Isolamento, expansão in vitro e caracterização de células-tronco mesenquimais do tecido adiposo epididimal de camundongos

As células-tronco mesenquimais (CTMs) são células adultas multipotenciais que se diferenciam em células como osteoblastos, condroblastos e adipócitos ^1,2. Essas células residem em vários órgãos e, por isso, podem ser extraídas de tecidos adultos, como medula óssea, músculo, gordura, folículo piloso, raiz do dente, placenta, derme, pericôndrio, cordão umbilical, pulmão, fígado e baço ^3,4.

Os efeitos das CTMs na fisiologia e no sistema imunológico têm sido relatados ^5,6. Essas células têm sido promissoras para o tratamento de diversas doenças, tanto na medicina humana quanto veterinária. As CTMs podem controlar a inflamação e promover a angiogênese e a homeostase tecidual por meio de diferentes mecanismos, como contato célula-célula, fatores solúveis e pequenas vesículas extracelulares 7,8,9,10. Além disso, as CTMs são células imunoprivilegiadas capazes de sobreviver em receptores de transplante alogênico imunologicamente incompatíveis, pois essas células apresentam baixa expressão de moléculas do complexo principal de histocompatibilidade (MHC) classe I e são utilizadas em terapia celular para transplante alogênico ^11,12. A baixa imunogenicidade combinada com o potencial regenerativo torna as CTMs candidatas ideais para terapia celular, como doença do enxerto contra o hospedeiro (GvHD)¹³, lúpus eritematoso sistêmico (LES)¹⁴ e esclerose múltipla15, entre^outras16,17.

Apesar de as CTMs residirem em vários tecidos adultos, o tecido adiposo oferece vantagens em relação a outras fontes, como acessibilidade para a captação, com mínima intervenção cirúrgica; grande número de células disponíveis com alta taxa de expansão; e fácil expansão in vitro usando um protocolo de fácil execução, sem a necessidade de equipamentos específicos e materiais de baixo custo 18,19,20. Uma vez extraídas, as células-tronco derivadas do tecido adiposo (ADSCs) devem ser caracterizadas conforme estabelecido pela International Society for Cellular Therapy (ISCT)²¹. Assim, as CTMs devem apresentar morfologia semelhante a fibroblastos, aderência à cultura plástica, expressando uma alta porcentagem (≥95%) de marcadores mesenquimais, como endoglina (CD105), ecto-5'-nucleotidase (CD73) e Thy-1 (CD90), e baixa porcentagem (≤2%) de marcadores hematopoiéticos, como antígeno comum leucocitário (CD45), fosfoglicoproteína transmembrana (CD34), glicoproteína de membrana ancorada em glicolipídios (CD14), integrina alfa M (CD11b), cadeia alfa da proteína associada ao complexo receptor de antígeno de células B (CD79α) ou Antígeno de superfície de linfócitos B B4 (CD19) e antígeno leucocitário humano de classe II (HLA-II). Além disso, é necessária uma caracterização funcional, e as células devem ser capazes de se diferenciar em células osteoblásticas, condroblásticas ou adipoblásticas²¹.

Aqui, mostramos como obter as CTMs do tecido adiposo epididimal usando dissociação mecânica e digestão enzimática para estudos in vitro e a caracterização morfológica preconizada por ISCT.

Todos os experimentos em animais foram conduzidos de acordo com as diretrizes internacionais de ética animal e foram aprovados pelos comitês institucionais de cuidado e uso da Universidade Estadual de Santa Cruz sob o número de protocolo 021/22. Camundongos machos suíços (6-8 semanas) foram adquiridos do Laboratório de Melhoramento, Manutenção e Experimentação Animal - Centro de Pesquisa Animal da Universidade Estadual de Santa Cruz (LaBIO-UESC), mantidos em condições específicas livres de patógenos, recebendo água e alimento ad libitum com ciclos claro/escuro de 12 h.

NOTA: Outras linhagens de camundongos podem ser usadas; Recomendamos o uso de camundongos adultos (6-8 semanas), pois possuem tecido adiposo mais desenvolvido e células com alta atividade proliferativa.

