Identificação, diagnóstico e classificação de tumores malignos da bainha do nervo periférico em modelos de camundongos geneticamente modificados

Summary

Desenvolvemos uma metodologia para avaliar se neoplasias do sistema nervoso em camundongos geneticamente modificados recapitulam com precisão a patologia de suas contrapartes humanas. Aqui, aplicamos essas técnicas histológicas, critérios patológicos definidos e metodologias de cultura para neurofibromas e tumores malignos da bainha de nervos periféricos que surgem no modelo de camundongos P 0-GGFβ3.

Abstract

Pacientes com a síndrome de suscetibilidade tumoral autossômica dominante neurofibromatose tipo 1 (NF1) comumente desenvolvem neurofibromas plexiformes (NPs) que posteriormente se transformam em tumores malignos altamente agressivos da bainha do nervo periférico (MPNSTs). A compreensão do processo pelo qual um PN se transforma em um MPNST seria facilitada pela disponibilidade de modelos de camundongos geneticamente modificados (GEM) que replicam com precisão a progressão PN-MPNST observada em humanos com NF1. Infelizmente, os modelos de GEM com ablação de Nf1 não recapitulam totalmente esse processo. Isso nos levou a desenvolver camundongos P 0-GGFβ3, um modelo de GEM no qual a superexpressão da neuregulina-1 mitógena de células de Schwann (NRG1) em células de Schwann resulta no desenvolvimento de PNs que progridem para se tornarem MPNSTs com alta frequência. No entanto, para determinar se a tumorigênese e a progressão neoplásica em camundongos P 0-GGFβ3 modelam com precisão os processos observados em pacientes com NF1, tivemos que primeiro provar que a patologia dos tumores da bainha do nervo periférico P_0-GGFβ3 recapitula a patologia de seus homólogos humanos.

Aqui, descrevemos as metodologias especializadas usadas para diagnosticar e graduar com precisão neoplasias do sistema nervoso periférico em modelos de GEM, usando P 0-GGFβ3 e P_0-GGFβ3; Ratos Trp53^+/- como exemplo. Descrevemos os métodos histológicos, imuno-histoquímicos e histoquímicos utilizados para diagnosticar NPs e MPNSTs, como distinguir essas neoplasias de outros tipos de tumores que mimetizam sua patologia e como graduar essas neoplasias. Discutimos o estabelecimento de culturas de passagem precoce a partir de MPNSTs GEM, como caracterizar essas culturas por imunocitoquímica e como verificar sua tumorigenicidade através do estabelecimento de aloenxertos. Coletivamente, essas técnicas caracterizam a patologia de NPs e MPNSTs que surgem em modelos de GEM e comparam criticamente a patologia desses tumores murinos com seus homólogos humanos.

Introduction

Nas últimas três décadas, vários laboratórios tentaram criar modelos de camundongos de cânceres humanos introduzindo mutações associadas ao câncer humano no genoma de camundongos ou superexpressando um produto genético que é superexpresso em cânceres humanos. Os modelos de camundongos geneticamente modificados (GEM) resultantes podem ser usados para uma variedade de propósitos, como estabelecer que a modificação genômica recém-introduzida inicia a tumorigênese, identificar outras alterações genéticas ou epigenéticas que ocorrem subsequentemente que contribuem para a progressão do tumor e definir as principais vias de sinalização que impulsionam a iniciação e a progressão do tumor. Ao contrário dos modelos de xenoenxerto ortotópico, que dependem do uso de camundongos imunodeficientes, os modelos de câncer GEM têm um sistema imunológico totalmente funcional e, portanto, modelam com mais precisão as respostas aos agentes terapêuticos candidatos. No entanto, ao usar modelos de câncer de GEM para fins como esses, é essencial que os investigadores confirmem que as observações feitas com neoplasias de GEM são relevantes para seus homólogos humanos. Essa validação deve incluir uma avaliação completa da patologia das neoplasias do GEM e determinar se as características patológicas das neoplasias do GEM recapitulam a patologia do tipo de tumor humano correspondente.

A síndrome de suscetibilidade tumoral neurofibromatose tipo 1 (NF1) é a doença genética mais comum que acomete o sistema nervoso humano, ocorrendo em aproximadamente 1 em cada 3.000-3.500 nascidos vivos1,2,3. Indivíduos acometidos por NF1 desenvolvem múltiplos tumores benignos da bainha dos nervos periféricos, conhecidos como neurofibromas, na pele (neurofibromas dérmicos) e em grandes nervos e plexos nervosos (neurofibromas plexiformes). Enquanto os neurofibromas dérmicos e plexiformes pioram a qualidade de vida do paciente por produzirem prejuízo físico, comportamental e/ou social, os neurofibromas plexiformes (NPs) são particularmente perigosos ^4,5. Isso ocorre porque os RNPT frequentemente se transformam em tumores malignos da bainha do nervo periférico (MPNSTs), que são neoplasias agressivas de células fusiformes com sobrevida excepcionalmente^baixa1,2. Em grande parte, essa baixa sobrevida deve-se à ineficácia dos regimes radioterápicos e quimioterápicos atualmente utilizados para o tratamento dos MPNSTs. No entanto, o desenvolvimento de novas terapias mais eficazes tem sido um desafio. Isso porque, apesar da frequência com que as MPNSTs ocorrem em pacientes com NF1, ainda são neoplasias raras. Como resultado, é muito difícil obter um grande número de tumores humanos para estudo; também é um desafio recrutar pacientes suficientes com MPNSTs para ensaios clínicos. Para superar essas limitações, vários modelos de GEM foram gerados com o objetivo de obter mais informações sobre as anormalidades que conduzem a patogênese do neurofibroma e a progressão do PN-MPNST e facilitar ensaios pré-clínicos com candidatos a agentes terapêuticos.

Pacientes com NF1 apresentam mutações inativadoras em uma cópia do gene NF1. A patogênese do neurofibroma é desencadeada quando uma mutação inativadora no gene NF1 funcional remanescente ocorre em uma célula da linhagem celular de Schwann. Surpreendentemente, no entanto, quando camundongos foram gerados com mutações Nf1 inativadoras da linhagem germinativa, eles não desenvolveram neurofibromas ^6,7. A demonstração subsequente de que camundongos com células de Schwann Nf1-nulas e haploinsuficiência Nf1 em todos os outros tipos celulares (Krox20-Cre;Nf1^flox/- camundongos) desenvolveram neurofibromas plexiformes sugerindo que a dosagem reduzida do gene Nf1 em tipos celulares adicionais era necessária para a patogênese do neurofibroma⁸. Mesmo assim, os neurofibromas plexiformes em Krox20-Cre; Nf1^flox/- camundongos não progrediram para se tornarem MPNSTs e, portanto, apenas parcialmente imitaram a biologia de seus homólogos humanos. A patogênese do MPNST ocorreu quando mutações Nf1 foram associadas a mutações em genes supressores de tumor adicionais, como Trp53⁹ ou Cdkn2a¹⁰, mas os MPNSTs nesses modelos GEM se desenvolveram de novo ou a partir de neoplasias neurofibromatosas atípicas de potencial biológico incerto (ANNUBPs)^11,12, em vez de neurofibromas plexiformes benignos preexistentes (ver^13,14 para excelentes revisões desses modelos, bem como de outros modelos introduzindo mutações adicionais associadas à perda de função do MPNST em genes como Suz12 e Pten¹⁵).

Esses modelos em camundongos têm sido inestimáveis para estabelecer o papel que genes como NF1, TP53 e CDKN2A desempenham na patogênese de neoplasias do sistema nervoso periférico associadas à NF1 e para ensaios pré-clínicos testando candidatos a agentes terapêuticos. No entanto, ainda temos uma compreensão incompleta do processo pelo qual os neurofibromas plexiformes progridem para se tornarem neoplasias neurofibromatosas atípicas de potencial biológico incerto (ANNUBPs¹⁶) e, em seguida, MPNSTs. Recentemente, alguns progressos foram feitos na compreensão desse processo com o recente relatório de que camundongos com exclusões em Nf1 e Arf desenvolvem ANNUBPs que progridem para se tornarem MPNSTs¹¹. No entanto, modelos de camundongos baseados em mutação Nf1 que recapitulam completamente o processo de progressão plexiforme do neurofibroma-MPNST observado em humanos ainda não existem. Além disso, não está claro se existem múltiplas vias distintas que levam ao desenvolvimento de MPNSTs. Diante disso, é possível que os GEMs descritos acima modelem apenas um subconjunto de várias vias diferentes que levam à progressão do neurofibroma-MPNST e patogênese do MPNST. Esse ponto é enfatizado pelo fato de que as MPNSTs também ocorrem esporadicamente e que algumas MPNSTs esporádicas aparentemente não apresentam mutações na^NF117,18.

