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Artigo de método

Desenvolvimento e aplicação de ensaios biofísicos para avaliação da formação de complexos ternários induzidos por proteólise visando quimeras (PROTACS)

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DOI:

10.3791/65718

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12 de janeiro de 2024

 , 
1Center for the Development of Therapeutics, The Broad Institute of MIT and Harvard

Neste artigo

Resumo

Descrevemos protocolos para a caracterização biofísica da formação de complexos ternários induzidos por proteólise visando quimeras (PROTACS) que envolvem os ligases ubiquitina Von Hippel-Lindau E3 ligase (BVS) e Cereblon (CRBN). Os métodos biofísicos aqui ilustrados incluem ressonância plasmônica de superfície (SPR), interferometria de biocamada (BLI) e calorimetria de titulação isotérmica (ITC).

Resumo

Ligases E3 e proteínas alvo de degradação podem ser induzidos a formar complexos por moléculas heterobifuncionais em um processo de várias etapas. A cinética e termodinâmica das interações envolvidas contribuem para a eficiência da ubiquitinação e consequente degradação da proteína. Técnicas biofísicas como ressonância plasmônica de superfície (SPR), interferometria de biocamada (BLI) e calorimetria de titulação isotérmica (ITC) fornecem informações valiosas que podem ser usadas na otimização dessas interações. Usando dois sistemas modelo, um kit de ferramentas de ensaio biofísico para entender a cooperatividade da formação de complexos ternários e o impacto do 'efeito gancho' na cinética de ligação foi estabelecido. Em um caso, uma proteólise visando quimera (PROTAC) molécula que induziu a formação de complexo ternário entre Brd4BD2 e VHL foi avaliada. A molécula heterobifuncional, MZ1, tem afinidades nM tanto para a proteína Brd4BD2 (SPR K D = 1 nM, ITC K D = 4 nM) quanto para o complexo VHL (SPR K D = 29 nM, ITC K D = 66 nM). Para esse sistema, foram desenvolvidos ensaios robustos de SPR, BLI e ITC que reproduzem resultados publicados demonstrando a cooperatividade da formação ternária de complexos. No outro caso, foi estudada uma molécula que induziu complexos ternários entre uma proteína de 46,0 kDa, PPM1D, e o cereblon [CRBN (319-442)]. A molécula heterobifuncional, BRD-5110, tem um SPR K D = 1 nM para PPM1D, mas uma ligação muito mais fraca contra o complexo CRBN truncado (319-442) (SPR KD = ~ 3 μM). Nesse caso, a vinculação para CRBN em SPR não foi saturável, resultando em um "efeito gancho". Os requisitos de rendimento e reagente para SPR, BLI e ITC foram avaliados, e recomendações gerais para sua aplicação em projetos PROTAC foram fornecidas.

Introdução

A poliubiquitinação de proteínas na célula é um processo fortemente regulado que envolve enzimas da família Ubiquitina Ligase 1,2. As enzimas terminais na via são as ligases de ubiquitina E3 que ligam covalentemente moléculas de ubiquitina aos seus parceiros de ligação às proteínas3. A poliubiquitinação desses parceiros ligantes de proteínas os direciona para degradação proteolítica pelo proteassoma4. Esse sistema faz parte do processo de homeostase proteica que tem sido aproveitado terapeuticamente para induzir a degradação de proteínas envolvidas na doença5. Pequenas moléculas que induzem a interação entre as ligases de ubiquitina E3, como a ligase E3 de Von Hippel-Lindau (BVS) ou o cereblon (CRBN), são tipicamente compostas por uma ogiva de ligação à ligase E3 conectada por um ligante flexível a uma ogiva que se liga à proteína alvo de degradação. Essas moléculas heterobifuncionais são comumente referidas como proteólise visando quimeras ou PROTACS6.

