Extração de DNA livre de células de espécimes de humor vítreo e aquoso para diagnóstico e monitoramento de linfoma vitreorretiniano

Resumo

Um procedimento para extrair DNA livre de células do humor vítreo e aquoso para realizar estudos moleculares para o diagnóstico de linfoma vitreorretiniano é estabelecido aqui. O método oferece a capacidade de extrair simultaneamente o DNA do componente celular da amostra ou reservá-lo para testes auxiliares.

Resumo

O linfoma vitreorretiniano (LVV) representa um linfoma agressivo, frequentemente categorizado como linfoma primário de grandes células B difuso do sistema nervoso central. Para o diagnóstico da LVR, são coletados espécimes como humor vítreo e, mais recentemente, humor aquoso. Os testes diagnósticos para VRL nesses espécimes incluem citologia, citometria de fluxo e teste molecular. No entanto, tanto a citopatologia quanto a citometria de fluxo, juntamente com o teste molecular usando DNA celular, necessitam de células inteiras intactas. O desafio está no fato de que o humor vítreo e aquoso normalmente tem baixa celularidade, e muitas células são destruídas durante a coleta, armazenamento e processamento. Além disso, esses espécimes apresentam dificuldades adicionais para testes moleculares devido à alta viscosidade do humor vítreo e ao baixo volume do humor vítreo e aquoso. Este estudo propõe um método para extração de DNA livre de células de espécimes vítreos e aquosos. Essa abordagem complementa a extração de DNA celular ou permite que o componente celular desses espécimes seja utilizado para outros métodos diagnósticos, incluindo citologia e citometria de fluxo.

Introdução

O linfoma vitreorretiniano (LMR) é um linfoma agressivo associado ao linfoma difuso primário de grandes células B do sistema nervoso ^central1,2,3. A VRL é tipicamente fatal devido ao seu envolvimento no sistema nervoso central ^1,2. Embora rara^1,4, a VRL frequentemente apresenta sintomas semelhantes à uveíte posterior e outras doenças vitreorretinianas4,5. Consequentemente, os pacientes que apresentam sintomas de uveíte requerem um diagnóstico para confirmar ou descartar a VRL.

Recentemente, foram publicados critérios consensuais para o diagnóstico de VRL, que envolvem uma combinação de exame clínico e achados^{laboratoriais6}. Espécimes comumente utilizados para o diagnóstico de VRL incluem humor vítreo e, mais recentemente, humor aquoso⁷. O humor vítreo é obtido através de um procedimento cirúrgico denominado vitrectomia pars plana, que permite o acesso ao segmento posterior do olho⁸.

No protocolo apresentado, espécimes de humor aquoso e vítreo foram coletados para extração celular e de cfDNA. Após anestesia dos pacientes e colocação de trocárteres a aproximadamente 4 mm do limbo corneano, obteve-se uma amostra de humor aquoso de aproximadamente 100-200 μL utilizando seringa tuberculínica de 1 mL no limbo corneano. Para os pacientes pseudofácicos, o vítreo não diluído foi obtido pela introdução de ar estéril na infusão, permitindo a coleta de maior quantidade de vítreo não diluído (até 3,5 mL). Em pacientes fácicos, aproximadamente 500 a 1000 μL de vítreo não diluído foram removidos antes de iniciar uma infusão de solução salina balanceada. Em alguns casos, o vítreo secundariamente diluído (500 a 2.000 μL) foi coletado trocando-se a infusão para fluido e colocando-se o vitrector dentro da saia vítrea para obter essa amostra. A fração vítrea mais diluída foi coletada preservando-se a bolsa (Figura 1 suplementar) ao final da cirurgia. Uma vez que essa bolsa chegava ao departamento de patologia, o vítreo diluído era obtido a partir da drenagem do líquido para fora dessa bolsa em tubos cônicos para posterior extração de DNA.

A citopatologia do líquido vítreo é frequentemente considerada padrão-ouro9. Entretanto, vários estudos têm demonstrado sensibilidade limitada devido ao processamento e à celularidade mínima10,11,12. A citometria de fluxo pode auxiliar na identificação de células B clonais, mas também pode ser limitada pela baixa celularidade e fragilidade das grandes células do linfoma^13,14,15. Tanto a citopatologia quanto a citometria de fluxo requerem células inteiras intactas. Muitas dessas células são destruídas durante a coleta, armazenamento e processamento. Quando o teste molecular é realizado usando DNA extraído de células intactas (DNA celular), ele sofre dessa mesma limitação. Além disso, dividir o espécime vítreo limitado para todos esses testes reduz a quantidade de material disponível para cada teste.

