Artigo de método

Microinjeção de Retrovírus RCAS(A) Recombinante em Lentes de Galinha Embrionárias

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DOI:

10.3791/65727

⸱

1 de setembro de 2023

 ,  ,  , 
1Department of Biochemistry and Structural Biology, University of Texas Health Science Center, San Antonio

Neste artigo

Resumo

Este trabalho de protocolo descreve a metodologia de microinjeção embrionária de lente de frango de um retrovírus RCAS(A) como uma ferramenta para estudar a função in situ e a expressão de proteínas durante o desenvolvimento do cristalino.

Resumo

A galinha embrionária (Gallus domesticus) é um modelo animal bem estabelecido para o estudo do desenvolvimento e fisiologia do cristalino, dado o seu alto grau de similaridade com o cristalino humano. RCAS(A) é um retrovírus de galinha competente em replicação que infecta células em divisão, que serve como uma ferramenta poderosa para estudar a expressão in situ e a função de proteínas selvagens e mutantes durante o desenvolvimento do cristalino por microinjeção no lúmen vazio da vesícula do cristalino nos estágios iniciais de desenvolvimento, restringindo sua ação às células do cristalino em proliferação circundantes. Em comparação com outras abordagens, como modelos transgênicos e culturas ex vivo , o uso de um retrovírus aviário competente em replicação RCAS(A) fornece um sistema altamente eficaz, rápido e personalizável para expressar proteínas exógenas em embriões de pintinhos. Especificamente, a transferência gênica direcionada pode ser confinada a células de fibras proliferativas do cristalino sem a necessidade de promotores tecido-específicos. Neste artigo, faremos uma breve visão geral das etapas necessárias para a preparação de RCAS(A) de retrovírus recombinante, forneceremos uma visão geral detalhada e abrangente do procedimento de microinjeção e forneceremos resultados de amostra da técnica.

Introdução

O objetivo deste protocolo é descrever a metodologia de microinjeção embrionária de lente de frango de um RCAS(A) (replication-competente avian sarcoma/leukosis retrovirus A). A liberação retroviral efetiva em uma lente de frango embrionária tem se mostrado uma ferramenta promissora para o estudo in vivo do mecanismo molecular e da função-estrutura das proteínas do cristalino na fisiologia normal do cristalino, condições patológicas e desenvolvimento. Além disso, esse modelo experimental poderia ser utilizado para a identificação de alvos terapêuticos e triagem medicamentosa para condições como catarata congênita humana. Ao todo, esse protocolo visa estabelecer as etapas necessárias para o desenvolvimento de uma plataforma customizável para o estudo das proteínas do cristalino.

Pintos embrionários (Gallus domesticus), devido à sua semelhança na estrutura e função do cristalino com o cristalino humano, são um modelo animal bem estabelecido para o estudo do desenvolvimento e fisiologia do cristalino 1,2,3,4. O uso de um retrovírus aviário com competência em replicação RCAS(A) tem sido considerado um sistema altamente eficaz, rápido e personalizável para expressar proteínas exógenas em embriões de pintinhos. Notavelmente, ele tem uma capacidade única de confinar a transferência do gene alvo às células de fibra do cristalino proliferativo sem a necessidade de promotores tecido-específicos, usando o período de tempo de desenvolvimento embrionário único no qual a presença de lúmen vazio do cristalino permite a microinjeção in situ de RCAS(A) no local restrito para a expressão de proteínas exógenas dentro de células de fibras proliferativas do cristalino5, 6,7,8.

O procedimento de microinjeção de embrião de pintinho, descrito em profundidade aqui, é originalmente parcialmente baseado no trabalho de Fekete et. al.6 e desenvolvido por Jiang et. al.8 e tem sido utilizada como meio de introdução de plasmídeos virais e não virais no cristalino de pintos embrionários 1,9,10,11,12,13. Em geral, o trabalho anterior demonstra o potencial da utilização desta metodologia para estudar o desenvolvimento do cristalino, diferenciação, comunicação celular e progressão da doença, e para a descoberta e teste de alvos terapêuticos para condições patológicas do cristalino, como catarata.