O desenvolvimento do PROTACS envolve a avaliação da capacidade das moléculas de induzir a degradação de proteínas nas células. Muitos sistemas de ensaios celulares foram desenvolvidos para monitorar a interação induzida entre a proteína-alvo e os componentes da ligase E3, como VHL ou CRBN, após o tratamento das células com uma molécula de PROTAC. Um desses ensaios celulares, o sistema nanoluc-Halotag7, envolve uma ligase E3 fundida ao aceitador Halotag e uma proteína-alvo marcada com um doador nanoluc. A formação do complexo ternário aproxima o doador nanoluc e o aceitador Halotag, permitindo a transferência de energia do doador para o receptor, resultando na emissão de luz. Variações desse sistema podem ser usadas para avaliar a permeabilidade celular de moléculas de PROTACS8 ou mudanças no nível relativo de ubiquitinação de proteínas-alvo9. Enquanto esses sistemas celulares são essenciais para impulsionar a otimização do PROTACS, a formação de complexos entre os ligases E3 e as proteínas alvo de degradação é um processo de várias etapas10,11. A cinética e termodinâmica das interações binárias e ternárias envolvidas contribuem para a eficiência da ubiquitinação e consequente degradação da proteína12,13,14.

São descritos protocolos que podem ser adaptados para a caracterização biofísica da formação de complexos ternários induzidos pelo PROTACS utilizando ressonância plasmônica de superfície (SPR), interferometria de biocamada (BLI) e calorimetria de titulação isotérmica (ITC). Os protocolos SPR e ITC para a molécula MZ1 PROTAC que induz a formação de complexos ternários entre Brd4BD2 e BVS, derivados de relatos da literatura13,15 e aqui descritos, foram capazes de recapitular os resultados relatados com algumas modificações dos procedimentos relatados, que serão discutidos. Uma descrição de um ensaio de BLI usado para avaliar a formação de complexos ternários entre MZI, Brd4BD2 e BVS está incluída neste relatório. As medidas de afinidade do IPC foram consistentes com as observadas na RP e na CIT. Um protocolo publicado anteriormente no qual um ensaio de SPR foi desenvolvido para avaliar a formação de complexo ternário induzido por PROTAC entre PPM1D, uma proteína fosfatase Ser/Thr cuja expressão é induzida de forma p53-dependente16, e CRBN também é descrito. Neste caso, a molécula PROTAC tem uma afinidade nanomolar para PPM1D, mas apenas uma afinidade micromolar para CRBN. Neste caso, a ligação da molécula de PROTAC ao CRBN não é saturável, resultando no comumente observado "efeito gancho". O efeito gancho é uma propriedade de três sistemas corporais em que existem duas espécies que podem formar um complexo heterotrimérico quando ambas estão ligadas a uma molécula em ponte (Figura 1)17. O efeito gancho é observado quando a espécie em ponte está em concentração excessiva em relação às outras duas espécies. O estado resultante é aquele em que as interações binárias superam as interações ternárias. Os sistemas onde o efeito gancho é observado requerem considerações específicas de planejamento experimental discutidas neste relatório. Conceitos gerais e requisitos de reagentes para avaliar a utilização de ensaios biofísicos para a avaliação da formação de complexos ternários induzidos pelo PROTAC são fornecidos.

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Protocolo

Todas as proteínas foram superexpressas em E.coli com bom rendimento e pureza (>80%), seguindo os protocolos daliteratura18. A biotinilação foi realizada utilizando-se reação catalisada por BirA18. Todas as moléculas pequenas foram preparadas em soluções estoque de 1 mM em DMSO 100%. Os procedimentos aqui descritos não requerem equipamentos ou precauções laboratoriais especializadas de segurança. Equipamentos de proteção individual (EPIs) padrão de laboratório devem ser usados (por exemplo, jaleco, óculos de segurança e luvas).

