Descrevemos o isolamento, a cultura e a indução adipogênica de pré-adipócitos derivados da fração vascular estromal do tecido adiposo periaórtico de camundongos, permitindo o estudo da função do tecido adiposo perivascular e sua relação com as células vasculares.
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Artigo de método
Isolamento, Cultura e Indução Adipogênica de Pré-adipócitos Derivados da Fração Vascular Estromal do Tecido Adiposo Periaórtico de Camundongos
* These authors contributed equally
Neste artigo
Resumo
Resumo
O tecido adiposo perivascular (PVAT) é um depósito de tecido adiposo que envolve os vasos sanguíneos e exibe os fenótipos de adipócitos brancos, beges e marrons. Descobertas recentes têm lançado luz sobre o papel central do PVAT na regulação da homeostase vascular e participação na patogênese das doenças cardiovasculares. Uma compreensão abrangente das propriedades e regulação do PVAT é de grande importância para o desenvolvimento de terapias futuras. Culturas primárias de adipócitos periaórticos são valiosas para estudar a função do PVAT e o crosstalk entre adipócitos periaórticos e células vasculares. Este trabalho apresenta um protocolo econômico e viável para o isolamento, cultura e indução adipogênica de pré-adipócitos derivados da fração vascular estromal do tecido adiposo periaórtico de camundongos, que pode ser útil para modelar adipogênese ou lipogênese in vitro. O protocolo descreve o processamento tecidual e a diferenciação celular para a cultura de adipócitos periaórticos de camundongos jovens. Este protocolo fornecerá a pedra angular tecnológica no lado da bancada para a investigação da função PVAT.
Introdução
Acredita-se que o tecido adiposo perivascular (PVAT), uma estrutura perivascular composta por uma mistura de adipócitos maduros e uma fração vascular estromal (FVS), interaja com a parede do vaso adjacente através de seu secretoma paracrineamente1. Como regulador crítico da homeostase vascular, a disfunção do PVAT está implicada na patogênese das doençascardiovasculares2,3,4. A FNS do tecido adipocitário consiste de várias populações celulares esperadas, incluindo células endoteliais, células imunes, células mesoteliais, células neuronais e células-tronco adiposas e progenitoras (ASPCs)5,6. Sabe-se que as ASPCs residentes na FVS do tecido adiposo podem dar origem a adipócitos maduros5. Infere-se que a FVS seja uma fonte crítica de adipócitos maduros em PVAT. Vários estudos têm demonstrado que o PVAT-SVF pode se diferenciar em adipócitos maduros sob condições específicas de indução 6,7,8.
Atualmente, existem dois sistemas de isolamento para isolar a FSV do tecido adiposo, um é a digestão enzimática e o outro é o nãoenzimático9. Métodos enzimáticos tipicamente resultam em maior rendimento de células progenitoras nucleadas10. Até o momento, os benefícios da FVS em promover regeneração vascular e neovascularização na cicatrização de feridas, doenças urogenitais e cardiovasculares têm sido amplamente demonstrados11, especialmente na dermatologia e na cirurgiaplástica12,13. No entanto, as perspectivas de aplicação clínica da FV derivada do PVAT ainda não foram bem exploradas, o que pode ser atribuído à falta de um método padronizado para o isolamento da FVS do PVAT. O objetivo deste protocolo é estabelecer uma abordagem padronizada para o isolamento, cultura e indução adipogênica de pré-adipócitos derivados da FVA a partir de PVAT de camundongos ao redor da aorta torácica, permitindo uma investigação mais aprofundada da função da PVAT. Este protocolo otimiza técnicas de processamento tecidual e diferenciação celular para cultura de adipócitos periaórticos obtidos de camundongos jovens.
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Protocolo
Os protocolos em animais foram aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais do Shanghai Chest Hospital, afiliado à Escola de Medicina da Universidade Jiao Tong de Xangai (número de aprovação: KS23010) e estavam em conformidade com os regulamentos éticos relevantes. Camundongos C57BL/6 machos e fêmeas com idade entre 4-8 semanas devem ser preferidos para este experimento.