Embora este último ponto tenha sido contestado pela recente sugestão de Magollon-Lorenz e col. de que pelo menos alguns MPNSTs esporádicos sem mutações na NF1 são melanomas ou um tipo diferente de^sarcoma19, recentemente relatamos um MPNST esporádico e uma linhagem celular derivada desse tumor (células 2XSB) que era NF1 selvagem-tipo²⁰. Durante a caracterização do tumor de origem e da linhagem celular 2XSB, sistematicamente descartamos possibilidades diagnósticas alternativas, incluindo melanoma e os múltiplos outros tipos de sarcoma que são rotineiramente considerados no diagnóstico diferencial de um tumor esporádico maligno de bainha de nervo^{periférico20}. Além disso, observamos que Magollon-Lorenz e col. reconheceram que seus achados nas três linhagens esporádicas de MPNST que estudaram não puderam ser generalizados para indicar que todos os tumores identificados como MPNSTs esporádicos não são MPNSTs.

Para construir um modelo de GEM no qual o neurofibroma e a patogênese do MPNST não fossem necessariamente dependentes de mutações específicas no gene supressor de tumor, geramos camundongos transgênicos nos quais a superexpressão da potente neuregulina-1 mitógena de células de Schwann (NRG1) foi impulsionada pelo promotor zero (P₀) da proteína mielina específica da célula de Schwann (camundongos P 0-GGFβ3)²¹. Demonstramos anteriormente que neurofibromas humanos, MPNSTs e linhagens celulares MPNST expressam várias isoformas de NRG1 juntamente com as tirosina quinases do receptor erbB (erbB2, erbB3 e erbB4) que medeiam a sinalização NRG1 e que esses receptores erbB são constitutivamente ativados²². Também demonstramos que os inibidores farmacológicos das quinases erbB inibem potentemente a proliferação do MPNST²², a sobrevivência²³ e a migração²⁴. De acordo com nossas observações em humanos, camundongos P 0-GGFβ3 desenvolvem neurofibromas plexiformes²⁵ que progridem para se tornarem MPNSTs em alta frequência^21,25. Demonstramos que MPNSTs P 0-GGFβ3, assim como seus homólogos humanos, comumente desenvolvem mutações de Trp53 e Cdkn2a, bem como inúmeras outras anormalidades genômicas que potencialmente contribuem para a tumorigênese25. MPNSTs que surgem em camundongos P 0-GGFβ3 não apresentam mutações Nf1 inativadoras. Entretanto, utilizando complementação genética, mostramos que NRG1 promove tumorigênese em camundongos P 0-GGFβ3 predominantemente através das mesmas cascatas de sinalização que são alteradas pela perda de Nf1 ²⁶; esta conclusão é baseada em nosso achado de que a substituição da superexpressão de NRG1 pela perda de Nf1 na presença de haploinsuficiência de Trp53 (P 0-GGFβ3;Trp53^+/- camundongos) produz animais nos quais MPNSTs se desenvolvem de novo, como é visto em cis-Nf1^+/-; Ratos Trp53^{+/- 27}.

Para obter essas e outras informações que demonstrem que camundongos P 0-GGFβ3 modelam com precisão os processos de patogênese do neurofibroma e progressão do neurofibroma-MPNST observados em humanos com NF1, desenvolvemos metodologias especializadas para o processamento de tecidos desses animais, diagnosticando com precisão seus tumores, classificando os MPNSTs surgidos nesses camundongos, estabelecendo e caracterizando P_0-GGFβ3 e P_0-GGFβ3 de passagem precoce; Culturas de Trp53^+/- MPNST e comparação crítica da patologia de P 0-GGFβ3 PNs e MPNSTs e P_0-GGFβ3; Trp53^+/- MPNSTs ao de seus homólogos humanos. Muitas dessas metodologias são generalizáveis para outros modelos de GEM de neoplasia do sistema nervoso. Além disso, várias dessas metodologias são mais amplamente aplicáveis a modelos de GEM, nos quais neoplasias surgem em outros sítios orgânicos. Consequentemente, apresentamos aqui uma descrição detalhada dessas metodologias.

Protocol

Os procedimentos aqui descritos foram aprovados pela IACUC da Medical University of South Carolina e foram realizados por pessoal devidamente treinado, de acordo com o NIH Guide for the Care and Use of Laboratory Animals e as diretrizes institucionais de cuidados com animais do MUSC.

1. Determinação da penetrância e sobrevivência tumoral em camundongos P 0-GGFβ3 e identificação de tumores nestes animais para posterior caracterização

1. Gerar a coorte de camundongos que será avaliada quanto à tumorigênese. O número de camundongos necessários depende da penetrância do fenótipo tumoral. Para compensar perdas como essas, comece com uma coorte que seja 10-15% maior do que o número final desejado de animais.
   NOTA: Determinamos a penetrância tumoral em camundongos P 0-GGFβ3 empiricamente em uma coorte inicial de 50 camundongos (seis dos quais foram perdidos por razões não relacionadas à neoplasia (por exemplo, luta)⁾²⁵.
2. Avaliar a saúde dos animais três vezes por semana e registrar os escores de condição corporal, incluindo peso, e mudanças de comportamento em cada exame. Terminar os ratinhos portadores de tumor ou moribundos (ver nota abaixo) utilizando eutanásia com dióxido de carbono seguida de luxação cervical. Registre a idade ao óbito em dias. Se os tumores forem visíveis externamente, registre as dimensões do tumor (comprimento, largura e altura).
   NOTA: É essencial que os animais não sejam autorizados a ultrapassar o tamanho máximo permitido do tumor e/ou o desfecho humano aprovado pela IACUC.
3. Usando a idade ao óbito, estabeleça uma curva de sobrevida de Kaplan-Meier para determinar a idade média ao óbito e a amplitude de sobrevida.
   NOTA: Camundongos P 0-GGFβ3 tiveram uma idade média ao morrer de 261,5 dias, com uma variação de 74-533 dias; 91% de nossa coorte tinha neurofibromas múltiplos e 71% tinham MPNSTs²¹.
4. Determinar se tumores grosseiramente visíveis estão presentes e, se estiverem, dissecá-los em condições estéreis para estabelecer se o tumor está associado a um nervo periférico e, em seguida, excisar o tumor. Em P 0-GGFβ3 e P_0-GGFβ3; Camundongos Trp53^+/- e tumores da bainha de nervos periféricos são mais comumente encontrados nos nervos trigêmeo e ciático. Mesmo que tumores grosseiramente visíveis não sejam vistos em associação com esses nervos, fixe e incorpore esses nervos conforme descrito abaixo para que possam ser examinados quanto à presença de microtumores. Microtumores tipicamente ocorrem dentro dos gânglios associados a esses nervos.
5. Cortar os tumores grosseiramente visíveis em três pedaços (Figura 1A). Use a peça 1 para histologia (cortes em parafina, imuno-histoquímica e histoquímica). Use a peça 2 para estabelecer culturas de passagem precoce. Snap-freeze peça 3 (usando nitrogênio líquido) para possíveis experimentos futuros (por exemplo, immunoblots, isolamento de RNA e DNA).
6. Fixar a peça 1 em paraformaldeído a 4% em solução salina tamponada com fosfato (PBS) durante a noite a 4 ^oC. Fixar o restante do corpo do animal por imersão em paraformaldeído a 4% durante a noite a 4 °C.

