Comparação de Dois Métodos Representativos para Diferenciação de Células-Tronco Pluripotentes Induzidas por Humanos em Células Estromais Mesenquimais

As células estromais mesenquimais (CTMs) são células-tronco pluripotentes adultas derivadas do mesoderma¹. As CTMs estão presentes em quase todos os tecidos conjuntivos². Desde que as CTMs foram descobertas na década de 1970 e isoladas com sucesso da medula óssea em 1987 por Friedenstein et al.3,4,5, uma variedade de tecidos somáticos humanos (incluindo fetais e adultos) tem sido usada para isolar CTMs, como osso, cartilagem, tendão, músculo, tecido adiposo e estroma de suporte hematopoético 1,2,6,7 . As CTMs demonstram alta capacidade proliferativa e plasticidade para se diferenciarem em muitas linhagens celulares somáticas, podendo migrar para tecidos lesados e inflamados ^2,8,9. Essas propriedades fazem das CTMs um potencial candidato para a medicina regenerativa¹⁰. No entanto, as CTMs derivadas de tecidos somáticos (CTMs-st) são limitadas por doação limitada, capacidade proliferativa celular limitada, variações de qualidade e preocupação com a biossegurança para possível transmissão de patógenos, se houver, a partir dos doadores^11,12.

As células-tronco pluripotentes induzidas humanas (hiPSCs) são derivadas da reprogramação de células adultas com fatores de transcrição (Oct4, Sox2, Klf4 e c-Myc), que têm funções semelhantes às células-tronco embrionárias^13,14. Elas podem se auto-renovar e possuem o potencial de se diferenciar em qualquer tipo de células somáticas, incluindo as CTMs. Comparadas às CTMs-st, as CTMs-iPSC têm a vantagem de fornecimento ilimitado, menor custo, maior pureza, conveniência no controle de qualidade, facilidade de produção em escala e modificação gênica 15,16,17.

Devido a essas vantagens das CTMs-iPSC, uma variedade de métodos que conduzem as CTM a partir de iPSC têm sido relatadas. Esses métodos de diferenciação têm sido centrados em torno de duas metodologias de cultura: (1) a formação de corpos embrionários (BEs) e (2) o uso de culturas de monocamadas 11,18,19,20. Neste trabalho, caracterizou-se uma abordagem representativa para cada uma das duas metodologias. Além disso, comparações entre duas abordagens representativas baseadas em tempo, custo, capacidade proliferativa, expressão de biomarcadores de CTM e capacidade de diferenciação in vitro também foram acessadas.

1. Manutenção de hiPSCs

1. Descongelamento do hiPSC
   1. Retire as células do nitrogênio líquido e descongele rapidamente as células em banho-maria a 37 °C. Transferir as células de descongelamento para um tubo de 15 mL preparado com 3 mL de meio de manutenção iPSC (Tabela de Materiais). Misture suavemente o meio.
   2. Centrifugar a 300 x g por 5 min. Remova o sobrenadante e ressuspenda suavemente as células em 1 mL de meio de manutenção iPSC com 10 μM Y-27632 (pipetar as células para cima e para baixo 2-3 vezes).
   3. Transferir a suspensão de células para uma placa de cultura de tecidos de 6 poços revestida com gel de matriz extracelular com fator de crescimento reduzido (TFG) (1:100) e 2 mL de meio de manutenção iPSC com 10 μM Y-27632 adicionados antecipadamente (cerca de 4 x 10⁴ células/cm²).
   4. Cultivar as células por 5-6 dias (80%-90% de confluência) a 37 °C, 5% CO₂ com troca de meios de manutenção iPSC todos os dias.
2. Passagem de hiPSC
   1. Remova o meio de manutenção iPSC da placa de 6 poços. Lave as hiPSCs uma vez com DPBS.
   2. Adicionar 700-800 μL de solução de EDTA 0,48 mM e incubar durante 1 min à temperatura ambiente (TR) e, em seguida, remover a solução de digestão. Continue a incubar a uma temperatura de 37 °C por 3-5 min.
   3. Quando as células são digeridas em folhas (não digerem células em células únicas), adicione 1 mL de meio de manutenção iPSC com 10 μM Y-27632 para encerrar a digestão. Pipetar cuidadosamente as células para cima e para baixo 2-3 vezes.
   4. Transferir a suspensão celular para uma placa de cultura de tecido de 6 poços revestida com gel de matriz extracelular com fator de crescimento reduzido (TFG) (1:100) e 2 mL de meio de manutenção iPSC com 10 μM Y-27632 adicionados antecipadamente.
      NOTA: A razão de passagem varia de 1:6 a 1:20 (cerca de 4 x 10⁴ células/cm²), e o tamanho médio da agregação é de aproximadamente 50-200 μm.
   5. Cultivar as células até 80%-90% de confluência (5-6 dias) a 37 °C, 5% CO₂ com iPSC troca de meios de manutenção todos os dias.