O DNA livre de células (cfDNA) representa outra fonte de DNA que não requer células intactas. O cfDNA de espécimes vítreos tem sido utilizado para a detecção de VRL ^16,17 e melanoma uveal¹⁸. Neste protocolo, DNA celular e livre de células são extraídos do líquido vítreo e aquoso para detectar VRL.

Protocolo

O presente protocolo segue as diretrizes de cuidados humanos e com aprovação do comitê de revisão institucional (IRB) da Universidade de Michigan. Para tal, obteve-se a dispensa do termo de consentimento livre e esclarecido junto ao CEP. Não há critérios relevantes de inclusão ou exclusão para os pacientes envolvidos.

1. Separação de componentes celulares e livres de células

NOTA: Três tipos de amostras podem ser recebidas para testes diagnósticos de VRL: vítreo (não diluído; líquido de vitrectomia coletado antes do início da infusão), vítreo diluído dentro de uma bolsa de fita (Figura 1) e humor aquoso (líquido da câmara anterior do olho).

1. Para o líquido vítreo não diluído, que é muito viscoso, diluir com 3-5 mL PBS para facilitar a pipetagem.
2. Para diluir o vítreo dentro da bolsa (Figura 1 suplementar), drene o líquido para tubos cônicos de 50 mL (um para cada 45 mL de líquido).
3. O humor aquoso é muito baixo em volume (<200 μL). Para garantir a máxima recuperação das células, transferir a amostra para um tubo de 1,5 mL, enxaguar o tubo de microcentrífuga original de 500 μL em que a amostra foi coletada com um volume igual de PBS e adicionar ao tubo de 1,5 mL.
4. Centrifugar o líquido vítreo ou aquoso a 3.000 x g por 15 min à temperatura ambiente.
5. Remova cuidadosamente o sobrenadante usando uma pipeta, tomando cuidado para não perturbar as células peletizadas.

2. Extração de DNA do componente celular

1. Adicionar uma quantidade adequada de solução de lise celular (300 μL para pastilha pequena, 1 mL ou mais para pastilha maior) (ver Tabela de Materiais). Misture pipetando para cima e para baixo.
2. Quando completamente lisado, adicionar 1/3 do volume total da solução de precipitado proteico (100 μL para 300 μL de lisado) (ver Tabela de Materiais).
3. Vórtice vigorosamente por 20-30 s. Gire por 3 min a 3.000 x g à temperatura ambiente.
4. Pipetar 300 μL de isopropanol para um tubo de microcentrífuga limpo. Pipetar cuidadosamente o sobrenadante do passo anterior para o tubo de isopropanol.
5. Adicionar 1,5 μL de 20 mg/ml de glicogénio (para lise de 300 μL) (ver Tabela de Materiais).
6. Misture bem por inversão e, em seguida, coloque a amostra em um freezer de -20 °C por 1 h durante a noite para ajudar na precipitação de DNA.
7. Centrifugar o tubo de 1,5 mL por 5 min a 3.000 x g à temperatura ambiente. Pipetar o isopropanol.
8. Adicionar 0,5 mL de etanol 70% e inverter o tubo para lavar o pellet.
9. Gire por 1 min a 3.000 x g à temperatura ambiente e decante o etanol. Repita a lavagem com etanol uma vez.
10. Inverta o tubo em gaze limpa para drenar a solução e secar o pellet ou decantar. Gire rapidamente o DNA em uma microcentrífuga e pipete a gota restante de etanol com uma ponta de pipeta descartável de ponta fina (uma vez que nenhum etanol residual é deixado no tubo, o DNA deve estar seco e pronto para hidratar em 5-10 min).
11. Adicionar 45 μL de solução de hidratação de ADN (ver Tabela de Materiais) à pastilha de ADN seca.
12. Coloque o tubo num bloco de aquecimento a 50 °C e deixe-o solubilizar durante 1-2 horas. Pipete o DNA para cima e para baixo para acelerar o processo de hidratação.
    NOTA: Adicione mais solução de hidratação de ADN se a amostra parecer demasiado viscosa.

