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Comparaison de deux méthodes représentatives pour la différenciation des cellules souches pluripotentes induites humaines en cellules stromales mésenchymateuses

Published: October 20, 2023 doi: 10.3791/65729
Automatic Translation
1, 2,3, 4, 2, 1,2, 2,3
1National Clinical Research Center for Child Health, The Children's Hospital, Zhejiang University School of Medicine, 2Department of Nephrology, The Children's Hospital, Zhejiang University School of Medicine, 3Zhejiang University School of Medicine, 4Liangzhu Laboratory, Zhejiang University

Summary

Ce protocole décrit et compare deux méthodes représentatives pour différencier les hiPSCs en cellules stromales mésenchymateuses (CSM). La méthode monocouche se caractérise par un coût inférieur, un fonctionnement plus simple et une différenciation ostéogénique plus facile. La méthode des corps embryoïdes (EBs) se caractérise par une consommation de temps plus faible.

Abstract

Les cellules stromales mésenchymateuses (CSM) sont des cellules souches pluripotentes adultes qui ont été largement utilisées en médecine régénérative. Étant donné que les CSM dérivées de tissus somatiques sont limitées par des dons limités, des variations de qualité et la biosécurité, les 10 dernières années ont vu une forte augmentation des efforts visant à générer des CSM à partir de cellules souches pluripotentes induites humaines (CSPhi). Les efforts passés et récents visant à différencier les hiPSC en CSM ont été centrés sur deux méthodologies de culture : (1) la formation de corps embryoïdes (EB) et (2) l’utilisation de la culture monocouche. Ce protocole décrit ces deux méthodes représentatives pour dériver les CSM à partir des hiPSC. Chaque méthode présente ses avantages et ses inconvénients, notamment le temps, le coût, la capacité de prolifération cellulaire, l’expression des marqueurs MSC et leur capacité de différenciation in vitro. Ce protocole démontre que les deux méthodes peuvent dériver des CSM matures et fonctionnelles à partir de CSPhi. La méthode monocouche se caractérise par un coût inférieur, un fonctionnement plus simple et une différenciation ostéogénique plus facile, tandis que la méthode EB se caractérise par une consommation de temps plus faible.

Introduction

Les cellules stromales mésenchymateuses (CSM) sont des cellules souches pluripotentes adultes dérivées du mésoderme1. Les CSM sont présentes dans presque tous les tissus conjonctifs2. Depuis que les CSM ont été découvertes pour la première fois dans les années 1970 et isolées avec succès de la moelle osseuse en 1987 par Friedenstein et al.3,4,5, une variété de tissus somatiques humains (y compris le fœtus et l’adulte) ont été utilisés pour isoler les CSM telles que les os, le cartilage, les tendons, les muscles, le tissu adipeux et le stroma de soutien hématopoïétique 1,2,6,7 . Les CSM présentent des capacités prolifératives et une plasticité élevées pour se différencier en de nombreuses lignées cellulaires somatiques et pourraient migrer vers les tissus lésés et enflammés 2,8,9. Ces propriétés font des CSM un candidat potentiel pour la médecine régénérative10. Cependant, les CSM dérivées de tissus somatiques (CSM-ST) sont limitées par un don limité, une capacité de prolifération cellulaire limitée, des variations de qualité et des préoccupations en matière de biosécurité liées à la transmission possible d’agents pathogènes, le cas échéant, par les donneurs11,12.

Les cellules souches pluripotentes induites humaines (hiPSC) sont dérivées de la reprogrammation de cellules adultes avec des facteurs de transcription (Oct4, Sox2, Klf4 et c-Myc), qui ont des fonctions similaires à celles des cellules souches embryonnaires13,14. Ils peuvent s’auto-renouveler et possèdent le potentiel de se différencier en n’importe quel type de cellules somatiques, y compris les CSM. Par rapport aux CSM-ST, les CSM-iPS présentent l’avantage d’un approvisionnement illimité, d’un coût inférieur, d’une pureté plus élevée, d’une commodité dans le contrôle de la qualité, d’une production à grande échelle et d’une modification génique facile 15,16,17.

En raison de ces avantages des CSM-iPS, diverses méthodes de pilotage des CSM à partir des CSPi ont été rapportées. Ces méthodes de différenciation ont été centrées autour de deux méthodologies de culture : (1) la formation de corps embryoïdes (EB) et (2) l’utilisation de cultures monocouches 11,18,19,20. Une approche représentative pour chacune des deux méthodologies a été caractérisée. De plus, des comparaisons entre deux approches représentatives basées sur le temps, le coût, la capacité de prolifération, l’expression des biomarqueurs MSC et la capacité de différenciation in vitro ont également été effectuées.