2. Diferenciação de CTMs de hiPSCs via formação de EB

OBS: O método é derivado da literatura anterior21,22,23,24. Uma visão geral do método é ilustrada na Figura 1. As características do método estão resumidas na Tabela 1.

1. Preparo do médium
   1. Preparar o meio de diferenciação MSC suplementando α-MEM com 1% (v/v) de GlutaMAX, 10% (v/v) de FBS, 10 ng/mL de FGF2 e 5 ng/mL de TGFβ.
   2. Preparar o meio de manutenção MSC suplementando α-MEM com 1% (v/v) de GlutMAX, 10% (v/v) de FBS e 1 ng/mL de FGF2.
2. Preparação de hiPSCs
   1. Linhagens de hiPSCs de cultura (passagem pelo menos 2-3 vezes após o descongelamento) em meio de manutenção iPSC em uma placa de cultura de tecido de 6 poços revestida com gel de matriz extracelular (TFG) reduzido (TFG) a 37 °C, 5% CO₂ até 80%-90% de confluência.
3. Dia 0: Formação do EB
   1. Remova o meio de manutenção iPSC da placa de 6 poços. Lave as hiPSCs uma vez com DPBS.
   2. Adicionar 700-800 μL de solução de EDTA 0,48 mM e incubar por 1 min em TR, em seguida, remover a solução de digestão. Continue a incubar a uma temperatura de 37 °C por 3-5 min.
   3. Quando as células são digeridas em folhas (não digerem as células em células únicas), adicione 2 mL de meio de manutenção de iPSCs (contendo 10 μM de inibidor de rocha e 1:100 GFR- gel de matriz extracelular) para encerrar a digestão.
   4. Transfira as células para uma placa de fixação baixa de 6 poços. Semeando as células em uma proporção de 2 poços de placa de cultura de tecido para 1 poço de placa de baixa fixação. Incubar as células em um agitador (60 rpm/min) a 37 °C, 5% CO₂ por 24 h para formar EBs esféricos.
4. Dia 1-Dia 7: Diferenciação do EB
   1. Transfira os EBs para o tubo da centrífuga com uma pipeta de Pasteur (sem destruir os EBs) e deixe os EBs sedimentarem naturalmente por 5-10 min no RT. Em seguida, remova o sobrenadante.
   2. Transferir as EBs para uma placa de fixação baixa de 6 poços com 2 mL de meio de diferenciação de CTM. Cultivar os EBs no agitador a 37 °C, 5% CO₂ por 7 dias com troca de meio uma vez.
5. Dia 8-Dia 17: Inoculação EB
   1. Transfira os EBs para o tubo da centrífuga com uma pipeta Pasteur (sem destruir os EBs) e deixe os EBs sedimentarem naturalmente por 5-10 min. Em seguida, remova o sobrenadante.
   2. Transferir as EBs para uma placa de 6 poços revestida com gel de matriz extracelular TFG com 2 mL de meio de manutenção de CTM. Cultura até 90% de confluência (~10 dias) com troca regular do meio após adesão celular.
6. Dia 18 a Dia 27: maturação e expansão das CTMs
   1. Tratar a cultura derivada da EB com uma solução de dissociação a 37 °C durante 5-10 minutos (o tempo de digestão varia devido à presença de diferentes tipos celulares).
   2. Quando parte das células for digerida em células únicas, adicione 2 mL do meio de manutenção MSC para encerrar a digestão e transferir a suspensão celular para um tubo de centrífuga. Lave as células restantes não digeridas uma vez com DPBS e digerir novamente. Repita várias vezes até que todas as células sejam digeridas em células únicas. Centrifugar a suspensão celular a 250 x g durante 5 minutos e, em seguida, remover o sobrenadante.
   3. Semeando as células em uma placa de cultura revestida com gelatina (cerca de 2 x 10⁵ células/cm²). Cultura até 90% de confluência em meio de manutenção MSC com troca de meio regularmente. Designe esta geração de células como passagem 0 (P0) neste ponto.
   4. A fim de tornar as CTM puras e maduras, continue a passar as células duas vezes em uma proporção de divisão de 1:3 em aproximadamente 6 dias. A maioria das células apresenta morfologia semelhante à de fibroblastos (fusiforme).

