Combinando um Olfatômetro Sincronizado com a Respiração com Simulação Cerebral para Estudar o Impacto dos Odores na Excitabilidade Corticoespinhal e Conectividade Eficaz

Summary

Este trabalho descreve o uso de um olfatômetro sincronizado com a respiração para desencadear a estimulação magnética transcraniana (EMT) de bobina única e dupla durante a apresentação do odor sincronizada à respiração nasal humana. Essa combinação nos permite investigar objetivamente como odores agradáveis e desagradáveis afetam a excitabilidade corticoespinhal e a conectividade cerebral efetiva em um determinado indivíduo.

Abstract

É amplamente aceito que a estimulação olfatória provoca comportamentos motores, como aproximar-se de odorantes agradáveis e evitar os desagradáveis, em animais e humanos. Recentemente, estudos utilizando eletroencefalografia e estimulação magnética transcraniana (EMT) têm demonstrado uma forte ligação entre o processamento no sistema olfatório e a atividade no córtex motor em humanos. Para melhor compreender as interações entre os sistemas olfatório e motor e superar algumas das limitações metodológicas anteriores, desenvolvemos um novo método combinando um olfatômetro que sincroniza a apresentação em ordem aleatória de odorantes com diferentes valores hedônicos e o disparo da EMT (bobina única e dupla) com as fases da respiração nasal. Este método permite sondar as modulações da excitabilidade corticoespinhal e conectividade ipsilateral efetiva entre o córtex pré-frontal dorsolateral e o córtex motor primário que poderiam ocorrer durante a percepção de odor agradável e desagradável. A aplicação deste método permitirá discriminar objetivamente o valor de agradabilidade de um odorante em um determinado participante, indicando o impacto biológico do odorante na conectividade e excitabilidade efetiva do cérebro. Além disso, isso poderia abrir caminho para investigações clínicas em pacientes com distúrbios neurológicos ou neuropsiquiátricos que podem apresentar alterações hedônicas de odor e comportamentos desadaptativos de evitação de abordagem.

Introduction

É amplamente aceito que a estimulação olfatória provoca reações automáticas e comportamentos motores. Por exemplo, em humanos, a existência de uma resposta motora de evitação (inclinando-se para longe da fonte de odor) ocorrendo 500 ms após o início do odor negativo foi recentemente demonstrada¹. Ao registrar participantes humanos em movimento livre explorando odores emanados de frascos, Chalençon e colaboradores (2022) mostraram que comportamentos motores (ou seja, velocidade de aproximação ao nariz e retirada do frasco contendo o odorante) estão intimamente ligados aos odors hedônicos². Além disso, uma estreita ligação entre o processamento no sistema olfatório e a atividade no córtex motor foi recentemente demonstrada em humanos usando eletroencefalografia¹. Especificamente, aproximadamente 350 ms após o início dos odores negativos, uma dessincronização específica do ritmo mu, conhecida por refletir processos de preparação da ação, foi observada sobre e dentro do córtex motor primário (M1), logo seguida por um movimento comportamental para trás¹. Fortalecendo a ideia de uma relação entre os sistemas olfatório e motor, outro estudo recente mostrou que a exposição a um odorante agradável aumentou a excitabilidade corticoespinhal em comparação com uma condição sem odor³. Neste estudo, a estimulação magnética transcraniana de pulso único (EMTsp) foi aplicada a M1 para evocar um potencial evocado motor (PEmáx) em um músculo alvo da mão, registrado perifericamente com eletromiografia (EMG) durante a percepção do odor. A exposição ao odorante agradável foi proporcionada passivamente por tiras de papel sodden com óleo essencial de bergamota puro e colocadas em um suporte metálico sob o nariz³. Nesse contexto, ainda não está claro se a facilitação da excitabilidade corticoespinhal se deve à estimulação odorante agradável ou a efeitos comportamentais inespecíficos, como cheirar e apertar os dentes ^4,5. Além disso, ainda não se sabe como um odorante desagradável modula a excitabilidade M1 sondada pela EMT.

Em síntese, ressalta-se a necessidade de se desenvolver um método que ofereça as seguintes vantagens em relação às técnicas existentes em estudos^{anteriores3,6}: (1) randomizar a apresentação de diferentes condições de odor (agradável/desagradável/sem odor) dentro de uma mesma fase experimental, (2) sincronizar com precisão a apresentação odorante e o tempo da EMT de acordo com as fases da respiração nasal humana (inspiração e expiração) ao estudar o sistema motor.