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Protocol

1. Maintenance des hiPSC

  1. Décongélation de hiPSC
    1. Retirez les cellules de l’azote liquide et décongelez-les rapidement dans un bain-marie à 37 °C. Transférer les cellules de décongélation dans un tube de 15 mL préparé avec 3 mL de milieu d’entretien iPSC (Tableau des matériaux). Mélangez délicatement le médium.
    2. Centrifuger à 300 x g pendant 5 min. Retirer le surnageant et remettre délicatement les cellules en suspension dans 1 mL de milieu d’entretien iPSC avec 10 μM Y-27632 (pipeter les cellules de haut en bas 2 à 3 fois).
    3. Transférer la suspension cellulaire dans une plaque de culture tissulaire à 6 puits enduite d’un gel de matrice extracellulaire à facteur de croissance réduit (DFG) (1 :100) et de 2 mL de milieu d’entretien iPSC avec 10 μM Y-27632 ajoutés à l’avance (environ 4 x 104 cellules/cm2).
    4. Cultivez les cellules pendant 5 à 6 jours (confluence de 80 % à 90 %) à 37 °C, 5 % de CO2 et changez de milieu d’entretien iPSC tous les jours.
  2. Passage de hiPSC
    1. Retirez le support de maintenance iPSC de la plaque à 6 puits. Lavez les hiPSC une fois avec DPBS.
    2. Ajouter 700 à 800 μL de solution EDTA à 0,48 mM et incuber pendant 1 min à température ambiante (RT), puis retirer la solution de digestion. Poursuivre l’incubation à une température de 37 °C pendant 3 à 5 min.
    3. Lorsque les cellules sont digérées en feuilles (ne pas digérer les cellules en cellules individuelles), ajouter 1 mL de milieu d’entretien iPSC avec 10 μM Y-27632 pour mettre fin à la digestion. Pipetez soigneusement les cellules de haut en bas 2 à 3 fois.
    4. Transférez la suspension cellulaire dans une plaque de culture tissulaire à 6 puits enduite d’un gel de matrice extracellulaire à facteur de croissance réduit (DFG) (1 :100) et de 2 mL de milieu d’entretien iPSC avec 10 μM Y-27632 ajoutés à l’avance.
      REMARQUE : Le rapport de passage varie de 1 :6 à 1 :20 (environ 4 x 104 cellules/cm2), et la taille moyenne de l’agrégation est d’environ 50 à 200 μm.
    5. Cultivez les cellules jusqu’à ce qu’elles atteignent une confluence de 80 à 90 % (5 à 6 jours) à 37 °C, 5 % de CO2 et que le milieu d’entretien iPSC change tous les jours.

2. Différenciation des CSM des CSPhi, via la formation d’EB

NOTE : La méthode est dérivée de la littérature antérieure 21,22,23,24. Une vue d’ensemble de la méthode est illustrée à la figure 1. Les caractéristiques de la méthode sont résumées dans le tableau 1.