1. Preparação

NOTA: Antes de prosseguir, prepare os seguintes reagentes descritos abaixo. Consulte a Tabela de Materiais para obter informações sobre reagentes e fornecedores de materiais. Equipamentos de proteção individual, como máscaras, bonés, jalecos e luvas, devem ser usados em todos os procedimentos práticos.

1. Extração de tecido adiposo epididimal
   1. Reserve os materiais cirúrgicos: três conjuntos de pinças e tesouras estéreis, cinco agulhas e um copo contendo 200 mL de etanol a 70%.
   2. Prepare um anestésico terminal, misturando cetamina (100 mg/kg) e xilazina (10 mg/kg).
2. Cultura ADSCs
   1. Meio basal: Prepare o meio de alta glicose Modified Eagle Medium (DMEM) de Dulbecco suplementado com 10% de soro fetal bovino (FBS), 50 μg/mL de gentamicina, 0,25 μg/mL de anfotericina B, 100 U/mL de penicilina e 100 mg/mL de estreptomicina.
   2. Solução de digestão: Prepare 0,15% de colagenase tipo II em PBS esterilizado em um filtro de 0,25 μm.
      NOTA: Não é necessário usar os quatro antibióticos descritos no meio basal. Dependerá das condições de cultura de células do laboratório onde isso é realizado.
3. Caracterização fenotípica de ADSCs
   1. Prepare albumina de soro bovino (BSA) a 1% em PBS.
   2. Dilua os anticorpos anti-camundongo conforme mencionado na Tabela 1.
   3. Prepare formaldeído a 2% em PBS.
4. Diferenciação osteogênica de ADSCs
   1. Meio de diferenciação osteogênica: Prepare DMEM suplementado com ácido ascórbico 5,67 M, dexametasona 10 nM, β-glicerofosfato 0,02 M, 10% FBS e 1% de penicilina/estreptomicina.
   2. Para a coloração de Von Kossa, prepare as seguintes soluções: etanol a 70% em água, nitrato de prata a 5% em água, água destilada, tiossulfato de sódio a 5% em água e eosina B a 1% em água.
5. Diferenciação adipogênica:
   1. Meio de diferenciação adipogênica: Prepare DMEM suplementado com 0,5 mM de 3-isobutil-1-metilxantina, 200 μM de indometacina, 1 μM de dexametasona, 10 μM de insulina, 10% de FBS e 1% de penicilina/estreptomicina.
   2. Para coloração Oil-Red, prepare as seguintes soluções: 10% de formalina em água deionizada, 60% de isopropanol em água deionizada, corante diazo de lisocromo (corante lipossolúvel) (solução Oil-Red O) em 60% de isopropanol e 1% de hematoxilina em água deionizada.
6. Diferenciação condrogênica:
   1. Meio de diferenciação condrogênica: Prepare o meio condrogênico suplementado com 10% de FBS e 1% de penicilina/estreptomicina.
   2. Prepare formaldeído a 10% em PBS.
   3. Para coloração de proteoglicanos e glicosaminoglicanos, prepare as seguintes soluções: coloração de heteroglicanos (azul de Alcian 1%) em ácido acético, pH 2,5, parafina, hematoxilina, diluição da série de etanol em água (100%, 96%, 80% e 70%).

Tabela 1: Anticorpos usados para caracterização fenotípica de ADSCs por citômetro de fluxo. Lista de anticorpos com seus respectivos fluorocromos, diluições, clone e concentração final, bem como sua função na célula que é expressa.

2. Métodos

NOTA: O tecido adiposo é distribuído por todo o corpo em locais subcutâneos ou intra-abdominais. Em camundongos, os tecidos adiposos mais comuns usados para experimentos incluem o epidídimo subcutâneo, mesentérico e retroperitoneal²². Aqui, são mostradas as etapas para obtenção do tecido adiposo epididimal (Figura 1).