A EMT também pode ser utilizada como ferramenta para investigar interações córtico-corticais, também chamadas de conectividade efetiva, entre múltiplas áreas corticais e M1 com alta resolução temporal7,8,9,10,11,12. Aqui, usamos um paradigma de EMT de sítio duplo (EMTd), no qual uma estimulação de primeiro condicionamento (EC) ativa uma área cortical alvo, e uma estimulação de segundo teste (TS) é aplicada sobre M1 usando outra bobina para evocar uma PEmáx. O efeito do EC é avaliado normalizando a amplitude da PEmáx condicionada (condição EMTd) para a amplitude da PEmáx não condicionada (condição ^EMTsp)13. Assim, valores de razão negativa indicam interações corticocorticais supressoras, enquanto valores de razão positiva indicam interações corticocorticais facilitatórias entre as duas áreas estimuladas. O paradigma dsTMS fornece, portanto, uma oportunidade única para identificar a natureza (isto é, facilitatória ou supressiva), a força e as modulações da conectividade efetiva entre a área pré-ativada e M1. É importante ressaltar que as interações corticocorticais refletem um complexo equilíbrio de facilitação e supressão que pode ser modulado em diferentes tempos e estados mentais ou tarefas ^7,14.

Até onde sabemos, o paradigma relativamente novo da dsTMS nunca foi usado para investigar interações córtico-corticais durante a percepção de odor com diferentes valores hedônicos. No entanto, estudos de neuroimagem têm mostrado que a exposição a odorantes agradáveis e desagradáveis induz alterações de conectividade em áreas envolvidas na emoção, tomada de decisão e controle da ação, incluindo a área motora suplementar, o córtex cingulado anterior e o córtex pré-frontal dorsolateral (CPFDL)^15,16. De fato, o CPFDL é um nó chave mediador do controle emocional, do processamento sensorial e de aspectos de alto nível do controle motor, como processos preparatórios 17,18,19. Além disso, estudos em humanos e animais têm fornecido evidências de que o CPFDL possui diversas projeções neuronais para M1 17,18,20,21,22. Dependendo do contexto, essas projeções de CPFD podem facilitar ou inibir a atividade de M1 ^7,19,20. Assim, parece possível que a conectividade efetiva entre o CPFDL e M1 seja modulada durante a apresentação do odor e que odorantes agradáveis e desagradáveis recrutem redes corticais separadas, levando a um efeito diferencial na conectividade DLPFC-M1.

Aqui, propomos um novo método adequado para o estudo metodologicamente rigoroso das modulações da excitabilidade corticoespinhal e conectividade efetiva que podem ocorrer durante a percepção de odores agradáveis e desagradáveis, todos entregues em sincronia com a respiração nasal humana.

Protocol

Todos os procedimentos experimentais descritos nas seções a seguir foram aprovados por um Comitê de Ética (CPP Ile de France VII, Paris, França, número de protocolo 2022-A01967-36) de acordo com a Declaração de Helsinque. Todos os participantes assinaram o termo de consentimento livre e esclarecido antes da inclusão no estudo.

1. Recrutamento de participantes

1. Critérios de inclusão/exclusão.
   1. Incluir participantes adultos (> 18 anos). Rastrear todos os participantes quanto a qualquer contraindicação à EMT de acordo com as diretrizes internacionais de especialistas²³.
   2. Exclua participantes com dispositivos médicos implantados (por exemplo, implante coclear, marcapasso cardíaco, etc.), história pessoal ou familiar de convulsão, dor de cabeça, trauma cerebral e medicação neuroativa. Excluir participantes considerados "anômicos" de acordo com o Teste Europeu de Capacidades Olfativas²⁴.
2. Lateralidade: Verificar a lateralidade destra avaliada pelo questionário Edinburgh Handedness Inventory²⁵.
   NOTA. É altamente recomendável recrutar apenas participantes destros em estudos que avaliem a excitabilidade corticoespinhal e a conectividade efetiva no sistema motor^26,27.
3. Informação e consentimento informado: Fornecer a todos os participantes informações básicas sobre os objetivos, procedimentos e riscos do estudo aprovados pelo Comitê de Ética e solicitar que assinem o termo de consentimento livre e esclarecido.