  1. Préparation du médium
    1. Préparer le milieu de différenciation MSC en complétant le α-MEM avec 1 % (v/v) de GlutaMAX, 10 % (v/v) de FBS, 10 ng/mL de FGF2 et 5 ng/mL de TGFβ.
    2. Préparer le milieu d’entretien MSC en complétant le α-MEM avec 1 % (v/v) de GlutMAX, 10 % (v/v) de FBS et 1 ng/mL de FGF2.
  2. Préparation des hiPSC
    1. Cultures de lignées hiPSCs (passage au moins 2 à 3 fois après décongélation) dans un milieu d’entretien iPSC sur une plaque de culture tissulaire à 6 puits recouverte d’un gel de matrice extracellulaire à facteur de croissance réduit (DFG) (1 :100) à 37 °C, 5 % de CO2 jusqu’à une confluence de 80 % à 90 %.
  3. Jour 0 : Formation de l’EB
    1. Retirez le support de maintenance iPSC de la plaque à 6 puits. Lavez les hiPSC une fois avec DPBS.
    2. Ajouter 700 à 800 μL de solution EDTA à 0,48 mM et incuber pendant 1 min à RT, puis retirer la solution de digestion. Poursuivre l’incubation à une température de 37 °C pendant 3 à 5 min.
    3. Lorsque les cellules sont digérées en feuilles (ne pas digérer les cellules en cellules individuelles), ajouter 2 mL de milieu d’entretien des cellules iPS (contenant 10 μM d’inhibiteur de roche et 1 :100 de gel de matrice extracellulaire de GFR) pour mettre fin à la digestion.
    4. Transférez les cellules sur une plaque de fixation basse à 6 puits. Ensemencer les cellules dans un rapport de 2 puits de plaque de culture tissulaire pour 1 puits de plaque de fixation basse. Incuber les cellules dans un agitateur (60 tr/min) à 37 °C, 5% CO2 pendant 24 h pour former des EB sphériques.
  4. Jour 1-Jour 7 : Différenciation EB
    1. Transférez les EB dans le tube à centrifuger à l’aide d’une pipette Pasteur (sans détruire les EB) et laissez les EB sédimenter naturellement pendant 5 à 10 min à RT. Ensuite, retirez le surnageant.
    2. Transférez les EB sur une plaque de fixation basse à 6 puits avec 2 mL de milieu de différenciation MSC. Cultivez les EB sur l’agitateur à 37 °C, 5 % de CO2 pendant 7 jours avec un changement de milieu une fois.
  5. Jour 8-Jour 17 : Inoculation de l’EB
    1. Transférez les EB dans le tube à centrifuger à l’aide d’une pipette Pasteur (sans détruire les EB) et laissez les EB sédimenter naturellement pendant 5 à 10 minutes. Ensuite, retirez le surnageant.
    2. Transférez les EB dans une plaque à 6 puits enduite de gel de matrice extracellulaire DFG avec 2 mL de milieu d’entretien MSC. Culture jusqu’à 90% de confluence (~10 jours) avec changement régulier de milieu après l’adhésion cellulaire.
  6. Jour 18-Jour 27 : Maturation et expansion des CSM
    1. Traiter la culture dérivée de l’EB avec une solution de dissociation à 37 °C pendant 5 à 10 minutes (le temps de digestion varie en raison de la présence de différents types de cellules).
    2. Lorsqu’une partie des cellules est digérée en cellules individuelles, ajouter 2 mL de milieu d’entretien MSC pour mettre fin à la digestion et transférer la suspension cellulaire dans un tube à centrifuger. Lavez les cellules non digérées restantes une fois avec du DPBS et digérez-les à nouveau. Répétez plusieurs fois jusqu’à ce que toutes les cellules soient digérées en cellules individuelles. Centrifuger la suspension cellulaire à 250 x g pendant 5 min, puis retirer le surnageant.
    3. Semez les cellules sur une plaque de culture enrobée de gélatine (environ 2 x 105 cellules/cm2). Culture jusqu’à 90% de confluence dans un milieu d’entretien MSC avec un changement de milieu régulier. Désignez cette génération de cellules comme le passage 0 (P0) à ce stade.
    4. Afin de rendre les CSM pures et matures, continuez à faire passer les cellules deux fois dans un rapport de division de 1 :3 en environ 6 jours. La plupart des cellules présentent une morphologie semblable à celle d’un fibroblaste (fusiforme).

3. Différenciation des CSM des HIPs par culture monocouche

NOTE : La méthode est dérivée de la littérature antérieure 25,26,27,28. Une vue d’ensemble de cette méthode est illustrée à la figure 1. Les caractéristiques de la méthode sont résumées dans le tableau 1.

  1. Préparation du médium
    1. Préparez le milieu d’entretien MSC en complétant le α-MEM avec 1 % (v/v) de GlutMAX, 10 % (v/v) de FBS et 1 ng/mL de FGF2.
  2. Préparation des hiPSC
    1. Cultures de lignées hiPSCs (passage au moins 2 à 3 fois après décongélation) dans le milieu d’entretien iPSC sur une plaque de culture tissulaire à 6 puits recouverte d’un gel de matrice extracellulaire à facteur de croissance réduit (DFG) (1 :100) à 37 °C, 5 % de CO2 jusqu’à une confluence de 50 % à 60 %.
  3. Jour 0-Jour 13 : Différenciation par cultures monocouches directes
    1. Retirez le support de maintenance iPSC de la plaque à 6 puits.
    2. Ajouter directement 2 mL de milieu d’entretien MSC et de culture pendant 14 jours à 37 °C, 5 % de CO2, en changeant le milieu tous les jours.
  4. Jour 14-Jour 35 : Maturation des CSM par passage répété
    1. Traiter les cultures monocouches avec une solution de dissociation à 37 °C pendant 5 à 10 min (le temps de digestion varie en raison de la présence de différents types de cellules).
    2. Lorsque les cellules sont digérées en cellules individuelles, ajoutez 2 mL de milieu d’entretien MSC pour mettre fin à la digestion et transférer la suspension cellulaire dans le tube à centrifuger. Lavez les cellules non digérées restantes une fois avec du DPBS et digérez-les à nouveau. Répétez plusieurs fois jusqu’à ce que toutes les cellules soient digérées en cellules individuelles. Centrifuger la suspension cellulaire à 250 x g pendant 5 min, puis retirer le surnageant.
    3. Épépinez les cellules sur une boîte de culture enrobée de gélatine (environ 2 x 105 cellules/cm2). Culture jusqu’à 90 % de confluence dans le milieu d’entretien MSC avec un changement de milieu régulier. Désignez cette génération de cellules comme le passage 0 (P0) à ce stade.
    4. Afin de rendre le MSC pur et mature, continuez à faire passer les cellules 6 fois dans un rapport de division de 1 :3 en environ 18 jours. La plupart des cellules présentent une morphologie semblable à celle d’un fibroblaste (fusiforme).