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Protocolo

Este estudo foi conduzido em conformidade com a Lei de Bem-Estar Animal e os Regulamentos de Implementação de Bem-Estar Animal de acordo com os princípios do Guia para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório. Todos os procedimentos com animais foram aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais do Centro de Ciências da Saúde da Universidade do Texas em San Antonio. Para obter uma visão geral do protocolo, consulte a Figura 1; consulte a Tabela de Materiais para obter detalhes sobre todos os materiais, reagentes e instrumentos usados neste protocolo.

figure-protocol-1
Figura 1: Delineamento experimental. 1 . O primeiro passo do protocolo é a determinação de uma(s) proteína(s) alvo(s) específica(s), a identificação da(s) sequência(s) gênica(s) associada(s) e a geração de fragmentos de DNA. 2 . Clonagem da(s) sequência(s) genética(s) em um vetor retroviral por clonagem inicial em um vetor adaptador, 3. seguida de um vetor viral . 4 . Preparação de partículas virais de alto título usando células de embalagem para colheita e concentração. 5 . A etapa final, e o foco deste protocolo, é a microinjeção das partículas virais RCAS(A) no lúmen do cristalino. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

1. Preparação de retrovírus recombinantes de alto título

  1. Reação em cadeia da polimerase (PCR) para produzir fragmentos de DNA da proteína alvo
    NOTA: Esta seção tem como objetivo amplificar a sequência de DNA correspondente à proteína alvo da lente. Para mais detalhes, ver 7,8.
    1. Projetar primers para PCR, correspondentes à proteína de interesse, para fazer fragmentos de DNA com seu termini carboxila no quadro com ou sem uma sequência de epítopos FLAG (5'-GACTACAAGGACGACGATGACAAG-3'), um códon de parada e um sítio de enzima de restrição (ou seja, EcoRI) presente dentro da região poliligante de CLa12NCO)) de acordo com as especificações observadas em protocolos publicados anteriormente, com sequências para enzimas de restrição adequadas1, 7,8,10,11.
    2. Realizar a reação de PCR10. Combine 100 pmol de sentido e antisenso dos primers projetados com 0,5 μg de cDNA conexina (como combinações Cx50, Cx43 ou Cx50*43L quiméricas) ao tampão de reação de PCR de escolha. Realizar 30 ciclos cada um consistindo de 94 °C por 1 min, 58 °C por 1 min e 72 °C por 1 min, seguidos por uma extensão final por 10 min a 72 °C.
    3. Isolar e purificar produtos de PCR com um kit de purificação em gel.
    4. Digerir os produtos de PCR purificados usando enzimas de restrição de escolha de acordo com as instruções do fabricante.
  2. Clonagem de inserções de DNA em plasmídeo adaptador
    NOTA: A inserção de fragmentos de DNA em um vetor adaptador elimina a necessidade de células/vírus auxiliares para aumentar a estabilidade do vetor RCAS(A)14. Para mais detalhes, ver 7,8.
    1. Subclone fragmentos de DNA em um plasmídeo adaptador, Cla12NCO usando uma reação de ligadura pegajosa. Misturar os fragmentos de PCR com enzimas de restrição e Cla12NCO na proporção de 2-5:1. Realizar ligadura e transformação de DNA utilizando células competentes.
    2. Isolar DNA usando um kit de isolamento de DNA.
    3. Sequencie o DNA para garantir a precisão.
  3. Clonagem no vetor viral RCAS(A)
    OBS: Fragmentos de DNA são inseridos em um veículo (retrovírus RCAS(A)) para a transdução estável de um gene em células do embrião de pintinho em desenvolvimento14,15. Para mais detalhes, ver 7,8,15.
    1. Digerir o fragmento de Cla12NCO-DNA do vetor de interesse com ClaI (1 unidade por 1 μg de DNA) e isolar os fragmentos em gel.
    2. Subclonar os fragmentos de DNA em um plasmídeo RCAS(A) linearizado por ClaI. Use a enzima de restrição SalI para distinguir o sítio ClaI no plasmídeo RCAS(A).
    3. Confirmar a orientação correta dos fragmentos inseridos nas construções por digestão com enzimas de restrição ClaI e SalI.
    4. Isolar DNA usando um kit de isolamento de DNA.
    5. Determinar a concentração de DNA.
  4. Transfecção de células de fibroblastos embrionários de pintinhos (CEF) e colheita de RCAS(A)
    OBS: Células de empacotamento de vírus, CEFs, são utilizadas para obter/colher meios de cultura celular contendo partículas virais15,16. Para mais detalhes, ver 7,8,15.
    1. Transfect CEF células com DNA retroviral recombinante constrói usando o agente de transfecção de acordo com as instruções do fabricante.
    2. Realizar western blotting das células transfectadas para examinar sua expressão da proteína de interesse.
    3. Quando as células transfectadas atingirem a confluência, começar a coletar o meio sobrenadante, processá-lo/filtrá-lo adequadamente (para remover qualquer detrito celular usando um filtro de 0,22μm) e armazenar a -80 °C até que esteja pronto para a concentração.
  5. Concentração e titulação das existências virais
    NOTA: O pellet e grandes volumes de meios derivados das células que contêm as partículas virais devem ser filtrados. Além disso, um ensaio de título viral deve ser realizado para estabelecer a força do vírus contra as células hospedeiras. Para mais detalhes, ver 6,7,8,15.
    1. Descongelar os meios de cultura contendo os virions.
    2. Girar o meio de cultura a 72.000 × g por 2 h a 4 °C.
    3. Decantar o sobrenadante e ressuspender a pastilha viral com o meio residual (~50 μL) e armazenar a -80 °C até o uso, em estoques virais de ~10 μL.
    4. Para titulação, usando células QT-6 ou CEF, transfecte as células com uma diluição em série dos estoques virais.
    5. Após a confluência, fixar as células com formol a 4%.
    6. Imunocoloração para proteínas gag virais ou processo para fosfatase alcalina histoquimicamente para obtenção do título, definido como (unidades formadoras de colônia) UFC por mililitro (UFC/mL).