2. Procedimento experimental

1. Instalação do paciente: Solicitar ao participante que se sente em uma cadeira confortável (tipo cadeira odontológica) com as duas mãos relaxadas e pronadas. Posicione a cabeça do paricipant sobre um apoio para o queixo para minimizar o movimento da cabeça durante a estimulação.
2. Registros eletromiográficos
   1. Preparar a pele do participante antes da aplicação do eletrodo usando um esfoliante para abrasar levemente as áreas e limpar as áreas com almofadas de álcool onde os eletrodos serão aplicados.
   2. Aplicar dois eletrodos de gravação descartáveis de prata/cloreto de prata com uma montagem ventre-tendão do primeiro músculo interósseo dorsal (IDF). Acrescentar o eletrodo terra ao processo estiloide da ulna (Figura 1).
   3. Conecte os eletrodos ao amplificador com cabos e ao sistema de aquisição de dados.
   4. Grave o sinal EMG usando um sistema de conversão analógico-digital (AD). Amplificar e filtrar sinais EMG (ganho = 1000) usando uma frequência de largura de banda entre 10 Hz e 1 kHz. Digitalize a uma taxa de amostragem de 2.000 Hz e armazene cada arquivo EMG para análise off-line.
   5. Verifique a qualidade do sinal exibido na tela do computador conectado ao sistema de aquisição de dados.
3. Bobina_{TMS posição M1} .
   1. Conecte essa bobina ao estimulador A (Figura 1).
   2. Coloque uma touca apertada sobre a cabeça do participante. Use uma fita métrica para realizar medidas de nasion-ínion, tragus-tragus e perímetro cefálico com base em pontos de referência cranianos padrão. Identificar e marcar com caneta o vértice do couro cabeludo na intersecção das linhas sagital média (nasion-ínion) e interaural (tragus-tragus)²⁸.
   3. Colocar tangencialmente ao couro cabeludo a primeira bobina pequena de oito (diâmetro interno: 40 mm) sobre a área presumida da mão do M1 esquerdo (bobina_M1), que fica 5 cm lateral do vértice, com o cabo apontando para trás e lateralmente em um ângulo de 45° em relação à linha sagital média, resultando em um fluxo de corrente póstero-anterior (forma de onda de corrente monofásica). Esta orientação corresponde a uma corrente induzida máxima fluindo dentro de M1 dentro de M1²⁹.
   4. Garantir que o posicionamento da bobina_M1 seja ideal, de acordo com as mais recentes recomendações internacionais³⁰. Comece aplicando alguns pulsos únicos a 30% da saída máxima do estimulador (%MSO) e verifique se a estimulação produz uma PEmáx registrada pelo sistema EMG e exibida na tela do computador conectado ao sistema de aquisição de dados.
      1. Se não houver respostas visíveis, aumente gradualmente a intensidade da estimulação (incrementos de 5% da MSO) até que os PEmáx sejam observados. Em seguida, teste quatro pontos ao redor do primeiro local, entregando vários pulsos. Determinar a amplitude média pico-a-pico da PEmáx para cada local.
      2. Selecione o local onde a amplitude média pico-a-pico da PEmáx é a mais alta. Esta é a chamada localização do hotspot para o participante³⁰. Marque a localização da bobina_M1 na tampa para garantir a colocação adequada da bobina durante todo o experimento.
4. Limiar motor de repouso (rMT) e intensidades de EMT
   1. Determinar o limiar motor de repouso (rMT) definido como a intensidade da EMT que produz 50% de probabilidade de eliciar uma^{PEmáx 23,30}.
      1. Utilizar o freeware online disponível (TMS Motor Threshold Assessment Tool, MTAT 2.1), que se baseia na estimação de parâmetros de máxima verossimilhança utilizando uma estratégia de teste sequencial²⁹. A sequência de estimulação inicia-se sempre com a intensidade fixada em 37 %MSO.
      2. Deixe um experimentador segurar a bobina_M1 enquanto outro indica se a amplitude da PEmáx está > 0,05 mV. O algoritmo preditivo determina, então, a próxima intensidade de estimulação a ser aplicada e é interrompido após 20 estimulações, o que fornece acurácia suficiente para a estimativa da rMT de acordo com estudos prévios^31-34.
   2. Defina o %MSO para o condicionamento e a estimulação do pulso de teste. Use o valor de rMT previamente determinado do participante.
      OBS: Aqui, a intensidade para a primeira estimulação do condicionamento (_DLPFC da bobina) foi ajustada para 110% da rMT^19,20. A intensidade da estimulação do teste (bobina_M1) foi fixada em 120% da rMT, intensidade ligeiramente diferente de estudos anteriores que utilizaram uma intensidade de ST que evocou uma PEmáx de ~1 mV em todos os participantes^19,20 . Essa intensidade fixa pico-a-pico ocorre em pontos muito diferentes nas curvas de recrutamento de insumo-produto devido à alta variabilidade intersujeitos na saída motora³⁵. Portanto, a intensidade da estimulação poderia ser otimizada usando 120% da intensidade do TMR entre os indivíduos.
5. Posicionamento_DLPFC da bobina TMS
   1. Conecte esta bobina ao estimulador B (Figura 1).
   2. Utilizar a heurística do couro cabeludo recentemente atualizada para localizar a região do couro cabeludo correspondente ao CPFDL esquerdo^36,37 para estimar a posição da segunda bobina de oito pequenos números (diâmetro interno: 40 mm) sobre o CPFDL (_DLPFC da bobina). Baixe a Ferramenta de Cálculo de Planilha Excel³⁶ online e insira as distâncias nasion-inion e tragus-tragus e o perímetro cefálico em centímetros como entradas. Relate as distâncias X_LA e Y_LA diretamente na cabeça do participante.
   3. Colocar tangencialmente ao couro cabeludo o_CPFDL da bobina sobre a suposta localização do CPFDL esquerdo, com a alça apontada para baixo e lateralmente em um ângulo de -45° em relação à linha sagital média. Marque a colocação do_DLPFC da bobina na tampa para garantir a colocação adequada da bobina durante todo o experimento.