4. Analyse des antigènes de surface des CSM pilotant les hiPSC par cytométrie en flux

NOTA : Semblables aux antigènes de surface des CSM dérivées de la moelle osseuse, les CSM hiPS qui pilotent les CSM expriment CD105, CD73 et CD90, mais n’expriment pas CD45, CD3429. De plus, les hiPSC peuvent être utilisées comme cellules de contrôle négatives. L’analyse des antigènes de surface des CSM et des CSPhi pilotant les hiPSC par cytométrie en flux est présentée à la figure 2.

  1. Traiter les CSM à l’origine des hiPSC avec une solution de dissociation à 37 °C pendant 2 à 3 min. Traiter les hiPSCs avec un réactif de dissociation EDTA de 0,48 mM et incuber pendant 1 min à RT, puis retirer le réactif de dissociation. Poursuivre l’incubation à une température de 37 °C pendant 3 à 5 min.
  2. Lorsque les cellules sont digérées en cellules individuelles, ajoutez un milieu (milieu d’entretien MSC aux CSM et milieu d’entretien iPSC aux CSPi) pour mettre fin à la digestion.
  3. Centrifuger la suspension cellulaire à 350 x g pendant 5 min, puis retirer le surnageant.
  4. Lavez les cellules une fois avec du DPBS froid, centrifugez à 350 x g pendant 5 min, puis retirez le surnageant.
  5. Compter et remettre en suspension les cellules dans une solution froide de FBS-DPBS (v/v) à 10 x 106 cellules/mL et distribuer 100 μL/tube de suspension cellulaire (1 x 106 cellules/tube) dans des tubes à centrifuger de 1,5 mL.
  6. Ajouter 5 μL de solution humaine bloquant les récepteurs Fc à 100 μL de suspension cellulaire. Incuber pendant 5 à 10 min à RT pour effectuer un blocage non spécifique.
  7. Centrifuger à 350 x g pendant 5 min et retirer le surnageant. Lavez les cellules deux fois avec une solution froide de FBS-DPBS (v/v) à 2 %.
  8. Remettre les cellules en suspension dans 100 μL de solution froide de FBS-DPBS (v/v) à 2 %.
  9. Ajouter 5 μL (1 test) d’anti-CD34-FITC et 5 μL (1 test) d’anti-CD45-APC à la cellule de 100 μL
    Suspension. Ajouter 5 μL (1 test) d’anti-CD73-APC, 5 μL (1 test) d’anti-CD90-FITC et 5 μL (1 test) d’anti-CD105-PE à un autre tube de suspension de cellules de 100 μL. Ajouter 5 μL de contrôle d’isotype d’IgG1 humain FITC, de PE d’isotype d’isotype d’IgG1 humain et d’APC de contrôle d’isotype d’IgG1 humain au troisième tube de suspension de cellules de 100 μL. Incuber pendant 15-20 min sur de la glace dans l’obscurité. Pendant ce temps, préparez les perles à coloration unique.
  10. Lavez les cellules deux fois avec une solution froide de FBS-DPBS (v/v) à 2 %.
  11. Ajouter 300 μL de solution froide de FBS-DPBS (v/v) à 2 % pour remettre les cellules en suspension et filtrer à l’aide d’un filtre à tamis à 200 mailles.
  12. Analyser les échantillons à l’aide de la cytométrie en flux. Analysez la suspension cellulaire colorée avec des anticorps de contrôle isotype et définissez la porte. Analysez ensuite la suspension cellulaire colorée avec des anticorps cibles.

5. Différenciation ostéogénique des CSM conduisant les hiPSC

NOTE : Les CSM à l’origine des CSPhiPS possèdent un potentiel de différenciation ostéogénique (Figure 3A, B). Le protocole de différenciation ostéogénique est donné ci-dessous.