1. Preparo de instrumentais cirúrgicos, tampões e meios de cultura
- Ferramentas cirúrgicas em autoclave (por exemplo, tesoura cirúrgica e pinça padrão) a 121 °C por 30 min. Desinfetar os instrumentos microcirúrgicos com álcool a 75%.
- Preparar solução salina estéril tamponada com fosfato (PBS) suplementada com penicilina-estreptomicina a 1% v/v e mais 10 mL de PBS suplementado com penicilina-estreptomicina a 10% v/v.
NOTA: Nas seções a seguir, se não for especificamente mencionado, PBS refere-se a PBS estéril regular. - Preparar tampão Krebs Ringer HEPES BSA: albumina de soro bovino (BSA) a 1%, HEPES 20 mM dissolvido em solução de Krebs Ringer.
- Preparar solução de digestão fresca: colagenase tipo 1 (1 mg/mL) e dispase II (4 mg/mL) dissolvida em tampão Krebs Ringer HEPES BSA. Esterilizar a solução com um filtro de 0,2 μm.
- Prepare uma placa de 12 poços revestida de colágeno.
- Diluir a solução de colágeno (1 mg/mL) com água deionizada estéril até a concentração de 40 μg/mL. Adicionar 1 ml da solução de colagénio diluída na superfície de cada poço para atingir uma concentração de 6-10 μg/cm2. Incubar o revestimento durante 1 h à temperatura ambiente.
- Retire a solução restante e lave cada poço 2x com 1 mL de PBS. Use a placa imediatamente ou seque a placa ao ar em uma capela de fluxo laminar classe II e armazene a placa revestida a 2-8 °C. Ao armazenar, sele as placas revestidas com parafilme.
- Preparar meio de cultura: meio Dulbecco's Modified Eagles (DMEM) com alto teor de glicose, 10% de soro fetal bovino (FBS), 1% v/v penicilina-estreptomicina. Manter a 4 °C até 2 semanas.
- Preparar meio de indução lipogênico: DMEM de alta glicose, FBS a 10%, penicilina-estreptomicina 1% v/v, triiodotironina 1 nM, rosiglitazona 1 μM, insulina 1 μM, 3-isobutil-1-metilxantina 0,5 mM (IBMX) e dexametasona 1 μM. Manter a 4 °C até 2 semanas.
- Preparar meio de manutenção: DMEM de alta glicose, FBS a 10%, penicilina-estreptomicina a 1% v/v, triiodotironina 1 nM, rosiglitazona 1 μM e insulina a 1 μM. Manter a 4 °C até 2 semanas.
2. Dissecção e isolamento do tecido adiposo perivascular (PVAT)
- Eutanásia do camundongo por luxação cervical sob anestesia com isoflurano a 2% ou com overdose de dióxido de carbono. Borrifar com álcool 75% para desinfecção da pele.
- Coloque o rato em decúbito dorsal horizontal (virado para cima).
- Levante a pele, faça uma pequena incisão e separe sem rodeios a pele e os músculos abdominais com uma tesoura cirúrgica ao longo da linha média ventral da pelve até o pescoço. Exponha o coração e os pulmões cortando o diafragma e as costelas ao longo de ambos os lados da linha média.
- Remova cuidadosamente o fígado, baço, intestinos e rins. Evite cortar a parede intestinal.
- Remova os pulmões e o esôfago.
- Levante suavemente o coração com pinça em uma mão e separe a aorta da coluna vertebral com tesoura cirúrgica na outra mão. Em seguida, colocar o coração e a aorta em uma placa de Petri de 60 mm com PBS contendo penicilina-estreptomicina a 1% v/v.
- Retire a pinça microcirúrgica e a tesoura microcirúrgica do álcool e enxágue em 25 mL de PBS para remover o excesso de álcool. Sob um microscópio estéreo, remova o timo e outros tecidos do coração e da aorta, em seguida, remova o coração, deixando a aorta com os PVATs.
- Transferir a aorta com os PVATs para uma placa de Petri limpa de 60 mm com PBS contendo 1% v/v de penicilina-estreptomicina.