      NOTA: Este método de segmentação baseado em couro cabeludo para os locais_{de DLPFC} da bobina_M1 e da bobina não é o ideal. De fato, sabe-se que é menos preciso do que o método de neuronavegação usado para atingir as áreas de interesse cerebrais com base na ressonância magnética (RM) anatômica T1 ^individual38.
6. Atraso entre os pulsos de condicionamento e teste: Ajuste esse atraso para 10 ms no dispositivo gerador de pulsos.
   OBS: Aqui, o atraso é fixado em 10 ms com base em estudos prévios que mostram uma influência inibitória do CPFDL esquerdo para o M1 esquerdo nesse intervalo^19,20. Esse efeito inibitório observado em 10 ms provavelmente se deve à ativação dos gânglios da base via projeções do CPFDL para a pré-AME, exercendo assim uma influência indireta sobre M1³⁹. O atraso pode ser ajustado no código de acordo com as necessidades do usuário. Por exemplo, um intervalo de interestimulação mais longo (isto é, 25 ms) poderia ser usado para investigar circuitos córtico-subcorticais-corticais indiretos polissinápticos conectando o CPFDL a M1¹⁹. Além disso, influências diferenciais facilitatórias/inibitórias têm sido demonstradas usando ppTMS de duplo sítio entre múltiplas áreas corticais, com intervalos variando de 1 ms a 150 ms^40,41. Assim, o fato de o intervalo poder ser ajustado abre caminho para um amplo leque de possibilidades para futuras pesquisas.
7. Configurações do olfatômetro
   1. Selecione odorantes com valores hedônicos agradáveis e desagradáveis. Diluir antecipadamente os odorantes individualmente em óleo mineral para criar percepção iso-intensa.
      NOTA: Aqui, a seleção e a concentração de odorantes (isto é, acetato de isoamila e ácido butírico diluídos em concentrações de 0,6% e 0,11% vol/vol, respectivamente) foram baseadas em estudos anteriores de nosso grupo utilizando o mesmo arranjo olfométrico e odorantes ^42,43. Um estudo piloto confirma que os odores positivos e negativos não diferiram em termos de intensidade, mas foram opostos em valor hedônico. Na condição de controle (ou seja, sem odorante), apenas o fluxo de ar é entregue ao participante.
   2. Escreva o código para entregar os odorantes. Para cada ensaio, indicar a duração total do ensaio, o odorante a ser administrado, a taxa de fluxo do controlador odorante (em mililitros por minuto), a taxa de fluxo do regulador de ar transportador (em mililitros por minuto) e a taxa de fluxo do regulador de sucção.
      OBS: A ordem do odorante entregue pode ser aleatória entre positivo, negativo e sem odor. Aqui, cada ensaio tem uma duração de 12 s. A ordem de entrega dos odores foi pseudo-randomizada. Além disso, com base em um experimento piloto, a taxa de fluxo do controlador de odor foi ajustada para 200 mL/min, a taxa de fluxo do regulador de ar transportador em 500 mL/min e a taxa de fluxo do regulador de sucção em 100 mL/min.
   3. Posicionar a cânula nasal próximo às narinas do participante para mensuração da respiração nasal. Instruir o participante a respirar normalmente pelo nariz.
   4. Ligue o compressor de ar portátil, a caixa do olfatômetro e o PC que contém o software. Verifique todas as conexões do cabo (Figura 1).
      NOTA: O olfatômetro usado no presente estudo foi descrito em detalhes em uma publicação anterior⁴⁴ , mas foi modificado aqui para permitir o disparo da EMT com atrasos variáveis após a detecção do início da inspiração. Resumidamente, o dispositivo é composto por vários módulos, incluindo 1) uma fonte de ar e um sistema de tratamento de ar provenientes de um compressor de ar portátil, 2) um sistema de estimulação incluindo dispositivos eletrônicos e pneumáticos, 3) uma cabeça de mistura caseira acoplada a um sistema de liberação que permite a difusão de odorantes no nariz do participante, 4) um sistema sensorial respiratório que aciona o olfatômetro de acordo com a medida da respiração nasal com uma cânula nasal e 5) um software sistema de controle⁴⁴.
   5. Calibração: Proceder à fase de calibração (cerca de 20 s.), que permite calibrar o sinal respiratório do participante e ajustar os limiares de detecção das fases expiratória e inspiratória. Nesse software, a fase expiratória é positiva e a fase inspiratória é negativa.
   6. Classificações de odor hedônico e intensidade: Entregue os dois odorantes em uma ordem aleatória e peça aos participantes que classifiquem o valor hedônico e a intensidade de cada odorante em escalas analógicas visuais que variam de 1 "nada agradável" a 9 "extremamente agradável" e de 1 "nada intenso" a "extremamente intenso".
8. Combinando olfatômetro e EMT: Defina o atraso entre a detecção da fase de inspiração e o gatilho para o envio da EMT em 600 ms.
   NOTA: O ajuste do atraso é importante e deve ser determinado de acordo com a literatura e as necessidades do usuário. Nesse protocolo, o atraso foi fixado em 600 ms, que tem se mostrado a máxima representação perceptiva consciente dos odores⁴⁵. Para a condição de EMT de pulso único, esse gatilho ativa imediatamente o estimulador A, e um pulso é liberado pela bobina posicionada no M1 esquerdo para evocar uma PEmáx não condicionada. Para a condição de EMT de bobina dupla, este gatilho é enviado para dois dispositivos diferentes (através de dois cabos coaxiais conectados por uma conexão T): o primeiro ativa imediatamente o estimulador B e um pulso de condicionamento é liberado pela bobina posicionada no DLPFC esquerdo; o segundo é recebido por um gerador de pulsos que permite induzir um atraso fixo antes de acionar o estimulador A, liberando assim um teste-estimulação através da bobina posicionada em M1 esquerda para evocar uma PEmáx condicionada (Figura 1).