  1. Préparer un milieu d’induction ostéogénique en complétant le α-MEM avec 10 % de FBS, 100 nM de dexaméthasone, 10 mM de bêta-glycérophosphate et 100 μM d’acide ascorbique.
  2. Semer 1 x 105 CSM dans une plaque à 48 puits enrobée de gélatine et la cultiver jusqu’à ce qu’elle soit confluente à 60 %-70 %.
  3. Retirer le milieu et ajouter 0,3 mL de milieu d’induction ostéogénique. Cultiver les cellules dans un milieu d’induction ostéogénique pendant 14 jours à 37 °C, 5% de CO2, avec changement de milieu tous les 3 jours.
  4. Retirez le liquide et lavez avec DPBS une fois.
  5. Ajouter 0,3 mL de PFA à 4 % et incuber à RT pendant 30 minutes.
  6. Retirez les PFA. Rincez les cellules avec 0,3 mL de DPBS pendant 10 min à RT et répétez 3 fois.
  7. Retirez le DPBS, ajoutez 0,2 mL de solution colorante au rouge d’alizarine et incubez pendant 30 minutes à RT.
  8. Retirez la solution de coloration, rincez les cellules avec 0,3 mL de DPBS pendant 10 min à RT et répétez 3 fois.
  9. Observer la coloration des dépôts de calcium au microscope optique.

6. Différenciation adipogénique des CSM hiPSC

NOTE : Les CSM à moteur hiPSC possèdent un potentiel de différenciation adipogénique (Figure 3C, D). Le protocole de différenciation adipogénique est donné ci-dessous.

  1. Préparer le milieu d’induction adipogénique en complétant le α-MEM avec 10 % de FBS, 1 μM de dexaméthasone, 1 μM d’IBMX, 10 μg/mL d’insuline et 100 μM d’indométacine. Préparer le milieu d’entretien adipogénique en complétant le α-MEM avec 10 % de FBS et 10 μg/mL d’insuline.
  2. Semez 1 x 105 CSM dans une plaque à 48 puits enrobée de gélatine et cultivez-la jusqu’à ce que la densité cellulaire atteigne 90 %.
  3. Retirer le milieu et ajouter 0,3 mL de milieu d’induction adipogénique. Poursuivre la culture des cellules en milieu d’induction adipogénique pendant 4 jours à 37 °C, 5% de CO2.
  4. Retirer le milieu et ajouter 0,3 mL de milieu d’entretien adipogénique. Poursuivre la culture des cellules dans le milieu d’entretien adipogénique pendant 3 jours à 37 °C, 5% de CO2.
  5. Répétez les étapes 6.3 et 6.4 2 à 3 fois jusqu’à la différenciation et la maturation des adipocytes.
  6. Retirez le liquide et lavez avec DPBS une fois.
  7. Ajouter 0,3 mL de PFA à 4 % et incuber à RT pendant 10 min. Retirez le PFA et rincez 2 fois avec du DPBS.
  8. Appliquez la coloration Oli Red O selon les instructions du fabricant et observez les gouttelettes lipidiques au microscope optique.

7. Différenciation chondrogénique des CSM hiPSC

NOTE : Les CSM pilotant les hiPSC possèdent un potentiel de différenciation chondrogénique (Figure 3E, F). Le protocole de différenciation chondrogénique est donné ci-dessous.

  1. Préparer le milieu d’induction des chondroblastes en complétant le α-MEM avec 10 % de FBS, 100 nM de dexaméthasone, 1 % d’insuline-transferrine-sélénium (ITS), 10 μM d’acide ascorbique, 1 mM de pyruvate de sodium, 50 μg/mL de proline, 0,02 nM de facteur de croissance transformant β3 (TGFβ3) et 0,5 μg/mL de protéine morphogénétique osseuse 6 (BMP-6).
  2. Prélever 2,5 x 105 CSM à moteur hiPSC et centrifuger les cellules à 150 x g pendant 5 min, puis retirer le surnageant. Suspendre les cellules dans 1 mL de α-MEM puis centrifuger à 150 x g pendant 5 min.
  3. Retirer le surnageant et suspendre les cellules dans 0,5 mL de milieu d’induction chondrogène. Centrifuger les cellules à 150 x g pendant 5 min.
  4. Dévisser directement le couvercle et la culture pendant 21 jours avec un changement de milieu d’induction chondrogénique tous les 3 jours à 37 °C, 5 % de CO2. Agitez doucement le tube de centrifugation pour suspendre les pastilles chondrogènes (sans détruire les pastilles chondrogènes) tous les jours pendant la différenciation chondrogène.
  5. Retirer le surnageant et laver deux fois avec 0,5 mL de PBS.
  6. Ajouter 0,3 mL de PFA à 4 % et fixer pendant 24 h.
  7. La paraffine incorpore les pastilles chondrogènes, puis les coupe (3 μm). Teindre les sections en bleu toluidine (1%) pendant 30 min.
  8. Observez la matrice extracellulaire des chondrocytes au microscope optique.