As proteínas aplicadas neste estudo estão listadas abaixo:
BVS: complexo biotinilado BVS(53-213)/ElonginB (1-104)/ElonginC(17-112) com Avi-tag no terminal C de ElonginB.
Brd4BD2: Não marcado Brd4BD2(333-460)
CRBN: CRBN biotinilado (319-442) com Avi-tag no terminal N
PPM1D: PPM1D(1-420) não marcado ou duplo His8-tagged no terminal N

Pequenas moléculas aplicadas neste estudo estão listadas abaixo:
MZ1 (MW = 1002,6 Da): PROTAC que se liga à BVS e Brd4BD2
BRD-2512 (MW = 841,4 Da): CRBN KD ~3 μM, não se liga ao PPM1D
BRD-5110 (MW = 872,0 Da): CRBN K D ~3 μM, PPM1D KD = 1-2 nM
BRD-4761 (MW = 476,6 Da): não se liga ao CRBN, PPM1D KD = 1-2 nM

1. Método 1: ITC (calorimetria de titulação isotérmica)

OBS: As titulações são realizadas utilizando-se um microcalorímetro com auto-injeção.

  1. Preparação tampão: Preparar 3 L de tampão contendo 20 mM HEPES, 150 mM NaCl, 1 mM TCEP, pH 7,5.
  2. Diálise: Dialyze BVS e Brd4BD2 (~ 500 μL a 150 μM cada) contra 1 L do tampão preparado na etapa 1.1, 3 vezes a 4 °C, por 4 h, 2 h e aproximadamente 16 h, respectivamente. Salve o buffer após a última diálise para uso nas etapas subsequentes.
  3. Prepare amostras em uma placa de 96 poços com uma tampa plástica.
    1. Para cada titulação, preparar 400 μL de solução para a célula, 125 μL para a seringa e 400 μL de tampão para limpeza. Adicione amostras a três poços consecutivos na placa. Uma vez que o estoque composto é preparado a 1 mM em 100% DMSO, adicione a mesma porcentagem de DMSO às soluções proteicas para garantir o tampão correspondente na célula e na seringa. Adicionar 2% de DMSO às soluções finais.
      1. Amostra para titulação de BVS em MZ1: Preparar solução celular contendo 392 μL de tampão, 4 μL de MZ1 a 1 mM (concentração final de 10 μM) e 4 μL de DMSO a 100%. Preparar uma solução de seringa contendo 122,5 μL de VHL a 85,7 μM, 2,5 μL de DMSO 100% (concentração final de 84 μM).
      2. Amostras para titulação da BVS no tampão (os dados serão utilizados para subtração de fundo dos dados gerados a partir da amostra 1.3.1.1): Preparar solução celular contendo 392 μL de tampão, 8 μL de 100% de DMSO. Preparar uma solução de seringa contendo 122,5 μL de VHL a 85,7 μM, (concentração final de 84 μM) e adicionar 2,5 μL de DMSO a 100%.
      3. Amostras para titulação de BVS em MZ1 e Brd4 BD2: Preparar solução celular contendo 392 μL de 17,1 μM Brd4BD2 (concentração final de 16,8 μM), 3,36 μL de MZ1 a 1 mM (concentração final de 8,4 μM) e 4,64 μL de DMSO 100%. Preparar uma solução de seringa contendo 122,5 μL de VHL a 85,7 μM (concentração final de 84 μM) e 2,5 μL de DMSO a 100%.
      4. Amostras para titulação de BVS em Brd4 BD2 (fundo de 1.3.1.3): Preparar solução celular contendo 392 μL de 17,1 μM Brd4BD2 (concentração final de 16,8 μM) e 8 μL de 100% DMSO. Preparar uma solução de seringa contendo 122,5 μL de VHL a 85,7 μM (concentração final de 84 μM) e 2,5 μL de DMSO a 100%.
  4. Execute as quatro titulações no microcalorímetro. Cada uma consiste em 19 injeções de solução de seringa de 2 μL a uma taxa de 2 μL/s em intervalos de tempo de 120 s. Fazer uma injeção inicial de proteína (0,4 μL) e descartá-la durante a análise dos dados. Realizar todos os experimentos a 25 °C, agitando a 600 rpm.
  5. Análise dos dados: Ajustar os dados a um modelo de sítio de ligação única para obter a estequiometria (n), a constante de dissociação (KD) e a entalpia de ligação (ΔH) usando o software de análise fornecido pelo fabricante (Figura 2).