Figura 1: Desenho experimental para obtenção de células-tronco derivadas do tecido adiposo de camundongos suíços. (A) Usando agulhas, coloque o animal na placa de cortiça ou isopor; (B) Levantar a pele com uma pinça, fazer um corte no centro da região abdominal e descolar a pele do peritônio; (C) identificar o tecido adiposo branco acima do epidídimo; (D) transferir o tecido para o meio DMEM suplementado com 10% de FBS e 1% de antibióticos, lavar bem o tecido adiposo do epidídimo com PBS e transferir o tecido para digerir a solução; (E), fragmentar o tecido e (F) incubar a 37 °C por 1 h agitando vigorosamente a cada 10 min; (G) após a contagem das células, placa em placas de 6 poços e observar a morfologia celular em microscópio invertido. (F) A morfologia celular mudará de redonda para semelhante a fibroblastos. Barra de escala = 22,22 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

1. Extração de tecido adiposo epididimal
   NOTA: Esteja ciente de que todos os procedimentos devem ser realizados em condições estéreis em um gabinete de fluxo laminar para garantir uma cultura de células pura e livre de contaminação.
   1. Eutanasiar os animais com solução de cetamina e xilazina (100 e 10 mg/kg, conforme descrito na etapa 1.1.2) por via intraperitoneal.
      NOTA: Outros métodos de eutanásia podem ser usados²³. Certifique-se de que o animal está morto, confirmando a ausência de batimentos cardíacos.
   2. Coloque o animal com o lado ventral voltado para cima sobre uma placa de cortiça ou isopor coberta com papel alumínio e fixe-o com agulhas estéreis (Figura 1A).
      NOTA: Para evitar contaminação, borrife álcool 70% na região abdominal. Como alternativa, raspe o cabelo com um bisturi.
   3. Levante a pele usando uma pinça no centro da região abdominal e faça um corte com uma tesoura estéril.
      NOTA: Dois conjuntos de pinças e tesouras estéreis são necessários para evitar contaminação. O primeiro é usado para abrir o animal, cortando a pele e a camada peritoneal; o segundo é usado para pegar o tecido adiposo do epidídimo. Além disso, reserve 150 mL de álcool 70% em um copo para limpar tesouras e pinças entre as etapas.
   4. Introduza a tesoura sob a pele do animal e abra-a para destacá-la do peritônio (Figura 1B). Levante a camada peritoneal com uma pinça e corte com uma tesoura estéril.
   5. Use outro conjunto de pinças e tesouras estéreis e identifique o epidídimo acima dos testículos e o tecido adiposo branco acima do epidídimo. Puxe todo o tecido adiposo do epidídimo usando uma pinça estéril, com aproximadamente 2 cm de tamanho, e corte bem próximo ao epidídimo (Figura 1C).
   6. Colocar a gordura em um tubo cônico estéril de 50 mL contendo meio basal e colocá-lo sobre gelo (Figura 1D). No capô, prossiga para as próximas etapas conforme descrito abaixo.
2. Isolamento de células-tronco derivadas do tecido adiposo (ADSCs)
   NOTA: Processe as amostras em uma capela de fluxo laminar de classe biológica II, e o pessoal deve usar jaleco, luvas e máscara cirúrgica.
   1. Lave bem o tecido adiposo do epidídimo com PBS.
      NOTA: Esta etapa é essencial para remover o sangue e outras partículas da amostra. O sangue pode inibir a enzima colagenase tipo II e comprometer o experimento.
   2. Usando uma pinça estéril, transfira o tecido adiposo do epidídimo para um tubo de 50 mL contendo 15-20 mL de solução digestiva, preparado como etapa 1.2.2. Fragmentar o tecido com uma tesoura estéril e incubar o tecido a 37 °C durante 1 h (figura 1E, F).
      NOTA: Um banho-maria ou incubadora a 37 °C pode ser usado nesta etapa. A cada 10 minutos, a suspensão deve ser agitada vigorosamente para facilitar a digestão. Não prolongue o tempo de incubação de 1h.
   3. Inactivar a colagenase diluindo a amostra 1:1 em meio basal e centrifugar a suspensão a 250 x g durante 10 min a 4 °C para obter a fracção vascular do estroma. Rejeitar o sobrenadante e ressuspender o sedimento em 1 ml de meio basal.
   4. Verificar a viabilidade e contar as células através do método de exclusão do corante azul de tripano numa câmara de Neubauer utilizando uma diluição de 1:10 ou 1:100.
      NOTA: O rendimento esperado é de cerca de 0,5-1 milhão de células/g de tecido adiposo processado e viabilidade de 80%.
   5. Coloque as células isoladas (0,3-0,5 milhão) em 3 mL de meio basal em um poço de uma placa de 6 poços. Incubar as células durante a noite a 37 °C com 5 % de CO₂.