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Figura 2: Instrumentos e setup para microinjeção de lente de pintinho . (A) Puxador manual de micropipeta de microeletrodo vertical P-30. (1) inset mostrando uma micropipeta de vidro sendo puxada. (B) (2) Incubadora de Ovos. Incubar o ovo de galinha por ~65-68 h em uma incubadora de 37 °C para atingir o estágio 18 (com um lúmen central selado e vazio) para injeção de retrovírus. (C) Configuração da microinjeção. (3) equipamento de iluminação, (4) Pico-Injetor, (5) microscópio dissecante, (6) micromanipulador Drummond, (7) computador/câmera para visualização. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

2. Microinjeção de lente de pintinho

  1. Preparação de suprimentos
    1. Preparação de micropipetas de vidro para microinjeção17
      NOTA: Os capilares de vidro são usados para fazer micropipetas de vidro com um ponto de ponta e um diâmetro externo (OD) de ~11 μm para microinjeção. A configuração é mostrada na Figura 2A.
      1. Fixe o capilar de vidro borossilicato aos grampos de borracha almofadados no puxador manual vertical de micropipetas.
      2. Ajuste a temperatura térmica (HEAT 1) para 950 °C e realize a pré-tração para obter um capilar de vidro mais fino e macio.
      3. Ajuste a temperatura térmica (HEAT 2) para 790 °C e execute uma tração secundária para produzir micropipetas finais.
      4. Com um moedor de micropipeta, afie a abertura da ponta para um OD de ~11 μm.
      5. Para experimentos futuros, mantenha as micropipetas de vidro em uma almofada de fixação de esponja dentro de um frasco de vidro.
    2. Incubação dos ovos fertilizados até o estágio de desenvolvimento 18
      NOTA: Durante o desenvolvimento do cristalino, a ~65-68 h de desenvolvimento embrionário, o cristalino se separa do ectoderma e forma uma vesícula selada com um lúmen central; A injeção nesse lúmen vazio do cristalino estimula a expressão restrita às células proliferativasdo cristalino 7,8,18.
      1. Incubar ovos de galinha fertilizados por ~65-68 h em uma incubadora de balanço umidificada a 37 °C (Figura 2B).
  2. Abertura do ovo de galinha
    NOTA: Esta etapa descreve a identificação e exposição do embrião para microinjeção. Para mais detalhes, ver 7,8.
    1. Limpe bem a área de trabalho com etanol 70%.
    2. Retire os ovos da incubadora, pulverize-os fortemente com etanol 70% e deixe-os secar ao ar.
    3. Coloque o ovo, com a extremidade maior do ovo virada para cima, sobre um suporte de ovo.
    4. Usando um par de pinças de dentes afiados, produza um orifício de ~2 cm de diâmetro na extremidade maior do ovo, batendo cuidadosamente na casca do ovo e removendo fragmentos da casca do ovo (Figura 3A).
    5. Usando um microscópio dissecante, localize o embrião.
    6. Uma vez localizado o embrião e o cristalino do pintinho, utilizar o microscópio dissecante e a pinça e tesoura finas dissecantes para cortar a membrana amniônica que recobre imediatamente a parte superior do embrião (Figura 3B).
      NOTA: Não corte muito (apenas o suficiente para expor o embrião ~0,5 cm x 0,5 cm), ou então os embriões podem afundar na massa vitelírica; Evite também tocar nos vasos sanguíneos, se possível.