3. Diferenciação de CTMs de hiPSCs via cultura monocamada

OBS: O método é derivado da literatura anterior25,26,27,28. Uma visão geral desse método é ilustrada na Figura 1. As características do método estão resumidas na Tabela 1.

1. Preparo do médium
   1. Preparar o meio de manutenção MSC suplementando α-MEM com 1% (v/v) de GlutMAX, 10% (v/v) de FBS e 1 ng/mL de FGF2.
2. Preparação de hiPSCs
   1. Linhagens de hiPSCs de cultura (passagem pelo menos 2-3 vezes após o descongelamento) no meio de manutenção iPSC em uma placa de cultura de tecido de 6 poços revestida com gel de matriz extracelular (TFG) reduzido (TFG) a 37 °C, 5% CO₂ até 50%-60% de confluência.
3. Dia 0 - Dia 13: Diferenciação por culturas diretas de monocamada
   1. Remova o meio de manutenção iPSC da placa de 6 poços.
   2. Adicionar diretamente 2 mL do meio de manutenção da CTM e cultura por 14 dias a 37 °C, 5% CO_2, com a troca do meio todos os dias.
4. Dia 14-Dia 35: maturação das CTMs por passagem repetida
   1. Tratar as culturas de monocamada com uma solução de dissociação a 37 °C durante 5-10 minutos (o tempo de digestão varia devido à presença de diferentes tipos celulares).
   2. Quando as células forem digeridas em células únicas, adicione 2 mL de meio de manutenção MSC para encerrar a digestão e transferir a suspensão celular para o tubo de centrífuga. Lave as células restantes não digeridas uma vez com DPBS e digerir novamente. Repita várias vezes até que todas as células sejam digeridas em células únicas. Centrifugar a suspensão celular a 250 x g durante 5 minutos e, em seguida, remover o sobrenadante.
   3. Seme as células em uma placa de cultura revestida com gelatina (cerca de 2 x 10⁵ células/cm²). Cultura até 90% de confluência em meio de manutenção MSC com troca de mídia regularmente. Designe esta geração de células como passagem 0 (P0) neste ponto.
   4. A fim de tornar as CTM puras e maduras, continue a passar as células 6 vezes em uma proporção de divisão de 1:3 em aproximadamente 18 dias. A maioria das células apresenta morfologia semelhante à de fibroblastos (fusiforme).

4. Análise de antígenos de superfície de CTMs condutoras de hiPSC por citometria de fluxo

NOTA: Semelhante aos antígenos de superfície das CTMs derivadas da medula óssea, as CTMs que conduzem hiPSCs expressam CD105, CD73 e CD90, mas não expressam CD45, CD34²⁹. Além disso, as hiPSCs podem ser usadas como células de controle negativas. A análise dos antígenos de superfície das CTMs e hiPSCs por citometria de fluxo por citometria de fluxo é mostrada na Figura 2.