Figura 1: Montagem experimental. As linhas em negrito representam conexões pneumáticas. Um compressor de ar é conectado ao olfatômetro para gerar diferentes fluxos de ar. Um regulador controla a pressão, e o fluxo de ar de entrada é direcionado para 3 canais (através de 3 reguladores de massa): um para o transportador de ar (linha azul), um para o sistema de aspiração (linha marrom) para limpar e ajudar a controlar o tempo de estimulação e o último para os odorantes⁴⁴. Dois tubos em forma de U contêm os odorantes (verde: agradável; vermelho: desagradável) nos quais são condicionados sob pressão no estado de vapor saturado, garantindo um fluxo de ar odorizado com intensidade estável ao longo do tempo. A cabeça de mistura é usada para misturar as correntes de ar limpas e odorizadas. O fluxo de ar (odorizado ou puro) é entregue às narinas através de dois tubos (linhas cinzas) ligados a uma cânula nasal, que também é usada para registrar a respiração nasal (linha roxa). Com base no sinal respiratório, assim que a fase de inspiração é detectada, para a condição de EMTp um gatilho é enviado para um dispositivo gerador de pulsos usado para definir um atraso (aqui: 10 ms), em seguida, para um estimulador de EMT A conectado à bobina_M1 aplicado sobre a representação muscular da mão M1 esquerda, enquanto o estimulador B da EMT é desligado. Para a condição dsTMS, um gatilho é imediatamente enviado para o estimulador B da EMT conectado ao_DLPFC da bobina aplicado sobre a DLPFC esquerda, e o dispositivo gerador de pulsos é usado para definir um atraso (aqui: 10 ms) antes de acionar o estimulador de EMT A conectado à bobina_M1. O sinal respiratório e a amplitude da PEmáx adquiridos pelo sistema EMG são registrados por um software instalado em um computador. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

3. Medições

1. Execute o script de codificação personalizado no software olfatômetro (consulte a etapa 2.7.2) para fornecer todas as combinações de spTMS e dsTMS com odores agradáveis e desagradáveis e sem odores ocorrendo em uma ordem aleatória.
   NOTA: Aqui, 20 ensaios foram registrados para cada condição (120 ensaios no total). O experimento foi dividido em 6 blocos de 20 ensaios cada. O número de testes para cada condição pode ser alterado de acordo com as necessidades do usuário.