    7. Cubra a abertura do ovo com uma placa de Petri de 60 mm em preparação para os próximos passos.
  3. Microinjeção de estoque viral concentrado
    NOTA: Partículas virais contendo fragmentos de DNA da proteína alvo para transdução são inseridas nas células dentro do lúmen do cristalino. A configuração é mostrada na Figura 2C. Para mais detalhes, ver 6,7,8.
    1. Descongele os estoques virais no gelo.
    2. Para visualização do estoque viral durante a injeção, diluir 1 μL de 10x Fast green em um frasco de estoque viral contendo 10 μL.
    3. Para garantir que não haja grandes pedaços de material não dissolvido que possam entupir a micropipeta de vidro, centrifugar as soluções por 10 s a 10.000 × g a 4 °C para pellet "grandes pedaços" e transferir os sobrenadantes para novos tubos, tudo mantendo as soluções no gelo.
    4. Em uma placa de cultura de 35 mm x 10 mm, coloque um parafilme de laboratório esticado e adicione 1 μL de solução salina estéril (PBS) sobre o filme (não esterilizado, com o lado coberto considerado "limpo").
    5. Conecte uma micropipeta de vidro preparada a um pico-injetor automático.
    6. Pressione o modo de enchimento para encher o soro fisiológico estéril (PBS) em uma micropipeta de vidro e, em seguida, use o modo de injeção para testar o 1 μL alocado de líquido.
    7. Coloque um segundo parafilme de laboratório esticado na superfície de uma nova placa de cultura celular de 35 mm x 10 mm e adicione 1 μL de estoques virais corados de verde rápido sobre o filme.
    8. Abaixe a ponta da micropipeta para o estoque viral e pressione o modelo de enchimento para encher a micropipeta de vidro com ~1 μL de estoque viral.
      OBS: Para evitar o ressecamento, coloque a ponta da micropipeta preenchida em soro fisiológico estéril (PBS) sempre que houver pausa no procedimento.
    9. Abaixe a micropipeta de vidro preenchida, conectada a um injetor automático, na região alvo do lúmen da lente embrionária com o auxílio de um microscópio dissecante.
    10. Ajuste a fonte de luz para garantir uma visualização clara do contorno da vesícula da lente.
      NOTA: O lúmen da lente direita (virado para cima) é normalmente usado para injeção e o esquerdo (virado para baixo) é mantido intacto como um controle contralateral.
    11. Uma vez que a colocação da micropipeta está dentro do local correto dentro do lúmen do cristalino, injetar 5-40 nL do estoque viral (Figura 3C).
      NOTA: A prática é muito necessária para a colocação ideal da injeção.
    12. Aguarde ~45 s e, em seguida, remova suavemente a micropipeta de vidro.
    13. Verifique se há microinjeção bem-sucedida no lúmen da lente usando o microscópio dissecante examinando o corante Fast Green que deve permanecer no lúmen vazio da lente sem qualquer vazamento.
    14. Após o procedimento de injeção, sele a abertura da casca do ovo com fita adesiva.
    15. Retornar o embrião à incubadora umidificada a 37 °C, sem qualquer movimento de rotação, até atingir a idade embrionária desejada para a dissecção do cristalino.

