Este trabalho de protocolo descreve a metodologia de microinjeção embrionária de lente de frango de um retrovírus RCAS(A) como uma ferramenta para estudar a função in situ e a expressão de proteínas durante o desenvolvimento do cristalino.
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Artigo de método
Microinjeção de Retrovírus RCAS(A) Recombinante em Lentes de Galinha Embrionárias
Neste artigo
Resumo
Resumo
A galinha embrionária (Gallus domesticus) é um modelo animal bem estabelecido para o estudo do desenvolvimento e fisiologia do cristalino, dado o seu alto grau de similaridade com o cristalino humano. RCAS(A) é um retrovírus de galinha competente em replicação que infecta células em divisão, que serve como uma ferramenta poderosa para estudar a expressão in situ e a função de proteínas selvagens e mutantes durante o desenvolvimento do cristalino por microinjeção no lúmen vazio da vesícula do cristalino nos estágios iniciais de desenvolvimento, restringindo sua ação às células do cristalino em proliferação circundantes. Em comparação com outras abordagens, como modelos transgênicos e culturas ex vivo , o uso de um retrovírus aviário competente em replicação RCAS(A) fornece um sistema altamente eficaz, rápido e personalizável para expressar proteínas exógenas em embriões de pintinhos. Especificamente, a transferência gênica direcionada pode ser confinada a células de fibras proliferativas do cristalino sem a necessidade de promotores tecido-específicos. Neste artigo, faremos uma breve visão geral das etapas necessárias para a preparação de RCAS(A) de retrovírus recombinante, forneceremos uma visão geral detalhada e abrangente do procedimento de microinjeção e forneceremos resultados de amostra da técnica.
Introdução
O objetivo deste protocolo é descrever a metodologia de microinjeção embrionária de lente de frango de um RCAS(A) (replication-competente avian sarcoma/leukosis retrovirus A). A liberação retroviral efetiva em uma lente de frango embrionária tem se mostrado uma ferramenta promissora para o estudo in vivo do mecanismo molecular e da função-estrutura das proteínas do cristalino na fisiologia normal do cristalino, condições patológicas e desenvolvimento. Além disso, esse modelo experimental poderia ser utilizado para a identificação de alvos terapêuticos e triagem medicamentosa para condições como catarata congênita humana. Ao todo, esse protocolo visa estabelec....
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Protocolo
Este estudo foi conduzido em conformidade com a Lei de Bem-Estar Animal e os Regulamentos de Implementação de Bem-Estar Animal de acordo com os princípios do Guia para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório. Todos os procedimentos com animais foram aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais do Centro de Ciências da Saúde da Universidade do Texas em San Antonio. Para obter uma visão geral do protocolo, consulte a Figura 1; consulte a Tabela de Materiais para obter detalhes sobre todos os materiais, reagentes e instrumentos usados neste protocolo.
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Resultados
Após a determinação de uma(s) proteína(s) alvo(s) específica(s) e a identificação da(s) sequência(s) gênica(s) associada(s), a abordagem experimental global envolve a clonagem da(s) sequência(s) gênica(s) em um vetor retroviral RCAS(A) pela clonagem inicial em um vetor adaptador, seguida por um vetor viral. Em segundo lugar, partículas virais de alto título são preparadas usando células de embalagem para colher e concentrar os vírions. Esses dois primeiros passos principais têm sido amplamente descritos e resultados repr.......
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Discussão
Este modelo experimental oferece a oportunidade de expressar a(s) proteína(s) de interesse no cristalino intacto, levando ao estudo da relevância funcional dessas proteínas na estrutura e função do cristalino. O modelo de microinjeção de pintinhos embrionários é parcialmente baseado no trabalho de Fekete et. al.6 e foi desenvolvido por Jiang et. al.8 e tem sido utilizada como meio de inserção de plasmídeos virais e agentes como agonistas, pequenos RNAs interferentes (siRNA).......
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Divulgações
Os autores declaram que a pesquisa foi conduzida na ausência de quaisquer relações comerciais ou financeiras que pudessem ser interpretadas como um potencial conflito de interesses.