   6. Dia seguinte: Remova o meio do poço e lave as células com PBS. Adicione 3 mL de meio basal. Repita esse processo a cada 2 dias até que as células se tornem 90% confluentes.
      NOTA: Sempre observe a morfologia das células ao microscópio invertido, mudando de redondas para fibroblastos (Figura 1H).
3. Expansão de células-tronco derivadas do tecido adiposo (ADSCs)
   NOTA: Assim que as células crescerem ~ 90% confluentes, prossiga para a subcultura conforme descrito abaixo.
   1. Remova o meio do poço e lave as células com PBS. Adicione 0,5 mL / poço de tripsina / EDTA (0,05% de tripsina; 200 mg / L de EDTA) e incube a placa por 3-5 min a 37 ° C para separar as células.
      NOTA: Não exceda 5 min em tripsina / EDTA. O descolamento completo das células deve ser verificado ao microscópio invertido. O processo pode ser acelerado pipetando para cima e para baixo com cuidado ou batendo na lateral da placa.
   2. Inative a enzima diluindo a amostra 1:1 em DMEM suplementado com 10% de soro fetal bovino (FBS) e 1% de antibióticos.
   3. Divida a suspensão celular em 2 alvéolos e adicione 3 ml de meio basal (DMEM suplementado com 10% de FBS e 1% de antibióticos). Incubar durante a noite a 37 °C com 5% de CO₂.
   4. Troque o meio no dia seguinte, depois a cada 2 dias até 90% de confluência.
   5. Repita o processo até a terceira passagem e prossiga para a caracterização fenotípica e funcional.
      NOTA: Sempre observe a morfologia das células sob o microscópio invertido, mudando de redondas para fibroblásticas.
4. Caracterização de células-tronco derivadas do tecido adiposo (ADSCs)
   1. Caracterização fenotípica por citometria de fluxo
      1. Separar as células utilizando tripsina/EDTA, conforme descrito nos passos 2.3.1 a 2.3.2.
      2. Recolher as células num tubo cónico (50 ml) e centrifugar a 250 x g durante 10 min a 4 °C. Descarte o sobrenadante e ressuspenda o pellet em 1 mL de PBS.
      3. Conte as células conforme descrito na etapa 2.2.4 e semeie 0,5-1 x 10⁶ células em 100 μL de PBS em uma placa de 96 poços.
         NOTA: O número de poços dependerá da cor do conjugado de fluorocromo e dos filtros/lasers do citômetro.
      4. Adicionar anticorpos (Tabela 1) diluídos em 1% de BSA em PBS.
         NOTA: Não é necessário usar o bloqueio Fc para evitar a ligação inespecífica porque já usamos BSA para diluir anticorpos. Reserve uma amostra de células sem receber anticorpos que serão usados como controle de coloração. Os anticorpos podem ser combinados no mesmo poço de acordo com o corante de fluorocromo e o citômetro disponíveis no laboratório. Todos os anticorpos descritos na Tabela 1 podem ser adicionados no mesmo poço, exceto o CD71 FITC e o CD29 FITC, que devem estar em poços diferentes devido ao mesmo fluorocromo.
      5. Incubar a placa durante 30 min a 4 °C na escuridão.
      6. Lave as células e, em seguida, complete o volume para 200 μL usando PBS, centrifugue a placa a 252 x g por 10 min a 4 ° C e descarte o sobrenadante. Repita esta etapa mais uma vez.
      7. Fixe as células adicionando 200 μL por poço de formaldeído a 2% em PBS. Conservar as células na obscuridade a 4 °C até à análise no citómetro de fluxo.
         NOTA: Para obter melhores resultados, adquira as células no citômetro de fluxo o mais rápido possível. O brilho da fluorescência dos marcadores diminui significativamente após 48 h para a maioria dos fluorocromos. Portanto, não exceda 48 h para ler a placa. Recomenda-se a aquisição de 30.000 eventos.
      8. Use a estratégia de gating apresentada na Figura 2B para selecionar a população ASC.
   2. Caracterização funcional: Diferenciação osteogênica
      1. Separar as células utilizando tripsina/EDTA (conforme descrito nos passos 2.3.1 a 2.3.2), recolher e centrifugar as células (conforme descrito nos passos 2.4.1.2 e 2.4.1.2) e contá-las (conforme descrito nos passos 2.2.4).
      2. Placa, em triplicata, 2 x 10⁵ células por poço em placas de 6 poços em medial basal (DMEM suplementado com 10% de FBS e 1% de antibióticos); incubar a 37 °C em 5% de CO₂.
         NOTA: Serão necessárias duas placas de 6 poços, uma para cada tempo de diferenciação (14 e 21 dias).
      3. No dia seguinte, mude o meio para meio osteogênico (etapa 1.4.1).
         NOTA: reserve 3 poços sendo cultivados apenas com o meio basal, que será o controle para diferenciação.