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Representative Results

Suivant le protocole (Figure 1A), les hiPSC ont été différenciées en CSM par les méthodes de formation d’EB et de culture monocouche. Au cours de la différenciation, les cellules ont montré différentes morphologies représentatives (Figure 1B,C).

Comme le montre la figure 1B, les colonies de hiPSCs présentent une morphologie compacte typique avant la différenciation avec une bordure claire composée de cellules serrées. Des EB sphériques uniformes se sont formées après la dissociation et la culture des hiPSC pendant 24 h sur l’agitateur. Entre le 1er et le 7e jour de culture dans le milieu de différenciation des CSM, le bord lisse de l’EB est devenu rugueux et le volume de l’EB a augmenté. Du jour 8 au jour 17, après avoir transféré les EB sur une plaque à 6 puits enduite de gel de matrice extracellulaire du GFR, les EB ont progressivement adhéré à la plaque, et de nombreuses cellules monocouches adhérentes se sont répandues autour des EB. Lorsque les cellules ont atteint 90 % de confluence au jour 18, elles ont été digérées et ensemencées sur une plaque de culture enrobée de gélatine. Au jour 19, la cellule a adhéré et a montré une forme polygonale. Consécutivement, les cellules ont été traversées deux fois alors qu’elles étaient confluentes à 90 %. Les CSM dérivées ont progressivement mûri et ont montré une forme de fuseau typique, et la colonie s’est développée dans un tourbillon.

Comme le montre la figure 1C, le volume des cellules a augmenté et s’est propagé dans la colonie après avoir remplacé le milieu d’entretien iPSC par le milieu d’entretien MSC pendant 24 h. Lors de la culture dans un milieu d’entretien MSC, les cellules ont progressivement proliféré et formé des cellules adhérentes multicouches. Le 14e jour, les cellules ont été digérées et ensemencées sur une plaque de culture recouverte de gélatine. Le 15e jour, la cellule a adhéré et a montré une forme polygonale. Consécutivement, les cellules ont été traversées 6 fois alors qu’elles étaient confluentes à 90 %. Les CSM dérivées ont progressivement mûri et ont montré une forme de fuseau typique, et la colonie s’est développée dans un tourbillon.

Les antigènes de surface des CSPhi et des CSM pilotant les CSPhi ont été analysés par cytométrie en flux (Figure 2). Comme le montre la figure 2C, les CSPhiC étaient positives pour CD90 et négatives pour CD34, CD45, CD73 et CD105. Après avoir différencié les hiPSC en CSM par les deux méthodes, les CSM de conduite étaient positives pour CD90, CD73 et CD105, et négatives pour CD34 et CD45 (Figure 2A,B).

La capacité de différenciation des CSM conduisant les hiPSC a été étudiée par différenciation ostéogène, adipogénique et chondrigène. Comme le montre la figure 3, les deux CSM pilotant les hiPSC des deux méthodes se sont différenciées en ostéoblaste, adipocyte et chondrocyte. Les CSM pilotant les hiPSC de la méthode monocouche ont formé plus de dépôts de calcium que la méthode EB (Figure 3B). Les deux méthodes n’ont pas présenté de différence significative dans la différenciation adipogénique et la capacité de différenciation chondrogénique (Figure 3D, F).

La capacité de prolifération des CSM conduisant les hiPSC a été examinée par culture de passage continu. Comme le montre la figure 3G, les CSM pilotant les hiPSC des deux méthodes peuvent être traversées pendant plus de 20 passages tout en conservant une capacité de prolifération rapide.

La comparaison entre les deux approches présentées dans le tableau 1 est basée sur le temps de différenciation, le coût, la capacité de prolifération cellulaire, l’expression des marqueurs MSC et leur capacité de différenciation in vitro.