2. Método 2: BLI (interferometria da biocamada)

  1. Realizar experimentos de BLI usando sensores revestidos com estreptavidina (SA) à temperatura ambiente (TR) com uma taxa de aquisição de 5 Hz. Durante o experimento automatizado BLI, certifique-se de que os sensores estejam estacionários dentro de uma única coluna e se movam entre diferentes colunas de uma placa preta de fundo plano de 96 poços com um volume máximo de poço de 392 μL. Encher cada poço da placa usada no experimento com 200 μL de solução.
    NOTA: BLI só é útil para detectar interações proteína-proteína (ou seja, formação de complexo ternário). Não é sensível o suficiente para detectar interações entre proteínas e pequenas moléculas.
    1. Preparação tampão: Preparar 100 mL de tampão contendo 20 mM HEPES, 150 mM NaCl, 1 mM TCEP, 0,05% P20, pH 7,5.
    2. Otimização para a etapa de imobilização: Carregar o sensor de teste para 1-3 nm, conforme recomendado pelo fabricante. Um carregamento de ~1,0 nm é usado para os procedimentos descritos aqui. Para isso, mergulhe o sensor em uma solução contendo BVS a 1,5 μg/mL por 80 s.
    3. Realizar medições cinéticas BLI aplicando sete sensores SA usando a seguinte sequência:
      1. Para a primeira fase basal, mergulhe em buffer por 60 s.
      2. Para a fase de imobilização, mergulhar em uma solução de BVS a 1,5 μg/mL por 80 s.
      3. Para a segunda fase basal, mergulhe em tampão por 60 s.
      4. Para a fase de associação, mergulhar em solução de uma concentração fixa de Brd4BD2 a 2 μM, concentração fixa de DMSO a 2% e concentrações variáveis de MZ1 a 100 nM, 50 nM, 25 nM, 12,5 nM, 6,3 nM, 3,1 nM e 0 nM (sensor de referência) por 300 s.
      5. Para a fase de dissociação, mergulhe em tampão por 600 s.
    4. Realizar análise de dados utilizando o software do fabricante. k on, koff e KD são relatados para ajuste dos dados (Figura 3).

3. Método 3: SPR (ressonância plasmônica de superfície)

NOTA: Todos os experimentos de SPR são realizados usando chips de sensor revestidos com estreptavidina (SA) no RT. Embora o chip NTA seja usado para a detecção entre proteína e pequenas moléculas, ele deve ser usado com cautela quando aplicado ao complexo ternário, pois um fundo muito mais alto do que o chip SA é observado, possivelmente devido a interações eletrostáticas entre a superfície do chip carregado e a proteína no analito.