2. Inclusão em parafina de tumores grosseiramente visíveis e preparação de cortes corados com hematoxilina e eosina para avaliação diagnóstica inicial

1. Inclusão de parafina em tumores grosseiramente visíveis
   1. Depois de fixar o pedaço do tumor 1 durante a noite em paraformaldeído a 4%, enxaguar o tecido colocando-o em um volume de PBS que seja pelo menos 10x maior do que o volume do tecido por 15 min; Use o mesmo volume para todas as lavagens subsequentes. Repita mais dois enxaguamentos de PBS de 15 minutos, usando um volume fresco de PBS para cada enxágue.
   2. Transfira o pedaço tumoral de 1 para 70% de etanol. Segurar o tecido em etanol a 70% durante 24 h a 4 °C. Se desejar, armazene o tecido a longo prazo nessas condições.
      NOTA: As etapas 2.1.1 a 2.1.7 são fornecidas em benefício dos investigadores que não têm acesso a uma máquina comercial de processamento de tecidos. Se o investigador tiver acesso a um processador de tecidos, o tecido será processado através de etanol e xilenos graduados de acordo com o protocolo do instrumento programado.
   3. Transfira o pedaço do tumor de 1 a 80% de etanol por 30 min à temperatura ambiente. Repetir a incubação por mais 30 min em um volume fresco de etanol 80%.
   4. Transfira o pedaço do tumor de 1 a 95% de etanol por 75 min à temperatura ambiente. Repetir a incubação mais duas vezes, cada vez por mais 75 min em um volume fresco de etanol 95%.
   5. Transfira o pedaço do tumor de 1 para 100% de etanol e incube por 60 min à temperatura ambiente. Repetir os 60 min de incubação mais duas vezes, cada vez usando um novo volume de etanol 100%.
   6. Transfira o pedaço 1 do tumor para um solvente à base de d-limoneno e incube por 30-60 min à temperatura ambiente. Transfira a peça tumoral 1 para um volume fresco do solvente à base de d-limoneno e incube por mais 30-60 min à temperatura ambiente.
   7. Transfira a peça tumoral 1 para o solvente à base de parafina/d-limoneno 1:1 por 1 h a 60 ^oC. Descarte o solvente à base de parafina/d-limoneno 1:1 e transfira a peça tumoral de 1 ^a60 o C de parafina e incube por 20 min a 60 ^oC. Repita a incubação em um novo volume de parafina de 60 ^oC mais uma vez por 20 min. Incubar o pedaço 1 do tumor em parafina durante a noite a 60 ^oC.
   8. Despeje uma camada base de parafina em um molde de histologia de aço e deixe solidificar. Transfira o pedaço 1 do tumor para a superfície da parafina da base e, imediatamente após o posicionamento, cubra o tecido com parafina a 60 ^oC e coloque o de tecido sobre e em contato com a parafina fundida. Transfira o molde para o lado frio da estação de incorporação e deixe-o solidificar por 10-15 min.
   9. Retire o bloco de parafina com o de tecido anexado do molde. Use o de tecido anexado para prender o bloco no micrótomo durante a secção.
      NOTA: O bloco de parafina agora pode ser armazenado indefinidamente à temperatura ambiente.
2. Preparar cortes corados com hematoxilina e eosina de tumores grosseiramente visíveis.
   1. Cortar cortes de 4-5 μm de tecido tumoral usando um micrótomo e montá-los em lâminas de vidro carregadas positivamente.
   2. Para realizar a coloração de hematoxilina e eosina (H&E), desparafinize os cortes teciduais incubando as lâminas em um solvente à base de d-limoneno por 10 min à temperatura ambiente. Repetir a incubação num volume fresco de solvente à base de d-limoneno durante 10 minutos.
   3. Transfira as lâminas para etanol 100% e incube por 5 min à temperatura ambiente. Transfira as lâminas para um novo volume de etanol 100% e incube por mais 5 min à temperatura ambiente.
   4. Transfira as lâminas para etanol 95% e incube por 5 min à temperatura ambiente. Transfira as lâminas para um volume fresco de etanol 95% e incube por mais 5 min à temperatura ambiente.
   5. Transferir as lâminas para etanol 70% e incubar por 5 min à temperatura ambiente. Em seguida, transferir para etanol 50% e incubar por 5 min à temperatura ambiente.
   6. Transfira as lâminas para água destilada e incube por 5 min à temperatura ambiente.
   7. Manchar as lâminas imergindo-as em hematoxilina por 5 min à temperatura ambiente. Enxágue com água corrente da torneira por 1-2 min. Diferenciar mergulhando lâminas 2-5x em ácido clorídrico 0,5% em etanol 70%. Enxágue em banho-maria corrente por 1-2 min. Colocar as lâminas em etanol 95% com ácido acético 0,5% por 10 s.
   8. Manchar as lâminas com eosina-Y por 30 s à temperatura ambiente e, em seguida, transferir as lâminas para etanol 100% por 5 min. Limpe as amostras num solvente à base de d-limoneno durante 5 minutos.
   9. Monte as lamínulas usando um meio de montagem à base de xileno enquanto a lâmina ainda está molhada com o solvente à base de d-limoneno. Deixe o meio de montagem definir durante a noite.
      NOTA: Não utilize um meio de montagem à base de água.
3. Preparar tecidos sem tumores grosseiramente visíveis para identificar neurofibromas plexiformes e micro-MPNSTs. Embutir os tecidos em parafina, preparar cortes histológicos e corar esses cortes com hematoxilina e eosina.
   1. Remover os órgãos internos e incorporar porções representativas de cada órgão em parafina para preparar cortes corados com H&E que serão examinados para evidência microscópica de tumores (Figura 1B). Remova a cabeça, os membros toráceos, os membros posteriores e a cauda (Figura 1C). Examinar a medula espinhal e as raízes nervosas in situ em busca de evidências de tumores de raízes nervosas, descalcificar a coluna vertebral e as costelas e tecidos moles associados por imersão em paraformaldeído 0,3 M EDTA/4% (pH 8,0) por 48-72 h a 4 ^oC; em seguida, enxaguar as amostras com 1x PBS. No final da descalcificação, certifique-se de que a descalcificação está completa tentando perfurar a coluna vertebral com uma agulha. A descalcificação é bem-sucedida se a agulha penetrar facilmente no osso sem triturar.
   2. Corte a coluna vertebral descalcificada e as estruturas associadas em blocos que se encaixarão em um de tecido. Desidratar através de etanol graduado seguido de um solvente à base de d-limoneno, conforme descrito nas etapas 2.1.2-2.1.7. Incorporar em parafina e preparar secções de 4-5 μm conforme descrito nos passos 2.1.7-2.2.1. Realizar as colorações de H&E conforme descrito nos passos 2.2.2-2.2.9; Deixe o meio de montagem definir durante a noite.

3. Identificar potenciais neurofibromas plexiformes e realizar colorações especiais para confirmar diagnósticos

NOTA: Recomendamos fortemente a inclusão de um patologista humano ou veterinário experiente na avaliação de H&E e colorações especiais de cortes de tumor GEM.