      4. Cultive células por 14 e 21 dias em meio osteogênico e as células controle, trocando de meio a cada 3 dias. Proceder à coloração de Von Kossa (passo 1.4.2) para avaliar os nódulos mineralizados no final de cada período de cultura.
      5. Aspire o meio de cada poço e lave as células duas vezes com PBS. Fixe as células com 2 mL de etanol a 70% durante a noite à temperatura ambiente (RT). Lave as células cuidadosamente em água corrente.
      6. Adicione 2 mL de solução de nitrato de prata a 5% e incube a placa em luz ultravioleta por 1 h. Lave as células com água destilada. Adicione 2 mL de tiossulfato de sódio a 5% e incube por 5 min. Lave com água destilada.
      7. Contra-coloração com 2 mL de eosina por 40 s. Lave com água destilada até que a solução de coloração seja removida e visualize a coloração usando um microscópio óptico.
   3. Caracterização funcional: Diferenciação adipogênica
      1. Separar as células utilizando tripsina/EDTA (conforme descrito nos passos 2.3.1 a 2.3.2), recolher e centrifugar as células (conforme descrito nos passos 2.4.1.2 e 2.4.1.2) e contá-las (conforme descrito nos passos 2.2.4).
      2. Placa 2 x 10⁵ células por alvéolo em placas de 6 poços em medial basal (DMEM suplementado com 10% de FBS e 1% de antibióticos); incubar a 37 °C em 5% de CO₂.
         NOTA: Serão necessárias duas placas de 6 poços, uma para cada tempo de diferenciação (14 e 21 dias).
      3. No dia seguinte, troque o meio para meio adipogênico (etapa 2.5.1).
         NOTA: Reserve 3 poços sendo cultivados apenas com o meio basal como controle.
      4. Cultivar células por 14 e 21 dias em meio adipogênico, trocando de meio a cada 3 dias. No final de cada período de cultura, prossiga para a coloração Oil-Red O (etapas 2.4.3.5-2.4.3.7), um indicador de acúmulo de lipídios intracelulares.
      5. Aspire a mídia de cada poço. Lave as células duas vezes com PBS. Fixe as células em 2 mL de formalina a 10% por 1 h. Lave uma vez com PBS e depois uma vez com água.
      6. Manchar com 2 mL de solução de Óleo-Vermelho O em isopropanol a 60% por 5 min. Lave uma vez com água destilada.
      7. Contracoloração com 2 mL de hematoxilina a 1% diluída 1:2 em água destilada por 1 min. Lave com água destilada até que a solução de coloração seja removida e visualize as amostras coradas usando um microscópio óptico.
   4. Caracterização funcional: diferenciação condrogênica
      1. Separar as células utilizando tripsina/EDTA (conforme descrito nos passos 2.3.1 a 2.3.2), recolher e centrifugar as células (conforme descrito nos passos 2.4.1.2 e 2.4.1.2) e contá-las (conforme descrito nos passos 2.2.4).
      2. Coloque 5 x 10⁵ ADSCs em quatro tubos cônicos de polipropileno e centrifugue a 450 x g por 5 min para formar um pellet. Descarte o sobrenadante.
      3. Cultivar os pellets num tubo cónico num meio condrogénico (passo 1.6.1) ou apenas em meio basal (controlo da diferenciação) durante 14 e 21 dias a 37 °C em CO₂ a 5%. Troque o meio a cada 3 dias e evite remover pellets.
         NOTA: Cada pellet celular refere-se a cada época de cultivo, bem como seus respectivos controles cultivados apenas com meio basal.
      4. No final de cada ponto de tempo da cultura, colete os pellets usando uma pinça de ponta fina e coloque-os em uma placa de 24 poços. Proceda à secção histológica e coloração de proteoglicanos e glicosaminoglicanos (etapas 2.4.4.5.-2.4.4.9).
         NOTA: Cada pellet é processado em um poço separado.
      5. Fixe os pellets em 2 mL de formaldeído tamponado a 10% por 30 min. Descarte a solução de formaldeído e adicione 2 mL de etanol a 70%. Remova o pellet do tubo cônico usando uma ponta e embeba os pellets em parafina.
      6. Usando um micrótomo de parafina rotativo, faça cortes histológicos de 5 μm. Incubar as secções durante 15 min a 60 °C e mergulhá-las duas vezes em xileno (durante 5 e 15 min).
      7. Reidrate as amostras imergindo os cortes histológicos em banhos de álcool em concentrações decrescentes (100%, 96%, 80% e 70%) por 2 min cada, depois enxágue com água deionizada por 5 min.
      8. Proceda à coloração das amostras com azul de Alcian 1% em ácido acético, pH 2,5, por 30 min.
      9. Contra-coloração com hematoxilina por 1 min e lave com água destilada. Monte com DPX (mountant para histologia) ou outra solução de montagem e visualize amostras usando um microscópio óptico.