Figure 1
Figure 1 : Différenciation des hiPSC en CSM par la méthode de formation de l’EB et la méthode de culture monocouche. (A) Schéma montrant la différenciation des hiPSCs en CSM par formation d’EB et culture monocouche. Morphologie de représentation des cellules au niveau des phages clés lors de la dérivation des CSM à partir des hiPSCs via la formation d’EB (B) et la culture de monocouches (C). Barres d’échelle : 300 μm et 50 μm. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 2
Figure 2 : Analyse des antigènes de surface des CSM pilotant les CSM hiPS par cytométrie en flux. Pourcentages d’expression des antigènes de surface des CSM dans les CSM pilotant les CSM iPS via (A) la formation d’EB et (B) la culture monocouche. (C) Les hiPSC ont été utilisés comme témoins négatifs. Marqueurs négatifs des CSM : CD34, CD45 ; Marqueurs positifs des CSM : CD73, CD90 et CD105. marqueurs négatifs des hiPSCs : CD34, CD45, CD73 et CD105 ; Marqueurs positifs des hiPSCs : CD90. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 3
Figure 3 : Différenciation à trois lignes et capacité de prolifération des CSM pilotant les hiPSC. (A) Coloration au rouge d’alizarine des dépôts calciques de CSM induisant les CSP hiPS dans un milieu de différenciation ostéogénique pendant 2 semaines. Barres d’échelle : 300 μm. (B) Quantification de la coloration au rouge d’alizarine S par analyse ImageJ. (C) Coloration O oli rouge des gouttelettes lipidiques des CSM hiPSC dans un milieu de différenciation adipogénique pendant 2 semaines. Barres d’échelle : 300 μm. (D) Quantification de la coloration Oli Red O par analyse ImageJ. (E) Coloration au bleu de toluidine de la matrice extracellulaire des chondrocytes. Barres d’échelle : 300 μm et 150 μm. (F) Quantification de la coloration au bleu de toluidine par analyse ImageJ. (G) calcul du temps de doublement de la population de CSM conduisant des CSM. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Comparaison Méthode de formation EB Méthode des cultures monocouches
Temps de différenciation 27 jours 35 jours
Coût Haut Bas
Vitesse de prolifération Rapide Rapide
Capacité de prolifération Passage de ≥20 Passage de ≥20
Expression des marqueurs MSC CD73/CD90/CD105 positif, CD34/CD45 nagatif CD73/CD90/CD105 positif, CD34/CD45 nagatif
Capacité de différenciation Différenciation adipogénique, différenciation chondrogénique et capacité de différenciation ostéogénique Différenciation adipogénique, différenciation chondrogénique et capacité de différenciation ostéogénique plus forte
Opération Compliqué Simple

Tableau 1 : Caractéristiques des deux méthodes de différenciation des hiPSC en CSM.

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Discussion

Dans ce protocole, deux méthodes représentatives de différenciation des hiPSC en CSM ont été examinées 20,21,22,23,24,25,26,27,28,30. Les deux méthodes étaient capables de dériver des CSM à partir de CSPhi. Les CSM dérivées de hiPSC ont été confirmées par la morphologie cellulaire (Figure 1), les antigènes de surface (Figure 2) et leur capacité à se différencier (Figure 3).

Les deux méthodes partageaient le même milieu de maintenance MSC, tandis que la méthode EB nécessitait également un milieu de différenciation MSC avec TGF-β et FGF2. De plus, la méthode EB nécessitait une fixation basse de plaques à 6 puits et un agitateur spécial qui peut être placé dans un incubateur à dioxyde de carbone. Par conséquent, le coût de la méthode EB était plus élevé que celui de la méthode monocouche18,20. La méthode EB semblait plus compliquée que la méthode monocouche. Cependant, le temps de différenciation de la méthode EB était plus court, ce qui a permis d’éviter de multiples passages pour enrichir les CSM.

Nous avons constaté que la tolérance aux conditions ambiantes de la méthode EB était plus forte que celle de la méthode monocouche. Les deux méthodes ont été influencées par le statut des CSPi, l’interférence humaine et l’environnement culturel11,20. Cependant, nous avons constaté que le taux de réussite de la méthode EB était beaucoup plus élevé que celui de la méthode monocouche. L’étape clé de la méthode EB était l’étape de différenciation EB du jour 1 au jour 7. Au cours des jours 1 à 7, si les EB deviennent progressivement plus petits ou cassés avec beaucoup de cellules mortes flottantes dans le milieu de culture ou forment des EB vacuolés, ces EB non qualifiés ont de la difficulté à adhérer à la plaque de gélatine et peu, voire pas du tout, de cellules adhérentes rampant hors des EB. Du jour 1 au jour 7, les EB qualifiés étaient uniformes et étaient légèrement élargis, dont les bords lisses devenaient progressivement rugueux avec des cellules saillantes. Après avoir été transférés sur la plaque de gélatine, les EB ont adhéré rapidement à la plaque et de nombreuses cellules monocouches adhérentes se sont répandues autour des EB. Si les EB sont qualifiés entre les jours 1 à 7, la différenciation ultérieure est facile à réaliser. En revanche, la méthode monocouche peut échouer à tout moment. Du jour 1 au jour 14, les cellules adhérentes peuvent tomber en plaques, indiquant un échec de la différenciation. Normalement, les cellules adhérentes prolifèrent et forment des cellules adhérentes multicouches. Après le 14e jour, la méthode monocouche échouerait toujours car peu de cellules sont attachées à la boîte. Pendant les jours 0 à 13 de la méthode monocouche, nous avons observé diverses morphologies cellulaires dans la boîte. Cependant, la morphologie cellulaire de la méthode EB aux jours 8 à 17 était homogène. Par rapport à la méthode monocouche, nous soupçonnons que la méthode EB est plus similaire au processus de développement embryonnaire et qu’il s’agit d’une méthode de différenciation programmée plus contrôlable.