- Utilizar pinças microcirúrgicas para retirar os PVATs, com um par de pinças fixando a aorta e a outra arrancando o tecido adiposo. Remova o tecido da vasculatura tanto quanto possível, minimizando os danos ao tecido adiposo perivascular.
- Coletar o PVAT ao redor da aorta torácica no tubo de microcentrífuga de 2 mL contendo DMEM com alto teor de glicose suplementado com penicilina-estreptomicina a 1% v/v colocado sobre gelo.
3. Isolamento da fração vascular estromal (FVS)
- Enxaguar sequencialmente os tecidos coletados com PBS contendo penicilina-estreptomicina a 10% v/v e PBS contendo penicilina-estreptomicina a 1% v/v.
NOTA: A partir desta etapa, todos os experimentos devem ser realizados em condições estéreis em uma capela de fluxo laminar classe II. - Transfira os tecidos para uma placa de Petri estéril de 60 mm, adicione 200 μL de solução de digestão e pique-os em pedaços de 1 mm3 usando tesoura estéril.
- Transfira a mistura para um tubo de centrífuga de 15 mL usando uma ponta de pipeta de plástico, a extremidade alargada por um corte de tesoura estéril, e adicione 6 mL de solução de digestão para iniciar a reação de digestão.
NOTA: Uma reação de digestão (3 mL de solução de digestão) é suficiente para depósitos de PVAT de seis camundongos. - Incubar os tecidos a 37 °C numa estufa com um agitador orbital (frequência de 150 rpm para uma mistura eficaz) durante 30-45 minutos. Amarre os tubos em um rack para fazer os tubos tremerem horizontalmente. Agite para cima e para baixo vigorosamente com a mão por 10 s a cada 5-10 min.
NOTA: A digestão pode ser interrompida quando um fluido digestivo homogêneo e amarelado é visto sem fragmentos de tecido restantes. - Coar os tecidos digeridos através de um filtro celular de 70 μm em um tubo de centrífuga de 50 mL. Enxaguar o filtro celular com um volume igual de meio de cultura para maximizar o rendimento celular e interromper a digestão.
- Transfira o filtrado para um novo tubo de centrífuga de 15 mL e centrífuga a 1.800 × g por 10 min. Inverter o tubo para descartar o sobrenadante e ressuspender os pellets em 5 mL de PBS. Centrifugar a 1.800 × g por 5 min.
- Descarte o sobrenadante invertendo o tubo e ressuspenda os pellets em volume apropriado de meio de cultura.
NOTA: Os pellets celulares coletados de cada seis camundongos são ressuspensos em 1 mL de meio de cultura e semeados em um poço de uma placa de 12 poços. - Semeando as células em uma placa de 12 poços revestida de colágeno e incubar a 37 °C em uma atmosfera úmida com 5% de CO2 durante a noite.
- No dia seguinte, aspirar o meio de cultura, lavar as células com PBS pré-aquecido (37 °C) contendo penicilina-estreptomicina a 1% v/v para remover restos celulares e hemácias e adicionar de volta 1 mL de meio de cultura fresco em cada poço.
4. Indução adipogênica de pré-adipócitos derivados da FVA do tecido adiposo periaórtico
- Troque o meio de cultura a cada dois dias até que as células atinjam ~60-70% de confluência.
NOTA: Geralmente leva 3-4 dias para que as células atinjam 60-70% de confluência. - Quando as células atingirem 60-70% de confluência, aspirar o meio de cultura e substituí-lo por meio de indução adipogênico marrom. Considerar o dia de indução da diferenciação adipogênica como o dia 0 da diferenciação.
- Após 72 h (dia 3 de diferenciação), refrescar o meio com o meio de manutenção. Troque o meio de manutenção a cada 2 dias até que as células sejam usadas para experimentos.
- Analisar as células adipogênicas de forma adequada, como coloração Oil Red O14 e western blotting15.
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Resultados
Usando este protocolo descrito acima, isolamos cuidadosamente os PVATs ao redor de aortas torácicas de camundongos (Figura 1A-D). Após lavagem e picagem dos PVATs em pequenos pedaços com tesoura estéril (Figura 1E,F), os fragmentos de tecido foram digeridos em solução de digestão contendo colagenase tipo 1 (1 mg/mL) e dispase II (4 mg/mL) e incubados a 37 °C em agitador por 30-45 min (Figura 1G).