4. Análise dos dados

1. Para cada participante, condição e ensaio, extraia a amplitude pico a pico da PEmáx. Isso pode ser feito usando uma das caixas de ferramentas de código aberto disponíveis on-line^46,47.
2. Normalizar os dados calculando uma razão PEmáx expressando PEmáx eliciada pela estimulação do teste em ensaios de EMTd em relação às PEmáx eliciadas pela estimulação do teste em ensaios de^{EMTp 12}. Faça isso separadamente para cada participante e para cada condição de odor (ou seja, sem odor, odor positivo e odor negativo). Após esse procedimento, interprete os resultados da seguinte forma: razões de PEmáx acima de 1 indicam uma influência facilitatória do CPFDL sobre M1, enquanto razões de PEmáx abaixo de 1 indicam uma influência inibitória do CPFDL sobre M1.

Results

Os dados representativos aqui apresentados refletem gravações dos participantes após o preenchimento do protocolo passo-a-passo acima para fornecer uma visão preliminar sobre o que poderíamos esperar.

A Figura 2 mostra um exemplo de sinais respiratórios representativos de um participante registrados com o software olfatômetro. As fases expiratória e inspiratória são bem detectadas quando os limiares são ultrapassados. O odorante é acionado imediatamente após o limiar da fase de expiração e difunde-se por 5 s. O pulso da EMT é desencadeado com um atraso (600 ms) após o limiar da fase inspiratória.

Este resultado demonstra que o método aqui desenvolvido pode sincronizar com precisão a difusão do odorante e o tempo da EMT de acordo com as fases da respiração nasal humana.

Figura 2: Exemplo de dados brutos de registros respiratórios para um participante representativo. A fase de expiração é detectada quando um limite (representado pela linha vermelha) é ultrapassado. A fase de inspiração é detectada quando um limiar (representado pela linha azul) é ultrapassado. O odorante é acionado imediatamente após o limiar da fase de expiração e difunde-se por 5 s, como mostra a linha verde. O pulso da EMT é desencadeado com um atraso (600 ms) após o limiar da fase inspiratória. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

A Figura 3 ilustra os resultados obtidos a partir do registro dos dados eletromiográficos do músculo IDE direito (PEmáx), de acordo com as condições (EMTs e EMTd) e os valores hedônicos de odor (sem odorante, odorante positivo e odorantes negativo) para um participante representativo. A amplitude pico-a-pico das PEmáx evocadas pela EMTs (Figura 3A) e pela EMTd (Figura 3B) variou de acordo com o valor hedônico do odorante. Quando os resultados são normalizados (Figura 3C), todas as razões PEmáx estão abaixo de 1, indicando um efeito supressor do CPFDL esquerdo no M1 esquerdo. Este resultado demonstra que o método aqui desenvolvido permite a investigação das modulações da excitabilidade corticoespinhal e conectividade efetiva que ocorrem durante a percepção de odor agradável e desagradável, tudo de forma sincronizada com a respiração nasal humana. Estes resultados são preliminares e merecem investigação adicional para concluir sobre os efeitos específicos dos valores hedônicos dos odores sobre a excitabilidade corticoespinhal e conectividade efetiva.

Figura 3: Exemplo de registros brutos típicos do músculo FDI direito de um participante. (A) condição de EMTp com odorante positivo (verde), odorante negativo (laranja) e condições sem odor (cinza). (B) condição dsTMS, com odorante positivo (verde), odorante negativo (laranja) e condições sem odor (cinza). (C) Índices de PEmáx obtidos após o procedimento de normalização para um participante representativo. As três razões PEmáx estão abaixo de 1, indicando uma influência inibitória do CPFDL sobre M1. Os traços brutos de PEmáx representam uma única gravação de ensaio. Os gráficos de barras mostram a média, o desvio padrão e o valor individual da PEmáx das 20 tentativas obtidas em cada condição. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Discussion

O protocolo acima descreve um novo método combinando o uso de um olfatômetro sincronizado com respiração sincronizada com EMT de bobina única e dupla para investigar mudanças na excitabilidade corticoespinhal e conectividade efetiva dependendo do valor hedônico dos odorantes. Esta configuração permitirá discriminar objetivamente o valor de agradabilidade de um odorante em um determinado participante, indicando o impacto biológico do odorante na conectividade e reatividade efetiva do cérebro. As etapas críticas deste protocolo envolvem tanto parâmetros da EMT (colocação, intensidades) quanto parâmetros olfatômetros (seleção de odorantes, tempo relativo às fases respiratórias).