Les deux méthodes peuvent être utilisées pour plus de 20 passages tout en maintenant une capacité de prolifération rapide11. Les dépôts calciques de différenciation ostéogénique dans la méthode monocouche étaient supérieurs à ceux de la méthode EB. Un sérum spécifique aux cellules souches doit être utilisé pour éviter l’effet des cytokines dans le sérum sur la différenciation. Nous avons observé que les cellules cesseraient de proliférer si la densité cellulaire était trop faible. Ainsi, après avoir atteint la confluence, les cellules doivent être passées à un rapport de division de 1 :3. Aucun antibiotique n’a été utilisé pendant la différenciation ; par conséquent, le strict respect des bonnes pratiques de laboratoire (BPL) est obligatoire pour ce dispositif expérimental.

En conclusion, il y avait des avantages et des inconvénients pour chaque méthode testée dans ce protocole. Les deux méthodes peuvent générer des MSC à partir de hiPSC, le choix est basé sur les besoins de l’utilisateur.

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Disclosures

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Acknowledgments

Nous sommes extrêmement reconnaissants à tous les membres du laboratoire Mao et Hu, passés et présents, pour les discussions intéressantes et les grandes contributions au projet. Nous sommes reconnaissants au Centre national de recherche clinique pour la santé de l’enfant pour son grand soutien. Cette étude a été financée par la Fondation nationale des sciences naturelles de Chine (U20A20351 à Jianhua Mao, 82200784 à Lidan Hu), la Fondation des sciences naturelles de la province chinoise du Zhejiang (No. LQ22C070004 à Lidan Hu).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Alizarin red staining kit Beyotime Biotechnology C0148S
Anti-human-CD105 (PE) Biolegend 323206
Anti-human-CD34 (FITC) Biolegend 343503
Anti-human-CD45 (APC) Biolegend 304011
Anti-human-CD73( APC) Biolegend 344006
Anti-human-CD90 (FITC) Biolegend 328108
Ascorbic acid Solarbio A8100
BMP-6 Novoprotein C012
Carbon dioxide level shaker Crystal CO-06UC6
Compensation Beads BioLegend 424601
CryoStor CS10 STEMCELL Technology 07959
Dexamethasone Beyotime Biotechnology ST1254
DMEM/F12  medium Servicebio G4610
Fetal bovine serum HAKATA HS-FBS-500
FGF2 Stemcell 78003.1
Gelatin Sigma-Aldrich G2500-100G
GlutaMAX Gibco 35050061
human IgG1 isotype control APC BioLegend 403505
human IgG1 isotype control FITC BioLegend 403507
human IgG1 isotype control PE BioLegend 403503
Human TGF-β1 Stemcell 78067
Human TruStain FcX  BioLegend 422301
IBMX Beyotime Biotechnology ST1398
Indomethacin Solarbio SI9020
Insulin Beyotime Biotechnology P3376
iPSC maintenance medium STEMCELL Technology 85850
ITS Media Supplement Beyotime Biotechnology C0341-10mL
Matrigel, growth factor reduced BD Corning 354230
Oli Red O staining kit Beyotime Biotechnology C0158S
Proline Solarbio P0011
Sodium pyruvate ThermoFisher 11360-070
TGFβ3 Novoprotein CJ44
Toluidine blue staining kit Solarbio G2543
TrypLE Express Enzyme(1x)  Gibco 12604013
Ultra-Low Attachment 6 Well Plate Costar 3471
Versene Gibco 15040-66
Y-27632 Stemcell 72304
α-MEM Hyclone SH30265
β-glycerophosphate Solarbio G8100

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Cellules stromales mésenchymateuses CSM Médecine régénérative Cellules souches pluripotentes induites humaines CSPhi Différenciation Méthodologies de culture Corps embryoïdes Culture monocouche Avantages Inconvénients Consommation de temps Coût Capacité de prolifération cellulaire Marqueurs CSM Capacité de différenciation in vitro CSM matures
Comparaison de deux méthodes représentatives pour la différenciation des cellules souches pluripotentes induites humaines en cellules stromales mésenchymateuses
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Wang, F., Gao, L., Fu, X., Yan, Q., Hu, L., Mao, J. Comparison of Two Representative Methods for Differentiation of Human Induced Pluripotent Stem Cells into Mesenchymal Stromal Cells. J. Vis. Exp. (200), e65729, doi:10.3791/65729 (2023).

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