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Figura 3: Preparação e esquema de microinjeção de pintinhos . (A) Abertura de um ovo de galinha. (B) Corte da membrana amniótica. (C) Microinjeção esquemática do lúmen da lente de frango. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Resultados

Após a determinação de uma(s) proteína(s) alvo(s) específica(s) e a identificação da(s) sequência(s) gênica(s) associada(s), a abordagem experimental global envolve a clonagem da(s) sequência(s) gênica(s) em um vetor retroviral RCAS(A) pela clonagem inicial em um vetor adaptador, seguida por um vetor viral. Em segundo lugar, partículas virais de alto título são preparadas usando células de embalagem para colher e concentrar os vírions. Esses dois primeiros passos principais têm sido amplamente descritos e resultados repr...

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Discussão

Este modelo experimental oferece a oportunidade de expressar a(s) proteína(s) de interesse no cristalino intacto, levando ao estudo da relevância funcional dessas proteínas na estrutura e função do cristalino. O modelo de microinjeção de pintinhos embrionários é parcialmente baseado no trabalho de Fekete et. al.6 e foi desenvolvido por Jiang et. al.8 e tem sido utilizada como meio de inserção de plasmídeos virais e agentes como agonistas, pequenos RNAs interferentes (siRNA)...

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Divulgações

Os autores declaram que a pesquisa foi conduzida na ausência de quaisquer relações comerciais ou financeiras que pudessem ser interpretadas como um potencial conflito de interesses.

Agradecimentos

Este trabalho foi apoiado pelo National Institutes of Health (NIH) Grants: RO1 EY012085 (para J.X.J) e F32DK134051 (para F.M.A), e concessão da Fundação Welch: AQ-1507 (para J.X.J.). O conteúdo é de responsabilidade exclusiva dos autores e não representa necessariamente a opinião oficial do National Institutes of Health. As figuras foram parcialmente criadas com Biorender.com.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
0,22 µ m FiltroCorning431118Para remover detritos celulares do meio
35 mm x 10 mm Placa de culturaFisherScientific50-202-030Para uso durante a microinjeção
CentrífugaFisherbrand13-100-676Solução giratória
ConstruçõesGENEWIZ-Para geração de construções
Microscópio de dissecaçãoAmScopeSM-4TZ-144AVisualização de lente para
microinjeção de primers de PCR de DNATecnologias de DNAintegradas-Geração de primers:

Loop intracelular (IL)-deletado Cx50 (resíduos 1– 97 e 149– 400), bem como o vetor Cla12NCO foram obtidos com o seguinte par de primers: sense, CTCCTGAGAACCTACATCCT; antisense, CACCGCATGCCCAAAGTACAC

ILs de Cx43 (resíduos 98– 150) e Cx46 (resíduos 98; 166) eram  obtidos com os seguintes pares de primers: sense, TACGTGATGAGGAAAGAAGAG; antisense, TCCTCCACGCATCTTTACCTTTTG; sentido, CACATTGTACGCATGGAAGAG; antisense, AGCACCTCCC AT ACGGATTC, respectivamente

O modelo de construto Cla12NCO-Cx43 foi obtido com o seguinte par de primers: sense, CTGCTTCGTACTTACATCATC; antisense, GAACAC GTGCGCCAGGTAC