3. Extração de DNA livre de células

1. A quantidade de sobrenadante do passo 1.5 é variável. Adicionar 70 μL de tampão condicionante (ver Tabela de Materiais) para cada mililitro do sobrenadante.
2. Misture bem as contas limpando por vórtice. Adicionar 10 μL de contas de limpeza se processar <14 mL de sobrenadante livre de células, 20 μL se processar 14-40 mL.
3. Misture bem a mistura amostra/grânulo por vórtice. Centrifugar a 3.000 x g por 15 min à temperatura ambiente.
4. Sem perturbar o pellet, pipetar o sobrenadante deixando para trás 100 μL se forem utilizados 10 μL de contas de limpeza e 200 μL se forem utilizados 20 μL de contas de limpeza.
5. Adicione um volume igual de tampão de digestão de pellets de urina (ver Tabela de Materiais) ao pellet e ressuspenda bem o pellet por vórtice ou pipetagem.
6. Adicione Proteinase K (5% (v/v)) ao pellet ressuspendido (por exemplo, adicione 10 μL de Proteinase K à mistura de 200 μL) e misture bem por vórtice suave.
7. Incubar a mistura de pellets a 55 °C durante 30 min.
8. Adicione um volume de tampão de lise genómica (ver Tabela de Materiais) à mistura de digestão (por exemplo, 210 μL de tampão de lise genómica para 210 μL de mistura de digestão) e misture por vórtice.
9. Transfira a coluna de rotação disponível comercialmente (consulte Tabela de Materiais) para um novo tubo de coleta.
10. Adicionar 200 μL de tampão Urine DNA Prep à coluna de spin, centrifugar a ≥16.000 x g por 1 min à temperatura ambiente e descartar o fluxo.
11. Adicionar 700 μL de tampão de lavagem de DNA urinário à coluna, centrifugar a ≥16.000 x g por 1 min à temperatura ambiente e descartar o fluxo.
12. Repita o passo com 200 μL de tampão de lavagem de DNA urinário.
13. Transfira a coluna de spin para um tubo de microcentrífuga livre de DNase/RNase.
14. Adicionar o volume adequado de tampão de eluição de ADN (com base nos testes moleculares a efectuar) directamente na matriz da coluna e deixá-la repousar durante 3-5 minutos à temperatura ambiente.
    NOTA: 30 μL de tampão de eluição foi usado nos casos de exemplo. Mais buffer de eluição é usado se testes adicionais forem necessários.
15. Centrifugar a ≥16.000 x g à temperatura ambiente por 1 min para obter o DNA livre de células.

Resultados

Esses métodos de extração foram realizados em um número limitado de casos para garantir o rendimento adequado e a amplificabilidade do DNA livre de células em comparação com o DNA celular dos espécimes vítreos (quatro) e aquosos (quatro). A partir dessas amostras, os rendimentos de DNA do componente livre de células desses fluidos são semelhantes aos do componente celular (Tabela 1). O DNA celular e o cfDNA dessas amostras também foram avaliados por meio de testes moleculares, como para a mutação associada ao VRL MYD88 L265P. Uma PCR alelo-específica em tempo real para MYD88 L265P (Figura 1) ilustra a detecção dessa mutação associada ao VRL tanto no DNA celular quanto no cfDNA. Neste exemplo, a carga de doença parece ser maior no componente livre de células, como ilustrado por um menor (limiar de ciclo (Ct). Esses dados ilustram que o cfDNA extraído do humor vítreo e aquoso usando este método resulta em uma fonte de DNA que também pode ser aplicada a testes moleculares diagnósticos.

Figura 1: PCR em tempo real específico do alelo MYD88 L265P. Gráfico de amplificação representativo mostrando PCR em tempo real específico do alelo MYD88 L265P para DNA celular e livre de células (cada reação de PCR realizada em duplicata). O limiar para o limiar de ciclo (Ct) é indicado pela linha verde. Os pontos em que a amplificação do cfDNA (traços azuis e marrons) e do DNA celular (traços vermelhos e verdes) - cada um realizado em duplicata - atingem o limiar são marcados. A fluorescência de fundo está presente perto de 1.00e-003. Uma carga de mutação mais alta está presente no componente livre de células, como demonstrado por um CT mais baixo.