1. Examine as lâminas coradas por H&E preparadas conforme descrito acima usando microscopia de campo claro para identificar possíveis tumores da bainha do nervo periférico. Uma vez que neurofibromas e MPNSTs surgem dentro de nervos periféricos, é importante determinar se tumores microscópicos estão associados a um nervo periférico. Identificar bloqueios com potenciais tumores da bainha do nervo periférico para que imunocolorações e outras colorações especiais possam ser realizadas para confirmar ou refutar diagnósticos.
2. Distinguir potenciais NPs de MPNSTs/outras neoplasias de alto grau com base nas características histológicas observadas durante o exame de campo claro de cortes corados com H&E. Os NPs humanos são neoplasias levemente hipercelulares predominantemente compostas por células com núcleos alongados, muitas vezes ondulados. Em muitas áreas, as células são frouxamente embaladas e podem ser separadas por material extracelular mixoide; PNs em camundongos P 0-GGFβ3 têm uma aparência semelhante. As mitoses normalmente não estão presentes; se forem e o tumor for moderadamente a altamente hipercelular, o tumor é um MPNST ou outro tipo de neoplasia de alto grau (veja abaixo).
3. Os NPs são compostos por uma mistura de células de Schwann neoplásicas e outros tipos de células não neoplásicas, como os mastócitos. Para confirmar a identidade de um NP, realizar imunocolorações para os marcadores de células de Schwann S100β e Sox10 e o marcador de mastócitos CD117 (c-Kit) em secções de blocos contendo potenciais NP identificados no exame de H&E (ver secção 3.4 para opções alternativas de coloração de marcadores de mastócitos). Realizar imunocolorações Ki67 para confirmar baixas taxas de proliferação.
   NOTA: A Tabela 1 lista os marcadores antigênicos utilizados para a identificação rotineira de neurofibromas plexiformes GEM (S100β, Sox10, CD117, Ki67), o diagnóstico de MPNSTs e para uma avaliação completa de outros tipos celulares presentes em neurofibromas; coramos para estes últimos antígenos apenas quando descrevemos um novo modelo de GEM. Consulte a ficha técnica do fabricante do anticorpo para obter as condições recomendadas. Observe se a bula do fabricante do anticorpo recomenda a recuperação de antígeno; Nem todos os antígenos necessitam de recuperação para serem detectáveis.
   1. Prepare seções de 4-5 μm a partir dos blocos de parafina selecionados e monte-os em lâminas carregadas positivamente. Desparafinizar as secções conforme descrito nos passos 2.2.2-2.2.6.
   2. Enxágue as seções com 1x PBS por 3-5 min.
   3. Se o fabricante do anticorpo recomendar a recuperação de antígeno, prepare o tampão citrato. Combinar 9 ml de solução de ácido cítrico (10,5 g de ácido cítrico em 500 ml de água destilada) e 41 ml de solução de citrato de sódio (14,7 g de citrato de sódio em 500 ml de água destilada).
   4. Realizar a recuperação do antígeno colocando lâminas em tampão citrato por 20 min em uma panela de arroz aquecida.
   5. Transfira as lâminas para peróxido de hidrogênio a 3%/1x PBS por 10 min para eliminar a atividade da peroxidase no tecido.
      NOTA: Tornar esta solução fresca de cada vez e não use a solução estoque de peróxido de hidrogênio se for mais velho do que 3-4 meses.
   6. Enxágue as seções em 1x PBS.
   7. Bloquear seções usando buffer de bloqueio (2% BSA, 0,1% Triton X-100 em 1x PBS) por 1 h. Enxágue as lâminas brevemente em 1x PBS.
   8. Adicionar anticorpos primários aos cortes de tecido. Preparar anticorpos primários em tampão de bloqueio diluído. Incubar lâminas por 2 h a 37 ^oC ou durante a noite a 4 ^oC.
   9. Lave as lâminas em 1x PBS por 5 min.
   10. Incubar o tecido com anticorpo secundário biotinilado por 1-2 h.
   11. Preparar a solução de diaminobenzidina (DAB) com base no protocolo do fabricante e imergir as lâminas na solução por 2-10 min. Lave as lâminas em água por 5 min.
   12. Cortes de contracoloração imergindo-os em hematoxilina por 10-15 min. Exponha à água corrente até que fique clara. Mergulhe rapidamente as lâminas em álcool e enxágue as lâminas em água.
   13. Desidratar lâminas em etanol graduado mergulhando rapidamente lâminas, 4-5x por solução, em etanol 70%, etanol 95% e, em seguida, etanol 100%. Incubar lâminas em um solvente à base de d-limoneno por 2 min. Incubar lâminas em um segundo lote de solvente à base de d-limoneno por 2 min.
   14. Monte corrediças com um meio de montagem à base de xileno.
   15. Examine as lâminas por microscopia de campo claro.
   16. Para imunofluorescência, omitir os passos 3.3.10-3.3.15. Em vez disso, incubar o tecido com anticorpo secundário espécie-específico diluído em tampão de bloqueio por 1-2 h.
   17. Enxágue as lâminas em 1x PBS por 5 min.
   18. Monte lâminas usando 1x PBS/glicerol.
   19. Examinar lâminas usando microscopia de fluorescência.
4. Método alternativo para coloração de mastócitos: coloração com azul de toluidina
   1. Preparar a solução-mãe de azul de toluidina dissolvendo 1 g de azul de toluidina O em 100 ml de etanol a 70%.
   2. Preparar uma solução de cloreto de sódio (NaCl) a 1% dissolvendo 0,5 g de NaCl em 50 ml de água destilada. Misture para dissolver. Ajuste o pH para aproximadamente 2,0-2,5 usando HCl.
      NOTA: Esta solução de NaCl deve ser renovada cada vez que as manchas são realizadas.
   3. Preparar a solução de trabalho de azul de toluidina adicionando 5 ml de solução-mãe de azul de toluidina a 45 ml da solução de NaCl a 1%. Misture bem e certifique-se de que o pH é de aproximadamente 2,3.
      NOTA: Um pH maior que 2,5 resultará em coloração com menos metacromasia. Torne esta solução fresca sempre que a coloração for realizada.
   4. Desparafinizar seções de 4-5 μm montadas em lâminas com carga positiva, conforme descrito nas etapas 2.2.2-2.2.6. Lavar seções desparafinizadas em água corrente por 2 min.
   5. Cortes de coloração em solução de trabalho de azul de toluidina por 2-3 min. Lave em água destilada por 2 min.
   6. Desidratar seções mergulhando 10x em etanol 95%. Mergulhe em lâminas de imersão em etanol 100% 10x. Mergulhe em lâminas frescas 100% etanol mais 10 vezes.
   7. Incubar lâminas em um solvente à base de d-limoneno por 2 min. Incubar lâminas em um segundo lote de solvente à base de d-limoneno por 2 min.
   8. Monte as lamínulas usando um meio de montagem à base de xileno enquanto a lâmina ainda está molhada com um solvente à base de d-limoneno.
      NOTA: Não utilize um meio de montagem à base de água.
   9. Examine as lâminas por microscopia de campo claro. Identificar mastócitos pela presença de grânulos roxos escuros em seu citoplasma. Outros tipos de células são corados de azul claro.

4. Colorações especiais para diagnosticar MPNSTs e descartar diagnósticos alternativos

1. A aparência histológica dos MPNSTs humanos é muito variável e vários tipos diferentes de tumores têm uma aparência semelhante à dos MPNSTs²⁸. Uma vez que os MPNSTs são derivados da linhagem celular de Schwann, determinar se o tumor surge de um nervo periférico ou dentro de um NP benigno existente por exame macroscópico ou exame microscópico de campo claro de cortes corados com H&E. Embora os NMPs sejam ocasionalmente encontrados não em associação com um nervo periférico ou NP (geralmente devido à separação inadvertida do nervo durante a dissecção, destruição do NP pré-existente via supercrescimento do MPNST ou porque a lesão é metastática), procure a associação do tumor com um nervo ou NP, pois o diagnóstico é menos provável se o tumor não estiver associado a um nervo ou NP.
2. Preparar secções de 4-5 μm a partir de blocos de parafina contendo potenciais MPNSTs e montá-los em lâminas com carga positiva, conforme descrito no passo 2.2.1. Desparafinizar as secções conforme descrito nos passos 2.2.2-2.2.6.
3. Realizar imunohistoquímica com o painel de anticorpos indicado na Tabela 2 conforme descrito nos passos 3.3.1-3.3.15.
4. Examinar as imunocolorações por microscopia de campo claro. Como os MPNSTs demonstram diferenciação schwanniana, procure imunorreatividade uniforme ou irregular para S100β, nestina e Sox10. Se os tumores não forem positivos para esses três marcadores, consulte a Tabela 2 para estabelecer o diagnóstico.
   NOTA: MPNSTs humanos e de camundongos podem demonstrar diferenciação divergente. Por exemplo, alguns MPNSTs humanos demonstram diferenciação rabdomiobllástica focal (essas variantes são conhecidas como tumores Triton malignos); embora essas neoplasias corem para os marcadores de Schwanniano, elas também expressam marcadores musculares como desmina, MyoD1 e miogenina. A imunorreatividade para esses últimos marcadores não deve dissuadir os pesquisadores de diagnosticar o tumor como um MPNST. Embora vários modelos de camundongos expressando condicionalmente o gene de fusão SS18-SSX tenham sido estabelecidos para modelar a patogênese do sarcoma sinovial29, até onde sabemos, modelos de sarcoma sinovial que geram espontaneamente o transcrito de fusão equivalente não são conhecidos. Consequentemente, não procuramos transcritos de fusão SS18-SSX em tumores GEM e confiamos em perfis imuno-histoquímicos.

5. Classificação dos MPNSTs

1. Determinar se a necrose tumoral, uma característica das MPNSTs grau IV da OMS, está presente. Para MPNSTs de Grau IV, procure hipercelularidade proeminente, atividade mitótica rápida (≥4 mitoses por 10 campos de alta potência (40x)) e atipias citológicas.
   1. Se a necrose não estiver presente, avaliar o tumor para determinar se hipercelularidade, atividade mitótica rápida e atipia citológica estão presentes. Se todas essas características estiverem presentes na ausência de necrose, classifique o tumor como MPNST grau III da OMS.
   2. Os tumores grau II da OMS são caracterizados por celularidade aumentada, mas em menor grau do que os MPNSTs graus III e IV da OMS. Os núcleos das células tumorais em um MPNST grau II da OMS demonstram tamanho aumentado (mais de 3x o tamanho dos núcleos de células tumorais em neurofibromas) e hipercromasia. O aumento da atividade mitótica (<4 mitoses por 10 campos de alta potência) está associado, mas não é um requisito para tumores grau II da OMS.
      NOTA: Como os tumores de alto grau geralmente progridem de graus mais baixos, regiões de baixo e alto grau podem estar presentes no mesmo MPNST. Nessa circunstância, o grau do tumor é determinado pela região de maior grau presente.
      NOTA: Há controvérsia entre os patologistas humanos sobre se o sistema de classificação da OMS descrito acima é preditivo dos resultados dos pacientes e alguns desses patologistas preferem simplesmente classificar os MPNSTs como baixo ou alto grau. Sob esse esquema, MPNSTs de alto grau têm atipia citológica proeminente, atividade mitótica rápida (>5 mitoses por 10 campos de alta potência) e hipercelularidade acentuada com ou sem necrose. Os MPNSTs de baixo grau não possuem necrose, mas mostram atividade mitótica, atipia citológica e celularidade intermediária entre um MPNST de alto grau e uma neoplasia neurofibromatosa atípica com potencial biológico desconhecido (ANNUBP). Preferimos o sistema descrito acima porque a distinção entre um ANNUBP e um MPNST de baixo grau pode ser um desafio para investigadores que não têm longa experiência com essas entidades.