  1. SPR para interação BVS-MZ1
    1. Preparação do tampão.
      1. Prepare um tampão de 1 L contendo 20 mM HEPES, 150 mM NaCl, 1 mM TCEP, 0,005% P20, pH7,5 e passe por uma unidade de filtro de 0,2 μm.
      2. Retirar 20 ml de tampão para utilização futura (tampão sem DMSO) e encher novamente com 20 ml de DMSO (DMSO a 2% no tampão de execução final). Manter o DMSO a 2% em todas as amostras descritas abaixo (passos 3.1 e 3.2)
    2. Ativar o chip SA seguindo o protocolo do fabricante e imobilizar a BVS a ~2000 RU (injetar solução proteica de 5 μg/mL a 5 μL/min).
    3. Prepare MZ1 em uma diluição seriada de 3 vezes e 8 pontos com a concentração superior a 10 μM em uma placa de polipropileno translúcida de fundo cônico de 384 poços com um volume máximo de 130 μL. Cubra a placa com folhas plásticas transparentes autoadesivas compatíveis com microplacas de polipropileno.
      1. Prepare a concentração máxima com o tampão livre de DMSO para garantir o DMSO a 2% na concentração final. Para 147 μL de tampão livre de DMSO, adicionar 1,5 μL de estoque de MZ1 a 1 mM e 1,5 μL de DMSO 100%.
      2. Prepare a diluição em série de 3 vezes com o tampão de corrida contendo DMSO a 2%. A 100 μL do tampão de corrida, adicionar 50 μL de solução na concentração máxima preparada no passo 3.1.3.1 e misturar bem para preparar a2.ª concentração mais elevada.
      3. Em seguida, transfira 50 μL da solução preparada na etapa 3.1.3.2 para os próximos 100 μL de tampão de corrida, misture bem para preparar a3ª maior concentração e assim por diante.
    4. Execute o SPR usando a configuração multiciclo: Modo: Alto desempenho; tempo de contato: 120 s; tempo de dissociação: 300 s; vazão: 50 μL/min.
    5. Realizar a análise dos dados utilizando o software de avaliação fornecido pelo fabricante do instrumento. A análise de estado estacionário indicou KD = 26 (± 3) nM e Rmax de ~91% (± 5%) de ligação alcançada (Figura 4A)
  2. SPR para BVS: MZ1: Complexo ternário Brd4BD2
    1. Prepare o buffer conforme descrito na etapa 3.1.1.
    2. Ativar o chip SA seguindo o protocolo do fabricante e imobilizar a BVS para ~100 RU. Injetar uma solução proteica de 0,5 μg/mL VHL a uma taxa de fluxo de 5 μL/min e tempo de contato entre 1-5 min até atingir uma densidade de superfície de ~100 RU.
    3. Preparar amostras para duas injecções de ciclo único de 5 vezes e 5 pontos numa placa de fundo redondo de poliestireno transparente de 96 poços com um volume máximo de 323 μL e cobri-la com folhas de plástico transparentes autoadesivas compatíveis com microplacas de poliestireno, conforme descrito nos passos 3.2.3.1-3.2.3.2.
      1. Controlo negativo: a substância a analisar contém apenas Brd4BD2 .
        1. Preparar concentração máxima a 25 μM em tampão de corrida com um volume de 200 μL (#A5)
        2. Adicionar 160 μL cada de Brd4BD2 a 2 μM no buffer de corrida para os próximos 4 poços à esquerda (#A1-A4)
        3. Transferir 40 μL de A5 para A4. Misture bem.
        4. Transferir 40 μL de A4 para A3. Misture bem. Continue fazendo isso até A1.
      2. Formação do complexo ternário: o analito contém MZ1 e Brd4BD2.
        1. Preparar a concentração máxima adicionando 4 μL de MZ1 a 20 μM em solução de DMSO a 100% para 196 μL contendo 25,5 μM Brd4BD2 em tampão livre de DMSO (#B5). As concentrações finais são 25 μM Brd4BD2, 100 nM MZ1 e 2% DMSO.
        2. Adicionar 160 μL cada de Brd4BD2 a 2 μM no buffer de corrida para os próximos 4 poços à esquerda (#B1-B4)
        3. Transferir 40 μL de B5 para B4. Misture bem.
        4. Transferir 40 μL de B4 para B3. Misture bem. Continue fazendo isso até B1.
    4. Execute o SPR usando a configuração de ciclo único: Tempo de contato: 100 s; tempo de dissociação: 720 s; vazão: 50 μL/min. Aplique três injeções de tampão antes de cada amostra para garantir um fundo estável.