ILs de Cx50 (resíduos 98– 148) ou Cx46 (resíduos 98– 166) foram clonados usando as construções Cla12NCO-Cx50 e Cla12NCO-Cx46 como modelos com o seguinte par de primers: sense, CACCATGTCCGCATGGAGGAGA; antisense, GGTCCCC TC CAGGCGAAAC; sentido, CACATTGTACGCATGGAAGAG; antisense, AGCACCTCCCATACGGATTC, respectivamente
Drummond Nanoject II Injetor Automático de NanolitrosDrummond Scientific3-000-204Pipeta de Microinjeção
Luzes Gooseneck Duplas Iluminador de MicroscópioAmScopeLED-50WYIluminação para visualização
Dulbecco' s Modified Eagle Medium (DMEM)InvitrogenPara
Porta-Ovos de Cultura de Células-Anéis de isopor caseiros com 2 polegadas de diâmetro e meia polegada de altura
Incubadora de OvosGQF Manufacturing Company Inc.1502Para incubação de ovos fertilizados
Fast GreenFisher científicoF99-10Para visualização de injeção de estoque viral
Ovos de galinha leghorn brancos fertilizadosTexas A& M UniversityN/AModelo animal de escolha para microinjeção (https://posc.tamu.edu/fertile-egg-orders/)
Soro Fetal Bovino (FBS)Hyclone LaboratoriesPara cultura de células
IgG anti-camundongo conjugada com fluoresceína JacksonImmunoResearch115-095-003Para fórceps anti-FLAG  1:500
FisherScientific22-327379Para mover coisas e isolamento
Capilares de vidroSutter InstrumentsB100-75-10Micropipeta de vidro para microinjecção (O.D. 1,0 mm, I.D. 0,75 mm, 10 cm de comprimento)
LipofectaminaInvitrogenL3000001Para transfecção
Extrator de micropipeta vertical manualSutter InstrumentsP-30Para obter micropipeta de vidro do tamanho correcto
Tubos demicrocentrífugaFisherScientific02-682-004Solução de dissolução
MicroscópioKeyenceBZ-X710Para coloração de imagem
ParafilmFisherScientific03-448-254Solução de colocação
Penicilina / EstreptomicinaInvitrogenPara cultura de células
Pico-InjetorHarvard ApparatusPLI-100Para fornecer pequenos volumes de líquido com precisão através de micropipetas, aplicando uma pressão regulada por um período de tempo definido digitalmente
anti-pintinho AQP0Auto-gerado-JiangJX, White TW, Goodenough DA, Paul DL. Clonagem molecular e caracterização funcional da fibra do cristalino de pintinho conexina 45.6. Célula Mol Biol. Março de 1994; 5(3):363-73. DOI: 10.1091/MBC.5.3.363.
anticorpo anti-FLAG para coelhoRockland Immunichemicals600-401-383Para coloração FLAG
IgG anti-coelho conjugado com rodaminaJackson ImmunoResearch111-295-003Para almofada de fixação de esponja anti-AQP0  1:500
Sutter InstrumentsBX10Para armazenamento de micropipeta de vidro
coelho