	Celular	Sem células
Vítreo 1	130.5	67.5
Vítreo 2	337.5	105
Vítreo 3	150	168
Vítreo 4	1816	654
Aquoso 1	58.5	40.5
Aquoso 2	153	225
Aquoso 3	117	454.5
Aquoso 4	TL	27

Tabela 1: Rendimentos da extração de DNA celular e livre de células. Rendimento de DNA (em ng) para quatro fluidos vítreos não diluídos e quatro de humor aquoso (câmara anterior) de quatro indivíduos diferentes com base na quantificação fluorométrica de DNA. CT = muito baixo para quantificar.

Figura suplementar 1: Saco de vítreo. Exemplo de saco de vítreo contendo líquido vítreo diluído. Clique aqui para baixar este arquivo.

Discussão

O linfoma vitreorretiniano (LMR) é um linfoma agressivo de grandes células B ^1,2,3 cujos sintomas podem mimetizar outras doenças vitreorretinianas4,5. O teste molecular do humor vítreo e, mais recentemente, aquoso tornou-se um método crítico para fazer o diagnóstico de VRL ou descartá-lo. No entanto, esses fluidos são muito baixos em volume e muitas vezes têm baixa celularidade. Muitas das células contidas nesses fluidos também podem ser danificadas durante a coleta, armazenamento e processamento^13,14,15. Como resultado, os rendimentos de DNA desses espécimes são frequentemente baixos. Além disso, as células desses fluidos devem ser compartilhadas com outros métodos diagnósticos, incluindo citopatologia e citometria de fluxo. O DNA livre de células (cfDNA) dentro desses fluidos fornece outra fonte de DNA que não requer células intactas.

Este protocolo separa os componentes celulares e livres de células do líquido vítreo ou aquoso. O fluido vítreo é diluído com PBS para permitir a pipetagem devido à sua viscosidade. O fluido aquoso é manipulado para garantir a máxima recuperação deste fluido de volume muito baixo.

Uma comparação dos rendimentos de DNA desses dois componentes ilustra que um ácido nucleico adicional substancial pode ser derivado do componente livre de células. Testes moleculares de cfDNA, como a PCR em tempo real específica do alelo MYD88 L265P, demonstram que o VRL pode ser detectado no componente livre de células do humor vítreo e aquoso, bem como no componente celular. Em muitos casos, a quantidade relativa de VRL é maior no componente livre de células do que no celular (Figura 1).

A extração do componente livre de células do fluido vítreo e aquoso permite a avaliação molecular de um componente desses fluidos que, de outra forma, seria descartado. Como a VRL está representada em componentes celulares e livres de células, o DNA celular e o cfDNA podem ser combinados para maximizar o DNA disponível desses espécimes limitados. Alternativamente, o componente livre de células desses fluidos poderia ser usado para testes moleculares, e o componente celular poderia ser usado para testes que requerem células intactas, ou seja, citopatologia e citometria de fluxo. Essa abordagem evitaria que alíquotas separadas desses fluidos fossem alocadas para cada teste, o que pode comprometer a sensibilidade de cada teste para a detecção de VRL. Dado o sucesso deste método em espécimes vítreos e aquosos, este método também pode ser útil em outros fluidos limitados para aumentar a quantidade de DNA disponível para testes moleculares.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
2-Propanol (Isopropanol)	Fischer	A415-500
DNA Clean & Concentrador-10	Zymo Research	D4011
DNA Clean & Concentrador-5	Zymo Research	D4003
Gentra Puregene Cell Lysis Solution	Qiagen	158906
Gentra Puregene DNA Hydration Solution	Qiagen	158916
Gentra Puregene Protein	Precipitation Solution Qiagen	158912
Phosphate Buffered Saline (PBS)	Sigma	P-4417
Quick-DNA Kit de Urina	Zymo Research	D3061	Tampão de condicionamento; também inclui esferas de limpeza, Proteinase K e colunas de spin
Glicogênio Ultrapuro, 20 µ g/µ L (20 mg/ml)	Thermo Fisher/Invitrogen	10814010