    5. Análise dos dados: Aplicar a terceira injeção do buffer como plano de fundo para subtração. Quanto ao controle negativo, quando MZ1 não está presente, a resposta SPR entre BVS e Brd4BD2 é desprezível. Quando MZ1 está presente, o ajuste cinético indica que a interação entre BVS e o complexoBD2 MZ1-Brd4 tem k on = 7,9 (± 1,5) *107 /M/s, koff = 0,014 s-1 e KD = 1 nM. (Figura 4B)
  3. SPR para interações CRBN e pequenas moléculas
    1. Preparação do tampão.
      1. Prepare um tampão de 1 L contendo 50 mM Tris, 100 mM NaCl, 1 mM MgCl 2, 0,5 mM TCEP, 0,005% P20, pH 7,5, e passe por uma unidade de filtro de0,2 μm.
      2. Retirar 20 ml de tampão e reabastecer 20 ml de DMSO a 100% (DMSO a 2% no tampão de execução final). É importante manter o DMSO a 2% em todas as amostras descritas abaixo (passos 3.3, 3.4 e 3.5).
    2. Ative o chip SA seguindo o protocolo do fabricante e imobilize o CRBN para ~800 RU.
    3. Preparar compostos em diluição em série de 3 vezes e 6 pt numa placa de 384 poços com uma concentração máxima de 30 μM, conforme descrito no ponto 3.1.3.
    4. Execute o SPR usando a configuração multiciclo: Modo: Alto desempenho, tempo de contato: 60 s, tempo de dissociação: 90 s; vazão: 50 μL/min. Para este sistema, três injeções de buffer são suficientes para obter um fundo estável. Para outros sistemas de ensaio, pode ser necessário realizar injeções de tampão adicionais.
    5. Realizar análise de dados utilizando o software do fabricante.
      NOTA: A análise de estado estacionário indica que KD de BRD-2512 e BRD-5110 estão ambos em torno de 3 μM. No entanto, a ligação só atingiu ~ 70% Rmax ligação na concentração superior. Tanto a fraca afinidade quanto a forma do sensorgrama indicam que a insolubilidade do composto em altas concentrações é provável de acontecer. Assim, a KD real pode ser maior que 3 μM. O BRD-4761, que não se liga ao CRBN, foi incluído como controle negativo.
  4. SPR para interações PPM1D e pequenas moléculas
    1. Prepare o buffer conforme descrito na etapa 3.3.1. Use um chip sensor de ácido nitriloacético (NTA).
    2. Aplique um único ciclo porque a ogiva PPM1D tem um k ligado e kdesligado lento. Gere novamente o chip NTA usando a configuração padrão do fabricante e imobilize PPM1D para ~ 1000 RU após cada injeção de composto (injetar solução proteica de 5 μg/mL a 5 μL/min).
    3. Preparar os compostos em diluição em série de 3 vezes e 5 pontos com a concentração máxima a 400 nm, conforme descrito no ponto 3.1.3.
    4. Execute o SPR usando a configuração de ciclo único: Modo: alto desempenho; tempo de contato: 90 s; tempo de dissociação: 600 s; vazão: 50 μL/min. Aplique três injeções de tampão antes de cada composto para garantir um fundo estável.
    5. Análise de dados. Aplique a terceira injeção do buffer como plano de fundo para subtração. Quanto ao controle negativo, o BRD-2512 não apresenta ligação ao PPM1D. Para BRD-4761 e BRD-5110, o ajuste cinético indicou que o KD para ambos era de 1-2 nM.
  5. SPR para CRBN:PROTAC: complexo ternário PPM1D
    1. Prepare o buffer conforme descrito na etapa 3.3.1.
    2. Ativar o chip SA seguindo o protocolo do fabricante e imobilizar CRBN para ~35 RU (injetar uma solução proteica de 0,5 μg/mL a 5 μL/min).
    3. Preparar três compostos em diluição seriada de 3 vezes e 6 pontos com uma concentração máxima de 30 μM, mantendo [PPM1D] a 1 μM em todas as amostras, incluindo os espaços em branco, utilizando o método descrito no passo 3.2.3.
    4. Execute o SPR usando a configuração multiciclo: Modo: Alto desempenho; tempo de contato: 60 s; tempo de dissociação: 90 s; vazão: 50 μL/min.
    5. Realizar análise de dados utilizando o software do fabricante.
      NOTA: Enquanto o BRD-2512 e o BRD-4761 mostram resposta não/desprezível, o BRD-5110 mostra claramente o "efeito gancho" no estado estacionário com cinética liga/desliga rápida (Figura 5A-C). A resposta de ligação experimental do BRD-5110 (Figura 5C) está entre a resposta prevista da simulação ao assumir que K D (CRBN, cpd) é de 3 ou 10 μM (Figura 5E), sugerindo que o ternário K D e o binário K D são muito semelhantes. Não há cooperatividade aparente do PPM1D: BRD-5110: formação do complexo CRBN.