As células extraídas do tecido adiposo de acordo com o protocolo aqui apresentado apresentaram morfologia compatível com os critérios mínimos para CTMs propostos pelo ISCT. Uma visão geral do protocolo é mostrada na Figura 1. Fenotipicamente, as ADSCs mostraram aderência à morfologia plástica e semelhante a fibroblastos nos primeiros dias de cultura celular (Figura 2A). Além disso, eles cresceram de forma homogênea e formaram colônias. Além disso, as ADSCs apresentaram baixa expressão de CD34 (2,12%) e CD45 (1,81%), ambos marcadores hematopoiéticos, e alta expressão de CD71 (42,6%), CD29 (74,2%) e CD90 (55,1%), todos marcadores de células mesenquimais (Figura 2B).

Figura 2: Caracterização fenotípica de células derivadas do tecido adiposo. (A) Morfologia das ADSCs mudando de redonda para semelhante a fibroblastos nos dias 2, 4 e 8 da cultura; barra de escala = 22,22 μm. (B) Histogramas para marcadores expressos (CD71, CD29 e CD90) ou não (CD34 e CD45) por ASC. Essa figura foi reproduzida com permissão de Miranda et al.24. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Funcionalmente, as ADSCs mostraram multipotência para se diferenciar em osteoblastos, adipoblastos e condroblastos quando cultivadas em meio condicionado para cada linhagem por 14 ou 21 dias (Figura 3). A coloração de Von Kossa revelou nódulos mineralizados na matriz extracelular, característicos do processo de osteogênese (Figura 3). A coloração Óleo-vermelho O evidenciou vacúolos lipídicos no citoplasma das ADSCs, e a coloração Alcian Blue confirmou a presença de glicosaminoglicanos na matriz extracelular (Figura 3). Juntas, características fenotípicas e funcionais confirmaram a população de células extraídas do tecido adiposo epididimal como CTMs.

Figura 3: Caracterização funcional de células derivadas do tecido adiposo. Potencial osteogênico, adipogênico e condrogênico de múltiplas linhagens de ADSC após 14 e 21 dias de cultivo. Barra de escala = 50 μm (painel superior), 100 μm (painéis central e inferior). Essa figura foi reproduzida com permissão de Miranda et al.24. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Os autores não têm nada a divulgar.