1. Trate as CTMs que conduzem hiPSC com uma solução de dissociação a 37 °C durante 2-3 minutos. Tratar as hiPSCs com o reagente de dissociação EDTA 0,48 mM e incubar por 1 min no RT, removendo o reagente de dissociação. Continue a incubar a uma temperatura de 37 °C por 3-5 min.
2. Quando as células são digeridas em células únicas, adicione meio (meio de manutenção MSC para MSCs e meio de manutenção iPSC para iPSCs) para encerrar a digestão.
3. Centrifugar a suspensão da célula a 350 x g durante 5 minutos e, em seguida, remover o sobrenadante.
4. Lave as células uma vez com DPBS frio, centrifugar a 350 x g por 5 min e, em seguida, remover o sobrenadante.
5. Contar e ressuspender as células em solução fria de FBS-DPBS (v/v) a 10 x 10⁶ células/mL e distribuir 100 μL/tubo de suspensão celular (1 x 10⁶ células/tubo) em tubos de centrífuga de 1,5 mL.
6. Adicionar 5 μL de solução de bloqueio do receptor Fc humano a 100 μL de suspensão celular. Incubar por 5-10 min na RT para realizar bloqueio inespecífico.
7. Centrifugar a 350 x g durante 5 min e retirar o sobrenadante. Lave as células duas vezes com uma solução fria de FBS-DPBS (v/v) a 2%.
8. Ressuspender as células em 100 μL de solução FBS-DPBS (v/v) a 2% a frio.
9. Adicionar 5 μL (1 teste) de anti-CD34-FITC e 5 μL (1 teste) de anti-CD45-APC à célula de 100 μL
   Suspensão. Adicionar 5 μL (1 teste) de anti-CD73-APC, 5 μL (1 teste) de anti-CD90-FITC e 5 μL (1 teste) de anti-CD105-PE a outro tubo de suspensão de células de 100 μL. Adicionar 5 μL de controle de isotipo IgG1 humano FITC, controle de isotipo IgG1 humano PE e controle de isotipo IgG1 humano APC ao terceiro tubo de suspensão de células de 100 μL. Incubar por 15-20 min no gelo no escuro. Enquanto isso, prepare contas de coloração única.
10. Lave as células duas vezes com uma solução fria de FBS-DPBS (v/v) a 2%.
11. Adicionar 300 μL de solução fria de FBS-DPBS a 2% (v/v) para ressuspender as células e filtrar através de um filtro de tela de 200 malhas.
12. Analisar as amostras por citometria de fluxo. Analisar a suspensão celular corada com anticorpos de controle de isotipo e set gate. Em seguida, analise a suspensão celular corada com anticorpos-alvo.

5. Diferenciação osteogênica de CTMs que conduzem hiPSC

NOTA: As CTMs que conduzem hiPSC possuem potencial de diferenciação osteogênica (Figura 3A, B). O protocolo para diferenciação osteogênica é apresentado a seguir.

1. Preparar o meio de indução osteogênico suplementando α-MEM com FBS a 10%, dexametasona 100 nM, betaglicerofosfato 10 mM e ácido ascórbico 100 μM.
2. Seme 1 x 10⁵ CTMs em uma placa de 48 poços revestida com gelatina e cultura até atingir 60%-70% de confluentes.
3. Retire o meio e adicione 0,3 mL de meio de indução osteogênico. Cultivar as células em meio de indução osteogênica por 14 dias a 37 °C, 5% CO_2, com troca de meios a cada 3 dias.
4. Retire o meio e lave com DPBS uma vez.
5. Adicionar 0,3 mL de PFA a 4% e incubar em TR por 30 min.
6. Remova o PFA. Enxaguar as células com 0,3 mL de DPBS por 10 min na RT e repetir 3 vezes.
7. Remover o DPBS, adicionar 0,2 mL de solução corante vermelha de alizarina e incubar por 30 min em RT.
8. Remover a solução corante, enxaguar as células com 0,3 mL de DPBS por 10 min na RT e repetir 3 vezes.
9. Observe a coloração da deposição de cálcio sob um microscópio de luz.

6. Diferenciação adipogênica de CTMs que conduzem hiPSC

NOTA: As CTMs que conduzem hiPSC possuem potencial de diferenciação adipogênica (Figura 3C, D). O protocolo para diferenciação adipogênica é apresentado a seguir.