Essa combinação de EMTs e EMTd com um olfatômetro pode ser adaptada de várias maneiras, dependendo das necessidades do usuário, e tem claras vantagens metodológicas. Como mencionado na introdução, dois aspectos metodológicos pareceram cruciais para uma investigação mais aprofundada das bases mecanicistas das interações entre os sistemas olfativo e motor. A primeira foi a possibilidade de apresentar diferentes condições de odor (agradável/desagradável/sem odor) dentro de uma mesma fase experimental. Isso agora é viável porque é possível especificar teste a teste qual odorante será entregue ao sujeito em uma intensidade constante. Esse é um ponto crucial, pois permite eliminar as mudanças sistemáticas intraindividuais na amplitude das PEmáx dentro e entre os blocos de estímulos observadas em estudos prévios, mesmo em intervalos interestímulos relativamente longos^48,49.

De fato, a aplicação de um pulso de EMT em M1 permite quantificar as alterações observadas na excitabilidade corticoespinhal com inegável acurácia temporal. No entanto, um número muito grande de fatores pode modular a excitabilidade corticoespinhal, e estes precisam ser controlados tanto quanto possível. Por exemplo, o simples fato de inspiração ou expiração voluntária (um ato motor) modifica a excitabilidade corticoespinhal dos músculos não respiratórios dos dedos⁵⁰.

A segunda foi a possibilidade de controlar e sincronizar vários fatores com as fases respiratórias. Estes incluem a duração precisa e o tempo de difusão do odor para os participantes e o tempo do pulso da EMT. Mais importante, esses diferentes parâmetros podem ser modificados de acordo com as necessidades do usuário, abrindo caminho para estudos futuros.

O método aqui apresentado abre caminho para uma ampla gama de pesquisas futuras e questões mais amplas no campo do olfato. Primeiro, nenhum estudo ainda examinou a precisão temporal da modulação da excitabilidade corticoespinhal em resposta a um estímulo olfatório. Essa modulação é muito precoce (isto é, antes do surgimento das representações perceptivas de odor, estimadas entre 300 ms e 500 ms após o início do odor⁴⁵) ou tardia (isto é, quando as representações de odor são estendidas para áreas maiores associadas ao processamento emocional, semântico e de memória⁴⁵)? O tempo de mudanças na excitabilidade corticoespinhal é o mesmo dependendo do valor hedônico do odor? Odores desagradáveis, como dor, muitas vezes sinalizam perigo potencial, provocam uma resposta mais rápida para evitar ou escapar rapidamente de situações negativas^51,52 e, assim, modulam a excitabilidade corticoespinhal mais cedo do que odores positivos. No entanto, isso permanece especulativo. Ao aplicar o pulso da EMT em diferentes momentos após o início dos odores positivos e negativos e comparar as alterações na excitabilidade corticoespinhal, o protocolo atual pode abordar essa questão. Além disso, embora o foco do presente protocolo tenha sido a modulação da excitabilidade corticoespinhal visando M1, a técnica de EMT, devido à sua alta resolução temporal, também pode ser utilizada para investigar as relações causais cérebro-comportamento e o curso temporal de outras áreas durante os processos olfatórios, devido à sua alta resolução temporal53. Da mesma forma, no protocolo atual, avaliamos a conectividade efetiva entre o CPFDL e M1, pois há evidências na literatura de que modulações dessa conectividade podem ocorrer durante a percepção do odor. Entretanto, outras redes córtico-corticais ou córtico-subcorticais podem ser moduladas durante processos de olfato ou controle motor, e a conectividade dentro dessas redes pode ser facilmente avaliada com esse novo método. A única mudança seria, então, a localização das bobinas em direção às áreas corticais visadas. Por exemplo, o córtex orbitofrontal mostrou estar envolvido na codificação do valor hedônico do odor e da percepção do odor⁵⁴, e um estudo recente de EMT de sítio duplo mostrou que essa área tem uma influência inibitória sobre M1 em repouso¹². Investigar mudanças na conectividade efetiva entre o córtex orbitofrontal e M1 durante a percepção de odores positivos e negativos é uma interessante via de estudo para uma melhor compreensão dos mecanismos por trás das interações entre os sistemas olfatório e motor.