Agradecimentos
Este trabalho foi apoiado pelo National Institutes of Health (NIH) Grants: RO1 EY012085 (para J.X.J) e F32DK134051 (para F.M.A), e concessão da Fundação Welch: AQ-1507 (para J.X.J.). O conteúdo é de responsabilidade exclusiva dos autores e não representa necessariamente a opinião oficial do National Institutes of Health. As figuras foram parcialmente criadas com Biorender.com.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| 0,22 µ m Filtro | Corning | 431118 | Para remover detritos celulares do meio |
| 35 mm x 10 mm Placa de cultura | FisherScientific | 50-202-030 | Para uso durante a microinjeção |
| Centrífuga | Fisherbrand | 13-100-676 | Solução giratória |
| Construções | GENEWIZ | - | Para geração de construções |
| Microscópio de dissecação | AmScope | SM-4TZ-144A | Visualização de lente para |
| microinjeção de primers de PCR de DNA | Tecnologias de DNA | integradas-Geração de primers: Loop intracelular (IL)-deletado Cx50 (resíduos 1– 97 e 149– 400), bem como o vetor Cla12NCO foram obtidos com o seguinte par de primers: sense, CTCCTGAGAACCTACATCCT; antisense, CACCGCATGCCCAAAGTACAC ILs de Cx43 (resíduos 98– 150) e Cx46 (resíduos 98; 166) eram obtidos com os seguintes pares de primers: sense, TACGTGATGAGGAAAGAAGAG; antisense, TCCTCCACGCATCTTTACCTTTTG; sentido, CACATTGTACGCATGGAAGAG; antisense, AGCACCTCCC AT ACGGATTC, respectivamente O modelo de construto Cla12NCO-Cx43 foi obtido com o seguinte par de primers: sense, CTGCTTCGTACTTACATCATC; antisense, GAACAC GTGCGCCAGGTAC ILs de Cx50 (resíduos 98– 148) ou Cx46 (resíduos 98– 166) foram clonados usando as construções Cla12NCO-Cx50 e Cla12NCO-Cx46 como modelos com o seguinte par de primers: sense, CACCATGTCCGCATGGAGGAGA; antisense, GGTCCCC TC CAGGCGAAAC; sentido, CACATTGTACGCATGGAAGAG; antisense, AGCACCTCCCATACGGATTC, respectivamente | |
| Drummond Nanoject II Injetor Automático de Nanolitros | Drummond Scientific | 3-000-204 | Pipeta de Microinjeção |
| Luzes Gooseneck Duplas Iluminador de Microscópio | AmScope | LED-50WY | Iluminação para visualização |
| Dulbecco' s Modified Eagle Medium (DMEM) | Invitrogen | Para | |
| Porta-Ovos de Cultura de Células | - | Anéis de isopor caseiros com 2 polegadas de diâmetro e meia polegada de altura | |
| Incubadora de Ovos | GQF Manufacturing Company Inc. | 1502 | Para incubação de ovos fertilizados |
| Fast Green | Fisher científico | F99-10 | Para visualização de injeção de estoque viral |
| Ovos de galinha leghorn brancos fertilizados | Texas A& M University | N/A | Modelo animal de escolha para microinjeção (https://posc.tamu.edu/fertile-egg-orders/) |
| Soro Fetal Bovino (FBS) | Hyclone Laboratories | Para cultura de células | |
| IgG anti-camundongo conjugada com fluoresceína Jackson | ImmunoResearch | 115-095-003 | Para fórceps anti-FLAG 1:500 |
| FisherScientific | 22-327379 | Para mover coisas e isolamento | |
| Capilares de vidro | Sutter Instruments | B100-75-10 | Micropipeta de vidro para microinjecção (O.D. 1,0 mm, I.D. 0,75 mm, 10 cm de comprimento) |
| Lipofectamina | Invitrogen | L3000001 | Para transfecção |
| Extrator de micropipeta vertical manual | Sutter Instruments | P-30 | Para obter micropipeta de vidro do tamanho correcto |
| Tubos de | microcentrífugaFisherScientific | 02-682-004 | Solução de dissolução |
| Microscópio | Keyence | BZ-X710 | Para coloração de imagem |
| Parafilm | FisherScientific | 03-448-254 | Solução de colocação |
| Penicilina / Estreptomicina | Invitrogen | Para cultura de células | |
| Pico-Injetor | Harvard Apparatus | PLI-100 | Para fornecer pequenos volumes de líquido com precisão através de micropipetas, aplicando uma pressão regulada por um período de tempo definido digitalmente |
| anti-pintinho AQP0 | Auto-gerado-Jiang | JX, White TW, Goodenough DA, Paul DL. Clonagem molecular e caracterização funcional da fibra do cristalino de pintinho conexina 45.6. Célula Mol Biol. Março de 1994; 5(3):363-73. DOI: 10.1091/MBC.5.3.363. | |
| anticorpo anti-FLAG para coelho | Rockland Immunichemicals | 600-401-383 | Para coloração FLAG |
| IgG anti-coelho conjugado com rodamina | Jackson ImmunoResearch | 111-295-003 | Para almofada de fixação de esponja anti-AQP0 1:500 |
| Sutter Instruments | BX10 | Para armazenamento de micropipeta de vidro |
Referências
- Li, Z., Gu, S., Quan, Y., Varadaraj, K., Jiang, J. X. Development of a potent embryonic chick lens model for studying congenital cataracts in vivo. Communications Biology. 4 (1), 325(2021).
- Chen, Y., et al.
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Reimpressões e permissões