6. Preparação de culturas de células P 0-GGFβ3 MPNST de passagem precoce

1. Cultura de células tumorais P 0-GGFβ3 de passagem precoce a partir de fragmento tumoral fresco 2 (passo 1.5, Figura 1A). Mantenha as condições estéreis a partir deste ponto.
   1. Dissociar o tumor cortando-o em pedaços pequenos (2-4 mm) e picando em DMEM10 (meio essencial mínimo de Dulbecco) contendo 10% de soro fetal de bezerro, 2 μmol/L de forskolina, e 10 nmol/L de neuregulina 1β (NRG1β) em placas de cultura de tecidos de 100 mm.
   2. Permitir que as células cresçam a partir dos fragmentos de tecido picados a 37 ^oC em 5% de CO₂ até que as placas sejam confluentes. Troque de mídia a cada 3-4 dias.
   3. Divida a cultura celular. Retire o meio da placa de 100 mm e lave as células com PBS; Remova e descarte o tecido picado. Remover PBS e adicionar 1 mL de tripsina a 0,25% por 2-5 min à temperatura ambiente. Para promover o descolamento celular, bata suavemente na placa e verifique se há descolamento usando um microscópio de luz; estender a incubação de tripsina conforme necessário.
   4. Neutralizar a tripsina adicionando 2 mL de DMEM10. Transfira a suspensão celular para um tubo de centrífuga e células de pellet a 500 × g por 5 min. Retire o meio e adicione 5 mL de DMEM10 fresco ao pellet.
   5. Distribuir a suspensão celular em duas a quatro placas de 100 mm contendo DMEM10. Não dividir as células durante mais de cinco passagens (passos 6.1.3 e 6.1.4) e mantê-las em DMEM sem forskolina e NRG1β. Lembre-se de congelar as células na passagem 2 para uso futuro.

7. Verificação da identidade de células MPNST de passagem precoce por imunocitoquímica

1. Coloque tampas de vidro redondas estéreis de 18 mm #1,5 nos poços de placas de cultura de tecidos estéreis de 6 poços.
   1. Coloque a solução de poli-L-lisina/laminina nos poços num volume suficiente para cobrir a lamínula. Sele a placa com filme plástico para minimizar a evaporação. Incubar a 4 °C durante a noite. Na manhã seguinte, lave as tampas 3x com PBS estéril.
      NOTA: Tentamos plaquear células MPNST de passagem precoce em lamínulas não revestidas e descobrimos que as células não aderem bem na ausência de revestimento de poli-L-lisina/laminina.
   2. Colocar 10.000 células na lamínula adicionando suavemente 2 mL da suspensão celular em meio de crescimento em cada poço contendo a lamínula. Incubar as placas durante a noite a 37 °C com 5% de CO₂ em uma incubadora de cultura de tecidos.
   3. Na manhã seguinte, lave as lamínulas por 2 x 5 min com PBS.
   4. Fixar as células com paraformaldeído a 4% em PBS por 18 min à temperatura ambiente.
   5. Enxágue as lamínulas 3 x 5 min com PBS. Se desejar, sele a placa com filme plástico e guarde-a a 4 °C neste ponto.
   6. Faça 50 mM NH₄Cl fresco em PBS. Temperar aldeídos incubando lamínulas em 50 mM NH₄Cl em PBS por 10 min à temperatura ambiente.
   7. Permeabilizar as células incubando lamínulas em Triton X-100 0,3% em PBS por 15 min à temperatura ambiente. Lave as tampas por 3 x 5 min com PBS.
   8. Bloquear a ligação inespecífica incubando lamínulas em tampão de bloqueio (1x PBS contendo 1% de albumina de soro bovino, 0,2% de leite em pó desnatado e 0,3% de Triton X-100) por 1 h à temperatura ambiente.
   9. Remova o tampão de bloqueio e adicione anticorpos primários reconhecendo os marcadores MPNST presentes no tumor de origem (tipicamente S100β, Nestin e Sox10) diluídos na diluição ideal predeterminada no tampão de bloqueio. Embrulhe a placa com filme plástico e incube a 4 °C durante a noite numa câmara umedecida.
   10. Lave 3 x 5 minutos com PBS para remover o anticorpo primário não ligado. Adicionar anticorpo secundário fluorescentemente marcado diluído em tampão de bloqueio e incubar por 1 h à temperatura ambiente. Proteger da luz.
   11. Lave 3 x 5 min com PBS. Incubar lamínulas em 1-5 μg de corante Hoechst durante 10 min. Continue a proteger da luz.
   12. Lave as tampas com PBS por 5 min. Monte lâminas usando 1:1 1x PBS/glicerol. Imagem com microscópio fluorescente.

8. Aloenxerto de células tumorais de passagem precoce para demonstrar tumorigenicidade

1. Crescer células P 0-GGFβ3 MPNST de passagem precoce em DMEM10 até 80% de confluência. Enxaguar as células uma vez com solução salina balanceada de Hanks à temperatura ambiente (HBSS). Tratar as células por 30 s a 1 min com uma solução de dissociação celular não enzimática para removê-las do substrato. Adicionar 5 mL de DMEM10 por 1 mL de um reagente de dissociação celular não enzimática.
   NOTA: A dissociação celular pode demorar muito mais tempo, até 10-20 min. Consulte o protocolo do fabricante.
   NOTA: Não cresça células até a confluência, pois isso reduzirá a eficácia do enxerto.
   1. Conte células usando um hemocitômetro. Spin cells para baixo a 5 × g por 5 min e ressuspendê-los a uma concentração de 1-2 × 10⁶ células por 100 μL de DMEM10. Mantenha as células congeladas até estarem prontas para a injeção.
   2. Anestesiar camundongos NOD-SCIDγ (NOD.Cg-Prkdc^scidIl2rg^tm1wjl/SzJ) na câmara de indução de um vaporizador de isoflurano. Coloque o animal de bruços e esterilize o local da injeção com etanol 70%. Deixe o local secar ao ar antes da injeção. Antes da injeção, permita que as células cheguem à temperatura ambiente.
   3. Injetar 1-2 x 10⁶ células por via subcutânea no flanco direito. Coloque o rato sozinho numa gaiola sem roupa de cama e deixe-o recuperar. Certifique-se de que apenas parte da gaiola esteja em uma almofada de aquecimento para evitar a hipotermia. Isso fornece uma zona para a qual o mouse pode se mover se ficar superaquecido.
      NOTA: Nós enxertamos um mínimo de três camundongos com cada cultura de passagem precoce, pois alguns enxertos podem não levar.
   4. Deixar o enxerto crescer por 15-60 dias; Avalie a saúde animal 3x por semana e registre os escores de condição corporal, incluindo peso, e mudanças de comportamento em cada exame. Terminar camundongos que atingiram o tamanho máximo permitido do enxerto ou camundongos moribundos usando eutanásia de dióxido de carbono seguida de luxação cervical. Registre a idade ao óbito em dias. À medida que os tumores se tornam visíveis externamente, registre as dimensões do tumor (comprimento, largura e altura).
      NOTA: Em nossa experiência, diferentes culturas de MPNST de passagem precoce enxertam com eficiência variável e diferem no tempo necessário para o crescimento do enxerto. Os animais não devem ser autorizados a ultrapassar o tamanho máximo admissível do tumor e/ou o parâmetro de avaliação humano aprovado pela IACUC.
2. Retirar o tumor, fixá-lo em paraformaldeído a 4%, incorporá-lo em parafina e realizar as colorações de H&E conforme descrito nas seções 2.1-2.2.9 para verificar se o aloenxerto é um tumor e não um tecido reativo. Se necessário, imunomanchar o enxerto para os marcadores que estavam presentes no tumor de origem.