Além disso, este método propõe uma nova maneira de avaliar de forma confiável a percepção hedônica de odor de forma não verbal ou consciente. Isso poderia abrir caminho para investigações clínicas que visem compreender interações anormais entre o processamento nos sistemas olfatório e motor. Por exemplo, o método atual poderia ser utilizado em pacientes com transtornos neuropsiquiátricos, como o transtorno depressivo maior (TDM), que tem sido associado a alterações na função olfatória, incluindo percepção hedônica de odores e abordagem desadaptativa e comportamentos evitativos⁵⁵. Além disso, como o CPFDL esquerdo demonstrou ser hipoativo em pacientes com TDM⁵⁶ e a conectividade com o CPFDL-M1 é modulada durante comportamentos de evitação de abordagem¹⁹, a combinação de EMT e um olfatômetro pode ser uma ferramenta potencial promissora para elucidar indicadores neurofisiológicos de conectividade disfuncional entre CPFDL e M1 em pacientes com TDM. Achados neurofisiológicos podem então ser correlacionados com sintomatologia clínica, como a gravidade da depressão ou o escore de anedonia olfatória, definido como a reduzida capacidade de experimentar prazer, encontrada em pacientes com TDM⁵⁷. Finalmente, se anormalidades na conectividade efetiva forem reveladas nesses pacientes usando o método aqui apresentado e se correlacionarem com sintomas clínicos, a EMT de dois sítios poderia ser usada repetidamente para neuromodular a conectividade DLPFC-M1 e melhorar os sintomas clínicos, um protocolo chamado estimulação corticocortical associativa pareada58,59.

Embora o presente método e resultados forneçam uma prova de conceito para futuras investigações sobre os mecanismos neurais subjacentes às interações entre os sistemas olfatório e motor, algumas limitações e considerações devem ser mencionadas. Primeiro, para aumentar a confiabilidade e a reprodutibilidade das medidas, as áreas cerebrais visadas devem ser precisamente baseadas em áreas anatômicas e funcionais (isso é especialmente verdadeiro para o alvo do DLPFC). Em segundo lugar, como mencionado acima e como demonstrado pela modelagem computacional de campo E, o método de direcionamento baseado no couro cabeludo usado para posicionar as bobinas é subótimo em comparação com a orientação da RM⁶⁰. Para maximizar a acurácia e precisão do posicionamento da EMT, um sistema de neuronavegação que co-registra a cabeça do paciente e a ressonância magnética estrutural (RM) e fornece feedback em tempo real sobre a posição da bobina deve ser usado³⁸. Além disso, a dosimetria computacional de campo E demonstrou fornecer estimulação mais eficiente e focada, determinando a colocação individual da bobina que maximiza a entrega do campo E a um alvo cerebral específico⁶¹. Um terceiro ponto a ser considerado na interpretação dos resultados diz respeito à amplitude da PEmáx. De fato, sabe-se que a amplitude da PEmáx reflete diferentes entradas neurais intrínsecas para as células corticoespinhais, incluindo elementos transcorticais, e a atividade do pool de motoneurônios espinhais 62,63,64. Portanto, a modulação da excitabilidade corticoespinhal e a conectividade efetiva observada durante a exposição a um odor agradável fornece uma imagem parcial das redes supraespinais e espinhais mais complexas que provavelmente estão envolvidas na modulação da amplitude da PEmáx. Os resultados devem ser interpretados com cautela.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Placa de aquisição (8 canais)	National Instrument	NI USB-6009
Compressor	de ar Jun-Air	Model6-15
Almofadas de preparação de álcool	Qualquer
ácido butírico	Sigma-Aldrich	B103500	Odorante negativo
Computador desktop	Dell	Latitude 3520
Sistema EMG	Sistema Biopac	MP150
Acetato de isoamila	Sigma-Aldrich	W205508	Odorante positivo
Cânula nasal	SEBAC France	O1320
Gerador de pulso programável	A.M.P.I	Eletrodos de superfície Master-8
	Kendall Medi-trace	FS327
TMS coil (X2)	MagStim	D40 Alpha B.I. coil
Máquina TMS	MagStim	Bistim2
Tubo 6 mm x 20 m	Radiospare	686-2671	Conexão pneumática
USB-RS232	Radiospare	687-7806
Tubos em forma de U	VS	technologies VS110115