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Resultados

A caracterização da BVS: complexo binário MZ1 e BVS: MZ1: complexo ternárioBrd4 BD2 pode ser encontrada na Figura 2 (ITC), Figura 3 (BLI) e Figura 4 (SPR) usando um buffer muito semelhante. O KD extraído dos ensaios ortogonais é consistente. A cooperatividade pode ser calculada por K D (binário) / KD (ternário), o que é altamente positivo (15 do ITC ou 26 do SPR).

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Discussão

A caracterização biofísica das interações binárias e ternárias entre moléculas de PROTAC e seus parceiros de ligação a proteínas pode fornecer informações únicas e complementares relativas a sistemas celulares amplamente utilizados. Compreender a afinidade entre cada ogiva de uma molécula PROTAC e seus parceiros de ligação a proteínas pode ajudar a orientar os esforços de química medicinal para a otimização dessas interações. Estruturas cristalinas de complexos ternários PROTAC previamente publicadas revelaram que átomos...

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Divulgações

Os autores não têm interesses financeiros concorrentes ou outros conflitos de interesse.

Agradecimentos

Este trabalho foi apoiado por um prêmio de Inovação e Desenvolvimento de Tecnologia do Centro para o Desenvolvimento de Terapêuticas do Broad Institute of MIT e Harvard. Os autores agradecem aos membros da equipe de liderança sênior e ao comitê de revisão pelo apoio a este trabalho.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Greinerde 96 655076pretas de fundo plano usadas em experimentos BLI
Placa de 96 poçosNunc73520-120Uso de placa para preparação de amostras ITC
Placa de 96 poçosGreiner650101Placa usada para preparar amostras para experimentos SPR
Microcalorímetro Auto iTC200Malvern PanalyticalInstrumento utilizado para a realização de experimentos de TIC. Produto descontinuado.
Biacore S200Cytiva29136649Instrumento usado para realizar experimentos SPR
MZ1ProbeChemPC-60099PROTAC que se liga ao chip sensor VHL e Brd4BD2
NTAChip CytivaBR100532SPR usado para realizar experimentos SPR envolvendo PPM1D
Octeto Red-384SartoriusInstrumento usado para realizar experimentos BLI. Produto descontinuado.
Tampa da placaMalvernPQA0001Tampa para placa Nunc de 96 poços (73520-120)
Tampa da placaCytiva28975816Tampa da placa para placa Greiner (650101)
Chip sensor SA da série SChip CytivaBR100531SPR usado para realizar experimentos SPR envolvendo MZ1:VHL:BRD4
Streptavidin (SA) Dip and Read BiosensorsSartorius18-509Sensores revestidos usados em BLI Experiências
Placas placas