Results

A Figura 2 ilustra exemplos de neoplasias grosseiramente evidentes surgindo em camundongos P 0-GGFβ3. Tumores facilmente identificáveis a olho nu podem ser vistos como massas distendendo regiões do corpo, como mostra a Figura 2A (seta). Ao determinar se a neoplasia é potencialmente um tumor da bainha do nervo periférico, é essencial estabelecer que o tumor está associado a um nervo periférico. Neste caso, a ressonância magnética (Figura 2B) demonstra que o tumor está associado ao nervo ciático (cabeça de seta); Essa associação foi confirmada após a eutanásia do camundongo e a dissecação do tumor. Deve-se notar que um tamanho grande não indica necessariamente que o tumor é maligno. Neste caso, o exame histológico do tumor (Figura 2C) demonstrou tratar-se de neurofibroma. Mais comumente, no entanto, tumores grosseiramente evidentes não são identificados até a realização da necropsia do camundongo. A Figura 2D ilustra um MPNST grande e carnoso que surgiu dentro do plexo braquial deste animal.

A Figura 3 ilustra exemplos representativos de MPNSTs e neurofibromas de camundongos P 0-GGFβ3 preparados de acordo com os procedimentos descritos na seção 1 do protocolo. A Figura 3A-J ilustra dez exemplos de MPNSTs surgindo independentemente de nossa colônia de camundongos P_0-GGFβ3. Note-se que a aparência histológica dos MPNSTs pode ser muito variável, mesmo entre os MPNSTs que surgem independentemente no mesmo animal. Essa variabilidade histológica ilustra por que rotineiramente confirmamos o diagnóstico de MPNSTs P 0-GGFβ3 com coloração imunoistoquímica. Ressaltamos também que outros tipos de tumores, aparentemente não relacionados, ocorrem esporadicamente com baixa frequência em algumas linhagens de camundongos (por exemplo, encontramos várias vezes linfomas em camundongos P 0-GGFβ3 portadores do transgene em um fundo C57BL/6J), enfatizando ainda mais a importância do uso da imunohistoquímica para confirmar o diagnóstico tumoral. Apesar da variabilidade de sua aparência histológica, todos os dez tumores ilustrados na Figura 3A-J eram imunorreativos para S100β e nestina e negativos para marcadores de outros tipos tumorais. A Figura 3K ilustra uma imagem representativa de uma coluna vertebral devidamente descalcificada e tecidos associados. Observe que a medula espinhal, as raízes nervosas, o corpo vertebral e o músculo esquelético mantêm sua relação anatômica adequada entre si. A Figura 3L é uma imagem de maior potência do corpo vertebral e da medula espinhal sobrejacente. Uma vez que este tecido é devidamente descalcificado, o osso corta facilmente sem triturar ou dobrar, e a medula óssea é facilmente identificável nos espaços medulares. Se o tecido não tivesse sido descalcificado adequadamente, ele teria pego na lâmina do micrótomo e sido arrancado da seção, causando danos significativos aos tecidos adjacentes (medula espinhal, raízes nervosas espinhais e músculo esquelético. A Figura 3M apresenta uma imagem representativa de um neurofibroma surgindo dentro de uma raiz nervosa dorsal em um camundongo P 0-GGFβ3. Observe que este tumor é menos celular do que os MPNSTs mostrados na Figura 3A-J. O diagnóstico chave para os neurofibromas é que eles são compostos por uma mistura complexa de células de Schwann neoplásicas e mastócitos não neoplásicos, macrófagos, fibroblastos e elementos semelhantes a perineurais que infiltram o nervo e espalham axônios separadamente.

A Figura 4 ilustra exemplos das colorações mais úteis para a identificação inicial de um neurofibroma plexiforme e para a distinção entre um neurofibroma plexiforme e um MPNST. A Figura 4A ilustra a imunorreatividade com S100β em um neurofibroma plexiforme P 0-GGFβ3. Note-se que a imunorreatividade à S100β só é evidente em uma subpopulação de células, o que está de acordo com o fato de que os neurofibromas são compostos por uma mistura de células de Schwann neoplásicas e outros elementos não neoplásicos (fibroblastos, mastócitos, macrófagos, células perineurais-símile, população celular imunorreativa a CD34 mal definida e vasculatura). Infelizmente, a coloração S100β irregular não distingue entre neurofibromas plexiformes e MPNSTs, pois a coloração S100β pode ser irregular em MPNSTs (a coloração H&E é útil para esse propósito; no entanto, uma vez que os MPNSTs são tipicamente mais celulares do que os neurofibromas plexiformes [ver Figura 3]). As células de Schwann neoplásicas também são imunorreativas para o filamento intermediário nestina, como demonstrado no MPNST P 0-GGFβ3 apresentado na Figura 4B. As células de Schwann neoplásicas também frequentemente demonstram imunorreatividade nuclear para o fator de transcrição Sox10, como mostrado em um MPNST na Figura 4C. Características úteis para distinguir entre neurofibromas plexiformes e MPNSTs são a presença de mastócitos e imunorreatividade proeminente para o marcador de proliferação Ki67. A Figura 4D ilustra uma coloração de Unna realizada em neurofibroma plexiforme P 0-GGFβ3 para destacar a presença de mastócitos, que são facilmente identificáveis pela proeminente coloração metacromática violeta de seus grânulos citoplasmáticos. Os mastócitos não estão presentes nos MPNSTs. Em contraste, a imunorreatividade ao Ki67 é virtualmente inexistente nos neurofibromas plexiformes, como visto no tumor P 0-GGFβ3 mostrado na Figura 4E. A marcação nuclear com Ki67 está tipicamente presente em uma fração muito alta de células tumorais, como visto no MPNST microscópico que surge no gânglio trigeminal de um camundongo P 0-GGFβ3 (Figura 4F).

A Figura 5 ilustra exemplos das colorações que realizamos para caracterizar completamente a composição celular dos neurofibromas em um modelo de GEM recém-desenvolvido. Embora as colorações mostradas nesta figura tenham sido obtidas em neurofibromas dérmicos humanos, elas são idênticas em aparência ao que vimos em tumores GEM. A imunorreatividade para CD117 (c-Kit) está presente nos mastócitos dentro dos neurofibromas e, portanto, tem uma distribuição muito semelhante à observada com as colorações de Unna (ver Figura 3A). Macrófagos também estão presentes espalhados por todos os neurofibromas, como visto com o marcador pan-macrófago Iba1 (ver Figura 5D); isso inclui subclasses de macrófagos imunorreativos para CD163 e CD86 (ver Figura 5B e Figura 5C, respectivamente). Uma fração do elemento schwanniano nos neurofibromas também demonstra imunorreatividade nuclear para Sox10. Os fibroblastos podem ser destacados por sua imunorreatividade ao TCF4. Na Figura 5G, CD31 marca os elementos vasculares dentro do neurofibroma, enquanto CD34, demonstrado na Figura 5H, marca uma enigmática população dendrítica de células que tem sido sugerida como sendo uma subpopulação de macrófagos residentes no tecido³⁰ ou uma nova população de células da bainha nervosa que não são nem células de Schwann nem fibroblastos³¹.