Referências

  1. Li, Z., Gu, S., Quan, Y., Varadaraj, K., Jiang, J. X. Development of a potent embryonic chick lens model for studying congenital cataracts in vivo. Communications Biology. 4 (1), 325(2021).
  2. Chen, Y., et al. γ-Crystallins of the chicken lens: remnants of an ancient vertebrate gene family in birds. The FEBS Journal. 283 (8), 1516-1530 (2016).
  3. Coulombre, A. J., Coulombre, J. L. Lens development. I. Role of the lens in eye growth. Journal of Experimental Zoology. 156 (1), 39-47 (1964).
  4. McKeehan, M. S. Induction of portions of the chick lens without contact with the optic cup. The Anatomical Record. 132 (3), 297-305 (1958).
  5. Kothlow, S., Schenk-Weibhauser, K., Ratcliffe, M. J., Kaspers, B. Prolonged effect of BAFF on chicken B cell development revealed by RCAS retroviral gene transfer in vivo. Molecular immunology. 47 (7-8), 1619-1628 (2010).
  6. Fekete, D. M., Cepko, C. L. Replication-competent retroviral vectors encoding alkaline phosphatase reveal spatial restriction of viral gene expression/transduction in the chick embryo. Molecular and Cellular Biology. 13 (4), 2604-2613 (1993).
  7. Jiang, J. X. Use of retroviruses to express connexins. Methods in Molecular Biology. , 159-174 (2001).
  8. Jiang, J. X., Goodenough, D. A. Retroviral expression of connexins in embryonic chick lens. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 39 (3), 537-543 (1998).
  9. Shestopalov, V. I., Bassnett, S. Expression of autofluorescent proteins reveals a novel protein permeable pathway between cells in the lens core. Journal of Cell Science. 113 (11), 1913-1921 (2000).
  10. Liu, J., Xu, J., Gu, S., Nicholson, B. J., Jiang, J. X. Aquaporin 0 enhances gap junction coupling via its cell adhesion function and interaction with connexin 50. Journal of Cell Science. 124 (2), 198-206 (2011).
  11. Li, Z., et al. The second extracellular domain of connexin 50 is important for in cell adhesion, lens differentiation, and adhesion molecule expression. Journal of Biological Chemistry. 299 (3), 102965(2023).
  12. Shestopalov, V. I., Bassnett, S. Exogenous gene expression and protein targeting in lens fiber cells. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 40 (7), 1435-1443 (1999).
  13. Shestopalov, V. I., Bassnett, S. Three-dimensional organization of primary lens fiber cells. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 41 (3), 859-863 (2000).
  14. Hughes, S. H., Greenhouse, J. J., Petropoulos, C. J., Sutrave, P. Adaptor plasmids simplify the insertion of foreign DNA into helper-independent retroviral vectors. Journal of Virology. 61 (10), 3004-3012 (1987).
  15. Yan, R. T., Wang, S. Z. Production of high-titer RCAS retrovirus. Methods in Molecular Biology. 884, 193-199 (2012).
  16. Kingston, R. E. Introduction of DNA into mammalian cells. Current Protocols in Molecular Biology. 64 (1), 1-95 (2003).
  17. Li, Y., et al. Studying macrophage activation in immune-privileged lens through CSF-1 protein intravitreal injection in mouse model. STAR Protocols. 3 (1), 101060(2022).
  18. Hamburger, V., Hamilton, H. L. A series of normal stages in the development of the chick embryo. Developmental Dynamics. 195 (4), 231-272 (1992).
  19. Hallagan, J. B., Allen, D. C., Borzelleca, J. F. The safety and regulatory status of food, drug and cosmetics colour additives exempt from certification. Food and Chemical Toxicology. 33 (6), 515-528 (1995).
  20. Okada, T. S., Eguchi, G., Takeichi, M. The expression of differentiation by chicken lens epithelium in in vitro cell culture. Development, Growth & Differentiation. 13 (4), 323-336 (1971).
  21. Menko, A. S., Klukas, K. A., Johnson, R. G. Chicken embryo lens cultures mimic differentiation in the lens. Developmental Biology. 103 (1), 129-141 (1984).
  22. Parreno, J., et al. Methodologies to unlock the molecular expression and cellular structure of ocular lens epithelial cells. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 10, 983178(2022).
  23. Edwards, A., Gupta, J. D., Harley, J. D. Photomicrographic evaluation of drug-induced cataracts in cultured embryonic chick lens. Experimental Eye Research. 15 (4), 495-498 (1973).
  24. Musil, L. S. Primary cultures of embryonic chick lens cells as a model system to study lens gap junctions and fiber cell differentiation. Journal of Membrane Biology. 245 (7), 357-368 (2012).
  25. West-Mays, J. A., Pino, G., Lovicu, F. J. Development and use of the lens epithelial explant system to study lens differentiation and cataractogenesis. Progress in Retinal and Eye Research. 29 (2), 135-143 (2010).
  26. Upreti, A., et al. Lens epithelial explants treated with vitreous humor undergo alterations in chromatin landscape with concurrent activation of genes associated with fiber cell differentiation and innate immune response. Cells. 12 (3), 501(2023).
  27. Walker, J. L., Wolff, I. M., Zhang, L., Menko, A. S. Activation of SRC kinases signals induction of posterior capsule opacification. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 48 (5), 2214-2223 (2007).
  28. Briskin, M. J., et al. Heritable retroviral transgenes are highly expressed in chickens. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 88 (5), 1736-1740 (1991).
  29. Hughes, S. H. The RCAS vector system. Folia Biologica. 50 (3-4), 107-119 (2004).

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