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Discussão
Propomos uma abordagem prática e viável para o isolamento e indução adipogênica de pré-adipócitos derivados da FSV do tecido adiposo periaórtico de camundongos. As vantagens deste protocolo são que ele é simples e econômico. Um número adequado de camundongos é crítico para o sucesso do isolamento, pois tecido insuficiente pode resultar em baixa densidade de FSV e baixo estado de crescimento, afetando a eficiência lipogênica. Além disso, a idade dos camundongos é um fator importante a ser considerado, pois o potencial adi...
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Divulgações
Os autores declaram não haver conflitos de interesse, financeiros ou não.
Agradecimentos
Este trabalho foi apoiado pela Fundação Nacional de Ciências Naturais da China (82130012 e 81830010) e pelos projetos Nurture para pesquisa básica do Shanghai Chest Hospital (Número de Bolsa: 2022YNJCQ03).
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| 0,2 μ m filtros de seringa | PALL | 4612 | |
| placa de 12 poços | Labselect | 11210 | |
| 15 mL | Labserv | 310109003 | |
| 3,3',5-triiodo-L-thyronine (T3) | Sigma-Aldrich | T-2877 | 1 nM |
| 50 mL tubo de centrífuga | Labselect | CT-002-50A | |
| anti-adiponectina | Abcam | ab22554 | 1:1,000 concentração de trabalho |
| anti-COX IV | CST | 4850 | 1:1.000 concentração de trabalho |
| anti-FABP4 | CST | 2120 | 1:1.000 concentração de trabalho |
| anti-PGC1α | Abcam | ab191838 | 1:1,000 concentração de trabalho |
| anti-PPARγ | Invitrogen | MA5-14889 | 1:1.000 concentração de trabalho |
| anti-UCP1 | Abcam | ab10983 | 1:1.000 concentração de trabalho |
| anti-&alfa;-Actinina | CST | 6487 | 1:1.000 concentração de trabalho |
| BSA | Beyotime | ST023-200g | 1% |
| C57BL/6 camundongos com idade entre 4-8 semanas de ambos os sexos | Shanghai Model Organisms Center, Inc. | ||
| Filtro de Células 70 µ m, nylon | Falcon | 352350 | |
| Colágeno da pele da panturrilha | Sigma-Aldrich | C8919 | |
| Colagenase, Tipo 1 | Worthington | LS004196 | 1 mg/mL |
| Dexametasona | Sigma-Aldrich | D1756 | 1 μ M |
| Dispase II | Sigma-Aldrich | D4693-1G | 4 mg/mL |
| Soro fetal bovino | Gibco | 16000-044 | 10% |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H4034-25G | 20 mM |
| Alta glicose DMEM | Hyclone | SH30022.01 | |
| IBMX | 0,5 mM | Sigma-Aldrich | I7018 |
| com abanador orbital | Shanghai longyue Instrument Eruipment Co., Ltd. | LYZ-103B | |
| Insulina (bovinos) | Sigma-Aldrich | 11070-73-8 | 1 μ M |
| Isoflurano | RWD | R510-22-10 | |
| Solução Krebs-Ringer's | Pricella | PB180347 | proteger da luz |
| Pinça microcirúrgica | Beyotime | FS233 | |
| Tesoura microcirúrgica | Beyotime | FS217 | |
| Óleo Vermelho O | Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd | A600395-0050 | |
| PBS (solução salina tamponada com fosfato) | Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd | B548117-0500 | |
| Penicilina-Estreptomicina | Gibco | 15140122 | |
| Peroxidase AffiniPure Goat Anti-Mouse IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 115-035-146 | 1:5,000 concentração de trabalho |
| Peroxidase AffiniPure Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 111-035-144 | 1:5.000 concentração de trabalho |
| Rosiglitazone | Sigma-Aldrich | R2408 | 1 μ |
| Pinça M Standard | Beyotime | FS225 | |
| Tesoura cirúrgica | Beyotime | FS001 |
Referências
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Reimpressões e permissões