A Figura 6 é incluída para permitir a comparação de neurofibromas plexiformes humanos e MPNSTs com os tumores vistos em camundongos P 0-GGFβ3 e para fornecer exemplos representativos de alguns dos tipos de tumores humanos que podem ser confundidos com MPNSTs. A Figura 6A ilustra um neurofibroma plexiforme que surgiu no plexo braquial de um paciente com NF1, enquanto a Figura 6B apresenta o MPNST grau IV da OMS que surgiu dentro desse mesmo neurofibroma plexiforme. A Figura 6B mostra algumas das características de um MPNST grau IV da OMS, incluindo hipercelularidade acentuada e atipia celular, atividade mitótica rápida e necrose tumoral. Para comparação, a Figura 6C mostra um MPNST grau II da OMS que tem atipia celular significativa, mas é menos hipercelular do que o MPNST grau IV e, embora mitoses estejam presentes, demonstra menor atividade mitótica. A Figura 6D ilustra um fibrossarcoma com seu padrão característico de "espinha de peixe" de entrelaçamento de bainhas de células tumorais. No entanto, esse padrão não necessariamente distingue entre fibrossarcomas e MPNSTs, porque alguns MPNSTs terão um padrão semelhante. Além disso, a visão de maior potência apresentada na Figura 6E mostra morfologia celular semelhante à observada no MPNST grau IV da OMS apresentado na Figura 6B. A Figura 6F ilustra um leiomiossarcoma. Ao contrário da maioria dos MPNSTs, os leiomiossarcomas são imunorreativos para marcadores musculares como actina e desmina de músculo liso. No entanto, a imunorreatividade à actina de músculo liso pode ser variável de tumor para tumor, com alguns tumores demonstrando intensa imunorreatividade uniforme (Figura 6G) e outros apresentando imunorreatividade que mostra variabilidade celular dentro do tumor (Figura 6H). A imunorreatividade à desmina também pode ser irregular nos leiomiossarcomas (Figura 6I). Os melanomas são altamente variáveis em morfologia, sendo alguns tumores compostos por células poligonais (Figura 6J) e outros por células fusiformes que podem mimetizar a morfologia das células MPNST. Os melanomas podem ser distinguidos dos MPNSTs pela imunorreatividade para marcadores do melanossomo como o MART1 (Figura 6K). Entretanto, melanomas, assim como os MPNSTs, frequentemente são positivos para S100β e Sox10 (Figura 6L).

A Figura 7 ilustra as características patológicas dos MPNSTs graus II, III e IV da OMS isolados de camundongos P0-GGFβ3. A Figura 8 mostra imagens representativas de células MPNST P 0-GGFβ3 de passagem precoce em baixa (Figura 7A) e alta (Figura 7B) potência. A tumorigenicidade dessas células é demonstrada tanto pela capacidade de formar colônias quando suspensas em ágar mole (Figura 7C) quanto de formar enxertos quando aloenxertadas por via subcutânea em camundongos imunodeficientes (Figura 7D).

Figura 1: Fluxo de trabalho usado para processar o tumor e outros tecidos de camundongos P 0-GGFβ3. (A) Tumores grosseiramente visíveis são colhidos e segmentados em três porções para 1) fixação em paraformaldeído a 4% seguido de imunohistoquímica e histoquímica, 2) estabelecimento de cultura de células tumorais de passagem precoce e/ou análises genômicas, e 3) congelamento instantâneo usando nitrogênio líquido para isolamento de proteínas, DNA ou RNA. (B) Após a excisão do tumor, o corpo do camundongo é fixado em paraformaldeído a 4% e os órgãos internos são removidos. Esses órgãos são amostrados para exame histológico realizado para identificar evidências microscópicas de neoplasia e outros processos patológicos. (C) Após a remoção dos órgãos internos, as extremidades (cabeça, membros, cauda) e a pele são removidas da carcaça. A coluna vertebral, as costelas adjacentes e o músculo esquelético adjacente são descalcificados com EDTA 0,3 M/paraformaldeído a 4% (pH 8,0). Os tecidos descalcificados são então embebidos em parafina e cortes dos tecidos preparados para exame imunohistoquímico e histoquímico. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2: Imagens representativas de neurofibromas e MPNSTs grosseiramente evidentes em camundongos P 0-GGFβ3. (A) Camundongo P 0-GGFβ3 com grande tumor grosseiramente evidente no flanco direito (seta). (B) A ressonância magnética deste camundongo mostra que o tumor está conectado ao nervo ciático (cabeça de seta) e que ele cresceu através da fáscia sobrejacente para se expandir dentro do subcutâneo (seta, massa tumoral volumosa). (C) O exame microscópico desse tumor mostra que, apesar de seu grande tamanho, o tumor é um neurofibroma. (D) MPNST carnoso grande que surgiu no plexo braquial de um camundongo P 0-GGFβ3. Barra de escala = 100 μm. (C). Abreviações: MPNSTs = tumores malignos da bainha do nervo periférico; RM = ressonância magnética. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3: Imagens representativas de MPNSTs, coluna vertebral descalcificada e neurofibromas preparadas conforme descrito no protocolo seção 1. (A-J) Os MPNSTs P 0-GGFβ3 excisados e corados com H&E mostram variabilidade histológica. Todas as imagens são MPNSTs de origem independente. Apesar dessa variabilidade histológica, todos esses tumores apresentaram marcação adequada para os marcadores do MPNST indicados na Tabela 1. Barras de escala = 200 μm. (K) Imagem representativa de um corte transversal corado por H&E da coluna vertebral descalcificada. Nesta imagem são facilmente visualizadas as seguintes estruturas: medula espinhal; osso vertebral; os gânglios da raiz dorsal na raiz dorsal do nervo espinhal; e músculo esquelético paravertebral. Ampliação 4x. (L) Uma imagem de maior potência da medula espinhal e vértebra mostrada em K demonstra a aparência adequada do osso após a descalcificação com esta metodologia. Ampliação 10x. (M) Imagem representativa de um neurofibroma de raiz nervosa dorsal em um camundongo P_0-GGFβ3. Ampliação 40x. Barras de escala = 100 μm. Abreviações: MPNSTs = tumores malignos da bainha do nervo periférico; H&E = hematoxilina e eosina. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 4: Coloração diagnóstica utilizada para a identificação inicial dos neurofibromas plexiformes e sua distinção dos MPNSTs. (A) Imunocolorações para S100β em um neurofibroma plexiforme P 0-GGFβ3. Note-se que a coloração marrom intensa para este antígeno está presente apenas em um subconjunto de células deste tumor, consistente com o fato de que os neurofibromas são compostos por células de Schwann neoplásicas e vários outros tipos celulares não neoplásicos. (B) Imagem de imunofluorescência de um MPNST P 0-GGFβ3 corado para o filamento intermediário nestina (vermelho) e contracorado com bisbenzimida (azul, coloração nuclear). (C) MPNST corado pelo fator de transcrição Sox10. A imunorreatividade intensa (marrom) é evidente nos núcleos de um subconjunto de células tumorais. (D) Visão de alta potência de um neurofibroma plexiforme P 0-GGFβ3 após uma coloração de Unna. Esta coloração produz coloração metacromática (violeta) dos grânulos nos mastócitos. Os neurofibromas plexiformes podem ser distinguidos dos MPNSTs porque estes últimos não possuem mastócitos. (E,F) Imunoistoquímica Ki67 em (E) um P 0-GGFβ3 plexiforme neurofibroma e (F) um P_0-GGFβ3 MPNST. Ambos os cortes foram contracorados com hematoxilina (coloração nuclear azul), sendo a imunorreatividade ao Ki67 evidente como coloração nuclear marrom nessas colorações de imunoperoxidase. Nota-se que nenhuma coloração nuclear marrom é evidente no neurofibroma plexiforme, enquanto a maioria dos núcleos celulares tumorais é positiva no MPNST. Barras de escala = 100 μm. Abreviação: MPNST = tumor maligno da bainha do nervo periférico. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 5: Imagens representativas das imunocolorações utilizadas para identificar as subpopulações de células que compõem os neurofibromas. Essas imagens de imunofluorescência de um neurofibroma dérmico humano foram coradas para (A) CD117 (c-Kit; um marcador de mastócitos), (B) CD163 (macrófagos M2), (C) CD86 (macrófagos M1), (D) Iba1 (marcador pan-macrófagos), (E) Sox10 (marcador de células de Schwann), (F) TCF4 (marcador de fibroblastos), (G) CD31 (marcador de vasculatura) e (H) CD34 (marca uma subpopulação distinta e pouco compreendida de células em neurofibromas). Ampliação 60x, barras de escala = 200 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 6: Imagens representativas de neurofibromas plexiformes, MPNSTs e alguns outros tipos de tumores humanos que são considerados no diagnóstico diferencial de um MPNST. (A) Neurofibroma plexiforme surgindo no plexo braquial de um paciente com NF1, mostrando a baixa celularidade global e aparência benigna dessa neoplasia. Embora não seja facilmente visualizada em cortes corados com H&E, uma mistura complexa de tipos celulares está presente. Mitoses não são vistas. Ampliação: 40x. (B) Um MPNST grau IV da OMS que surgiu do neurofibroma plexiforme ilustrado em A. Observe o grau muito maior de celularidade. A seta indica uma figura mitótica, e o asterisco denota uma região de necrose tumoral na porção superior direita desse campo microscópico. Ampliação: 40x. (C) Um MPNST grau II da OMS. Este tumor tem um grau de celularidade menor do que o MPNST grau IV da OMS ilustrado em B. No entanto, há mais atipia nuclear e hipercromasia do que é evidente no neurofibroma plexiforme ilustrado em A. A seta indica uma das figuras mitóticas ocasionais que foram encontradas nesta neoplasia. Ampliação: 63x. (D) Uma visão de baixo poder de um fibrossarcoma do tipo adulto ilustrando o padrão "espinha de arenque" (as bainhas entrelaçadas de células tumorais) tipicamente visto neste tipo de tumor. Infelizmente, a arquitetura da espinha de arenque também é encontrada em alguns MPNSTs humanos e, portanto, não pode ser usada para distinguir entre fibrossarcomas e MPNSTs. Ampliação: 20x. (E) Uma visão de maior potência do fibrossarcoma ilustrada em D. Nota-se a semelhança entre a morfologia celular neste fibrossarcoma e a morfologia celular evidente no MPNST grau IV da OMS mostrado em B. Ampliação: 40x. (F) Imagem de alta potência de um leiomiossarcoma, demonstrando morfologia celular que se enquadra na faixa de variação observada em MPNSTs. Ampliação: 40x. (G) Imunocolorações para actina de músculo liso no leiomiossarcoma ilustrado em F. Nota-se que as células tumorais apresentam imunorreatividade intensa uniforme para este antígeno. Ampliação: 40x. (H) Imunocolorações para actina de músculo liso em leiomiossarcoma diferente. Nesse tumor, há maior variabilidade no grau de imunorreatividade, com algumas células corando mais intensamente que outras. Não é incomum que a imunorreatividade para um mesmo antígeno esteja uniformemente presente em um tumor e esteja presente apenas em um subconjunto de células tumorais em uma neoplasia diferente. Magnificação: 40x. (I) Imunocoloração para desmina em um terceiro leiomiossarcoma. Neste tumor, apenas um subgrupo de células tumorais é intensamente imunorreativo para este antígeno. (J) Melanoma metastático. Os melanomas são notórios por apresentarem morfologia muito variável, podendo variar de cuboidal a fusiforme; tumores com esta última morfologia são mais prováveis de serem confundidos com MPNSTs, particularmente porque tanto melanomas quanto MPNSTs podem demonstrar imunorreatividade S100β e Sox10. Ampliação: 40x. (K) Imunorreatividade para o marcador de melanoma MART1 no tumor ilustrado em J. Ampliação: 40x. (L) Imunorreatividade nuclear para o fator de transcrição Sox10 no melanoma mostrado em J. Ampliação: 40x, barras de escala = 100 μm. Abreviação: MPNST = tumor maligno da bainha do nervo periférico. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 7: Imagens representativas dos MPNSTs grau II-IV P 0-GGFβ3 da OMS. (A) Fotomicrografias de baixa e (B) alta potência de um MPNST grau II da OMS. Note-se que a celularidade é menor do que a MPNST grau III da OMS ilustrada no painel C e que os núcleos das células tumorais em D são mais hipercromáticos (mais escuros) do que os vistos no painel B. (C) Fotomicrografias de baixa e (D) alta potência de um MPNST grau III da OMS. Este tumor demonstrou >4 figuras mitóticas por 10 campos de alta amplitude, com células mais densamente compactadas e núcleos mais hipercromáticos e atípicos. (E) Visões de baixa e (F) alta potência de um MPNST grau IV da OMS. Observe o foco de necrose na porção central inferior do painel F. Baixa potência = 20x. Alta potência = 40x, barras de escala = 100 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 8: Imagens representativas das células P 0-GGFβ3 MPNST de passagem precoce e sua tumorigenicidade, demonstrada pelo crescimento em ágar mole e sua capacidade de crescer como aloenxertos. (A) Imagens de contraste de fase de baixa e (B) alta potência de células MPNST P_0-GGFβ3 de passagem precoce. (C) Células P 0-GGFβ3 MPNST cultivadas em ágar mole e coradas com preto sudanês; As colônias são evidentes como puncta preta no ágar. (D) Imagem corada pela hematoxilina e eosina de um tumor formado após células MPNST P 0-GGFβ3 foram aloenxertadas por via subcutânea em camundongo imunodeficiente, conforme descrito no protocolo. (E) Proliferação de células P 0-GGFβ3 MPNST de passagem precoce durante um período de 5 dias, conforme determinado por um citômetro de imagem Celigo. Baixa potência = 10x, alta potência = 40x; barra de escala = 100 μm para todos os painéis Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Nome	Uso	Reatividade/Classe das Espécies
CD117	Pré-diluído	coelho monoclonal
CD163	1:200	monoclonal de rato
CD31	1:50	coelho policlonal
CD34	1:2000	coelho monoclonal
CD86	1:1000	coelho monoclonal
Citoqueratina	1 μg/mL	camundongo monoclonal
Desmina	1:50	camundongo monoclonal
Iba1	1:500	coelho policlonal
Ki-67	1:50	coelho monoclonal
MART1	1 μg/mL	camundongo monoclonal
Nestina	1:1,000	camundongo monoclonal
PMEL	1:100	rabbot monoclonal
S100B	1:200	coelho policlonal
SMA	1:100	camundongo monoclonal
Sox10	1:10	camundongo monoclonal
TCF4/TCFL2	1:100	coelho monoclonal

