoniades, C. The interplay between adipose tissue and the cardiovascular system: is fat always bad. Cardiovascular Research. 113 (9), 999-1008 (2017).
- Huang, C. L., et al.
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Reimpressões e permissões