1. Preparar o meio de indução adipogênica suplementando α-MEM com FBS a 10%, dexametasona 1 μM, IBMX 1 μM, insulina 10 μg/mL e indometacina 100 μM. Preparar meio de manutenção adipogênica suplementando α-MEM com SFB a 10% e insulina a 10 μg/mL.
2. Seme 1 x 10⁵ CTMs em placa de 48 poços revestida com gelatina e cultura até que a densidade celular atinja 90%.
3. Retirar o meio e adicionar 0,3 mL de meio de indução adipogênico. Continuar a cultura das células no meio de indução adipogênica por 4 dias a 37 °C, 5% CO₂.
4. Retire o meio e adicione 0,3 mL de meio de manutenção adipogênico. Continuar a cultivar as células no meio de manutenção adipogênico por 3 dias a 37 °C, 5% CO₂.
5. Repetir os passos 6,3 e 6,4 2-3 vezes até a diferenciação e maturação dos adipócitos.
6. Retire o meio e lave com DPBS uma vez.
7. Adicionar 0,3 mL de PFA a 4% e incubar em TR por 10 min. Retire o PFA e enxágue 2 vezes com DPBS.
8. Aplique a coloração Oli Red O de acordo com as instruções do fabricante e observe as gotículas lipídicas sob um microscópio de luz.

7. Diferenciação condrogênica de CTMs que conduzem hiPSC

NOTA: As CTMs que conduzem hiPSC possuem potencial de diferenciação condrogênica (Figura 3E, F). O protocolo para diferenciação condrogênica é apresentado a seguir.

1. Preparar o meio de indução de condroblastos suplementando α-MEM com 10% de SFB, 100 nM de dexametasona, 1% de Insulina-Transferrina-Selênio (ITS), 10 μM de ácido ascórbico, 1 mM de piruvato de sódio, 50 μg/mL de prolina, 0,02 nM de fator transformador de crescimento β3 (TGFβ3) e 0,5 μg/mL de proteína morfogenética óssea 6 (BMP-6).
2. Colete 2,5 x 10⁵ MSCs que conduzem hiPSC e centrifugue as células a 150 x g por 5 minutos e, em seguida, remova o sobrenadante. Suspender as células em 1 mL de α-MEM e, em seguida, centrifugar a 150 x g por 5 min.
3. Retirar o sobrenadante e suspender as células em 0,5 mL de meio de indução condrogênico. Centrifugar as células a 150 x g durante 5 min.
4. Desparafusar diretamente a tampa e a cultura por 21 dias com troca do meio de indução condrogênico a cada 3 dias a 37 °C, 5% CO₂. Agite o tubo da centrífuga suavemente para suspender os pellets condrogênicos (sem destruir os pellets condrogênicos) todos os dias durante a diferenciação condrogênica.
5. Retire o sobrenadante e lave com 0,5 mL de PBS duas vezes.
6. Adicionar 0,3 mL de PFA a 4% e fixar por 24 h.
7. A parafina incorpora os pellets condrogênicos e, em seguida, secciona-os (3 μm). Manchar os cortes em azul de toluidina (1%) por 30 min.
8. Observe a matriz de condrócitos extracelulares sob microscópio de luz.

Seguindo o protocolo (Figura 1A), as hiPSCs foram diferenciadas em CTMs pelos métodos de formação de EB e cultura de monocamada. Durante a diferenciação, as células apresentaram diferentes morfologias representativas (Figura 1B,C).

Como mostrado na Figura 1B, as colônias de hiPSCs exibem morfologia compacta típica antes da diferenciação, com uma borda clara composta por células bem compactadas. EBs esféricas uniformes formaram-se após a dissociação e cultura das hiPSCs por 24 h no agitador. Durante o dia 1 ao dia 7 de cultura em meio de diferenciação de CTMs, a borda lisa da EB tornou-se rugosa e o volume de EB cresceu muito. Do 8º ao 17º dia, após a transferência das EBs para uma placa de 6 poços revestida com gel de matriz extracelular TFG, as EBs aderiram gradualmente à placa, e muitas células aderentes da monocamada se espalharam ao redor das EBs. Quando as células atingiram 90% de confluência no 18º dia, as células foram digeridas e semeadas em placa de cultura revestida com gelatina. No 19º dia, a célula aderiu e apresentou formato poligonal. Consecutivamente, as células foram passadas duas vezes quando estavam 90% confluentes. As CTMs derivadas amadureceram gradualmente e mostraram uma forma típica de fuso, e a colônia cresceu em um redemoinho.