Referências

  1. Balaji, V., Hoppe, T. Regulation of E3 ubiquitin ligases by homotypic and heterotypic assembly. F1000Research. 9, (2020).
  2. Song, L., Luo, Z. -Q. Post-translational regulation of ubiquitin signaling. Journal of Cell Biology. 218 (6), 1776-1786 (2019).
  3. Yang, Q., Zhao, J., Chen, D., Wang, Y. E3 ubiquitin ligases: styles, structures and functions. Molecular Biomedicine. 2 (1), 23(2021).
  4. Grice, G. L., Nathan, J. A. The recognition of ubiquitinated proteins by the proteasome. Cellular and Molecular Life Sciences: CMLS. 73 (18), 3497-3506 (2016).
  5. Chirnomas, D., Hornberger, K. R., Crews, C. M. Protein degraders enter the clinic - a new approach to cancer therapy. Nature Reviews Clinical Oncology. 20 (4), 265-278 (2023).
  6. Toure, M., Crews, C. M. Small-molecule PROTACS: New approaches to protein degradation. Angewandte Chemie (International ed. In English). 55 (6), 1966-1973 (2016).
  7. Ottis, P., Toure, M., Cromm, P. M., Ko, E., Gustafson, J. L., Crews, C. M. Assessing different E3 ligases for small molecule induced protein ubiquitination and degradation. ACS Chemical Biology. 12 (10), 2570-2578 (2017).
  8. Riching, K. M., et al. Quantitative live-cell kinetic degradation and mechanistic profiling of PROTAC mode of action. ACS Chemical Biology. 13 (9), 2758-2770 (2018).
  9. Nabet, B., et al. The dTAG system for immediate and target-specific protein degradation. Nature Chemical Biology. 14 (5), 431-441 (2018).
  10. Paiva, S. -L., Crews, C. M. Targeted protein degradation: elements of PROTAC design. Current Opinion in Chemical Biology. 50, 111-119 (2019).
  11. Hershko, A., Ciechanover, A. The ubiquitin system. Annual Review of Biochemistry. 67, 425-479 (1998).
  12. Chan, K. -H., Zengerle, M., Testa, A., Ciulli, A. Impact of target warhead and linkage vector on inducing protein degradation: Comparison of bromodomain and extra-terminal (BET) degraders derived from triazolodiazepine (JQ1) and tetrahydroquinoline (I-BET726) BET inhibitor scaffolds. Journal of Medicinal Chemistry. 61 (2), 504-513 (2018).
  13. Roy, M. J., et al. SPR-measured dissociation kinetics of PROTAC ternary complexes influence target degradation rate. ACS Chemical Biology. 14 (3), 361-368 (2019).
  14. Pierce, N. W., Kleiger, G., Shan, S., Deshaies, R. J. Detection of sequential polyubiquitylation on a millisecond timescale. Nature. 462 (7273), 615-619 (2009).
  15. Gadd, M. S., et al. Structural basis of PROTAC cooperative recognition for selective protein degradation. Nature Chemical Biology. 13 (5), 514-521 (2017).
  16. Nahta, R., Castellino, R. C. Phosphatase magnesium-dependent 1 δ (PPM1D), serine/threonine protein phosphatase and novel pharmacological target in cancer. Biochemical Pharmacology. 184, 114362(2021).
  17. Douglass, E. F. Jr, Miller, C. J., Sparer, G., Shapiro, H., Spiegel, D. A. A comprehensive mathematical model for three-body binding equilibria. Journal of the American Chemical Society. 135 (16), 6092-6099 (2013).
  18. Zorba, A., et al. Delineating the role of cooperativity in the design of potent PROTACs for BTK. Proceedings of the National Academy of Sciences. 115 (31), E7285-E7292 (2018).
  19. Fairhead, M., Howarth, M. Site-specific biotinylation of purified proteins using BirA. Methods in Molecular Biology. 1266, 171-184 (2015).
  20. Nowak, R. P., et al. Plasticity in binding confers selectivity in ligand-induced protein degradation. Nature Chemical Biology. 14 (7), 706-714 (2018).

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