Comparação de Dois Métodos Representativos para Diferenciação de Células-Tronco Pluripotentes Induzidas por Humanos em Células Estromais Mesenquimais

Summary

Este protocolo descreve e compara dois métodos representativos para diferenciar hiPSCs em células estromais mesenquimais (CTMs). O método da monocamada é caracterizado por menor custo, operação mais simples e diferenciação osteogênica mais fácil. O método dos corpos embrionários (BEs) é caracterizado por menor consumo de tempo.

Abstract

As células estromais mesenquimais (CTMs) são células-tronco pluripotentes adultas que têm sido amplamente utilizadas na medicina regenerativa. Como as CTMs derivadas de tecidos somáticos são restritas por doação limitada, variações de qualidade e biossegurança, nos últimos 10 anos houve um grande aumento nos esforços para gerar CTMs a partir de células-tronco pluripotentes induzidas por humanos (hiPSCs). Esforços passados e recentes na diferenciação de hiPSCs em CTMs têm se centrado em torno de duas metodologias de cultura: (1) a formação de corpos embrionários (BEs) e (2) o uso de cultura de monocamadas. Este protocolo descreve esses dois métodos representativos na derivação de CTM de hiPSCs. Cada método apresenta suas vantagens e desvantagens, incluindo tempo, custo, capacidade de proliferação celular, expressão de marcadores de CTM e sua capacidade de diferenciação in vitro. Esse protocolo demonstra que ambos os métodos podem derivar CTMs maduras e funcionais de hiPSCs. O método monocamada é caracterizado por menor custo, operação mais simples e diferenciação osteogênica mais fácil, enquanto o método EB é caracterizado por menor consumo de tempo.

Introduction

As células estromais mesenquimais (CTMs) são células-tronco pluripotentes adultas derivadas do mesoderma¹. As CTMs estão presentes em quase todos os tecidos conjuntivos². Desde que as CTMs foram descobertas na década de 1970 e isoladas com sucesso da medula óssea em 1987 por Friedenstein et al.3,4,5, uma variedade de tecidos somáticos humanos (incluindo fetais e adultos) tem sido usada para isolar CTMs, como osso, cartilagem, tendão, músculo, tecido adiposo e estroma de suporte hematopoético 1,....

Protocol

1. Manutenção de hiPSCs

1. Descongelamento do hiPSC
   1. Retire as células do nitrogênio líquido e descongele rapidamente as células em banho-maria a 37 °C. Transferir as células de descongelamento para um tubo de 15 mL preparado com 3 mL de meio de manutenção iPSC (Tabela de Materiais). Misture suavemente o meio.
   2. Centrifugar a 300 x g por 5 min. Remova o sobrenadante e ressuspenda suavemente as células em 1 mL de meio de manutenção iPSC com 10 μM Y-27632 (pipetar as células para cima e para baixo 2-3 vezes).
   3. Transferir a suspensão de células para uma placa de cultura de tecidos de 6 poços reves....

Results

Seguindo o protocolo (Figura 1A), as hiPSCs foram diferenciadas em CTMs pelos métodos de formação de EB e cultura de monocamada. Durante a diferenciação, as células apresentaram diferentes morfologias representativas (Figura 1B,C).

Como mostrado na Figura 1B, as colônias de hiPSCs exibem morfologia compacta típica antes da diferenciação, com uma borda clara composta por células bem compac.......

Discussion

Nesse protocolo, foram examinados dois métodos representativos de diferenciação das hiPSCs em CTMs20,21,22,23,24,25,26,27,28,30. Ambos os métodos foram capazes de derivar CTMs a partir de.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Kit de coloração vermelha de alizarina	Beyotime  Biotecnologia	C0148S
Anti-humano-CD105 (PE)	Biolegend	323206
Anti-humano-CD34 (FITC)	Biolegend	343503
Anti-humano-CD45 (APC)	Biolegend	304011
Anti-humano-CD73( APC)	Biolegend	344006
Anti-humano-CD90 (FITC)	Biolegend	328108
Ácido ascórbico	Solarbio	A8100
BMP-6	Novoproteína	C012
Agitador de nível de dióxido de carbono	Crystal	CO-06UC6
Contas de compensação	BioLegend	424601
CryoStor CS10	Tecnologia STEMCELL	07959
Dexametasona	Beyotime  Biotecnologia	ST1254
DMEM/F12  meio	Servicebio	G4610
Soro fetal bovino	HAKATA	HS-FBS-500
FGF2	Stemcell	78003.1
Gelatina	Sigma-Aldrich	G2500-100G
GlutaMAX	Gibco	35050061
controle de isotipo humano IgG1 APC	BioLegend	403505
controle do isotipo IgG1 humano FITC	BioLegend	403507
controle do isotipo IgG1 humano PE	BioLegend	403503
TGF-&beta humano; 1	Célula-tronco	78067
TruStain Humano FcX	BioLegend	422301
IBMX	Beyotime  Biotecnologia	ST1398
Indometacina	Solarbio	SI9020
Insulina	Beyotime  Biotecnologia	P3376
iPSC meio de manutenção	Tecnologia STEMCELL	85850
ITS Suplemento de Mídia	Beyotime  Biotecnologia	C0341-10mL
Matrigel, fator de crescimento reduzido	BD Corning	354230
Kit de coloração Oli Red O	Beyotime  Biotecnologia	C0158S
Proline	Solarbio	P0011
Pirovato de sódio	ThermoFisher	11360-070
TGFβ 3	Novoprotein	CJ44
Kit de coloração azul de toluidina	Solarbio	G2543
Enzima TrypLE Express(1x)	Placa	de
	Costar	3471
Versene	Gibco	15040-66
Y-27632	Stemcell	72304
α-MEM	Hyclone	SH30265
β-glicerofosfato	Solarbio	G8100