Como mostrado na Figura 1C, o volume das células aumentou e se espalhou ao redor da colônia após a substituição do meio de manutenção iPSC pelo meio de manutenção MSC por 24 h. Enquanto cultivadas em meio de manutenção de CTM, as células gradualmente proliferaram e formaram células aderentes multicamadas. No 14º dia, as células foram digeridas e semeadas em placa de cultura revestida com gelatina. No 15º dia, a célula aderiu e apresentou formato poligonal. Consecutivamente, as células foram passadas 6 vezes quando eram 90% confluentes. As CTMs derivadas amadureceram gradualmente e mostraram uma forma típica de fuso, e a colônia cresceu em um redemoinho.

Os antígenos de superfície das CTMs hiPSC e das CTMs que conduzem hiPSC foram analisados por citometria de fluxo (Figura 2). Como mostrado na Figura 2C, as hiPSCs foram positivas para CD90 e negativas para CD34, CD45, CD73 e CD105. Após a diferenciação das CTMs em CTMs pelos dois métodos, as CTMs de condução foram positivas para CD90, CD73 e CD105 e negativas para CD34 e CD45 (Figura 2A,B).

A capacidade de diferenciação das CTMs que conduzem hiPSC foi investigada por diferenciação osteogênica, adipogênica e condrogênica. Como mostrado na Figura 3, ambas as CTMs que conduzem hiPSC dos dois métodos se diferenciaram em osteoblasto, adipócito e condrócitos. As CTMs do método da monocamada que conduzem a hiPSC formaram mais depósitos de cálcio do que o método da EB (Figura 3B). Os dois métodos não apresentaram diferença significativa na diferenciação adipogênica e na capacidade de diferenciação condrogênica (Figura 3D,F).

A capacidade de proliferação das CTMs que conduzem hiPSC foi examinada por cultura de passagem contínua. Como mostrado na Figura 3G, as CTMs que conduzem hiPSC de ambos os métodos podem ser passadas por mais de 20 passagens e ainda mantêm uma rápida capacidade de proliferação.

A comparação entre as duas abordagens mostrada na Tabela 1 é baseada no tempo de diferenciação, custo, capacidade de proliferação celular, expressão de marcadores MSC e sua capacidade de diferenciação in vitro.

Figura 1: Diferenciando hiPSCs em CTMs via método de formação de EB e método de cultura de monocamada. (A) Esquema mostrando a diferenciação de hiPSCs em CTMs via formação de EB e cultura de monocamada. Morfologia de representação de células em fagos chave durante a derivação de CTMs de hiPSCs via (B) formação de EB e (C) cultura de monocamadas. Barras de escala: 300 μm e 50 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2: Análise dos antígenos de superfície das CTMs que conduzem hiPSC por citometria de fluxo. Porcentagens de expressão de antígenos de superfície de CTM em CTMs que conduzem iPSC via (A) formação de EB e (B) cultura de monocamada. (C) as hiPSCs foram utilizadas como controle negativo. Marcadores negativos das CTMs: CD34, CD45; Marcadores positivos para CTMs: CD73, CD90 e CD105. marcadores negativos das hiPSCs: CD34, CD45, CD73 e CD105; Marcadores positivos para hiPSCs: CD90. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3: Diferenciação em três linhas e capacidade de proliferação de CTMs que conduzem hiPSC. (A) Coloração vermelha de alizarina dos depósitos de cálcio das CTMs que conduzem hiPSC em meio de diferenciação osteogênica por 2 semanas. Barras de escala: 300 μm. (B) Quantificação da coloração S do vermelho de alizarina pela análise ImageJ. (C) Coloração vermelho O de gotículas lipídicas de CTMs condutoras de hiPSC em meio de diferenciação adipogênica por 2 semanas. Barras de escala: 300 μm. (D) Quantificação da coloração Oli Red O por análise ImageJ. (E) Coloração com azul de toluidina da matriz extracelular de condrócitos. Barras de escala: 300 μm e 150 μm. (F) Quantificação da coloração com azul de toluidina por análise ImageJ. (G) Cálculo do tempo de duplicação da população de CTMs que conduzem hiPSC. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Tabela 1: Características dos dois métodos de diferenciação das hiPSC em CTMs.

Os autores não têm nada a revelar.