Tabela 1: Anticorpos utilizados para o diagnóstico de neurofibroma plexiforme e tumores malignos da bainha de nervos periféricos. Anticorpos usados para identificação rotineira de neurofibromas plexiformes GEM (S100β, Sox10, CD117, Ki67), diagnóstico de MPNSTs e avaliação completa de outros tipos celulares presentes em neurofibromas. Abreviação: MPNST = tumor maligno da bainha do nervo periférico.

		S100β	Nestina	Sox10	MART1	PMEL	Desmina	Actina de músculo liso	Citoqueratina	Fusão SS18-SSX
MPNST		50-90%, geralmente focais	Positivo1	~30%	Negativo	Negativo	Negativo	Negativo	Negativo	Negativo
Fibrossarcoma		Negativo	Negativo	Negativo	Negativo	Negativo	Negativo	Negativo	Negativo	Negativo
Leiomiossarcoma		Raro	Negativo	Negativo	Negativo	Negativo	50-100%	Positivo	~40%	Negativo
Sarcoma epitelóide		Negativo	Negativo	Negativo	Negativo	Negativo	Negativo	Negativo	Positivo	Negativo
Melanoma		Positivo	Positivo	85%	Positivo	Positivo	Negativo	Negativo	Negativo	Negativo
Sarcoma sinovial monofásico		~30%	Negativo	Negativo	Negativo	Negativo	Negativo	Negativo	Positivo	Positivo

Tabela 2: Marcadores utilizados para estabelecer a identidade tumoral em humanos. Esses marcadores imuno-histoquímicos e histoquímicos, juntamente com uma avaliação da morfologia microscópica do tumor, são usados para distinguir MPNSTs de outras neoplasias que os mimetizam. O diagnóstico diferencial tipicamente considerado para MPNSTs humanos inclui fibrossarcoma do tipo adulto, sarcoma epitelóide, leiomiossarcoma, sarcoma sinovial monofásico e melanoma. Os fibrossarcomas do tipo adulto têm um padrão microscopicamente de espinha de arenque e coloração para vimentina, mas não S100β. Leiomiossarcomas, mas não MPNSTs, são imunorreativos para desmina; Os leiomiossarcomas também têm núcleos com uma morfologia notavelmente romba. Os sarcomas epitelóides, mas não os MPNSTs, são imunorreativos para citoqueratina. Os melanomas, como os MPNSTs, podem ser S100β-positivos, mas também são imunorreativos para MART-1 e PMEL. Abreviação: MPNST = tumor maligno da bainha do nervo periférico. ^1ºA combinação de S100β e nestina é altamente preditiva de MPNST.

Discussion

Os métodos histológicos e bioquímicos aqui apresentados fornecem uma estrutura para diagnosticar e caracterizar modelos de GEMs na patogênese do neurofibroma e do MPNST. Ao longo dos anos, essas metodologias têm sido bastante úteis para avaliar a patologia dos tumores da bainha dos nervos periféricos que surgem em modelos de^GEM21,25,26. No entanto, embora os protocolos aqui descritos sejam úteis para determinar com que precisão os tumores nos modelos GEM recapitulam a patologia de seus homólogos humanos, existem algumas limitações para essas estratégias que devem ser apreciadas. Para começar, camundongos P 0-GGFβ3 apresentam penetrância quase completa de seu fenótipo tumoral, o que torna relativamente fácil a obtenção de um grande número de camundongos com neurofibromas e MPNSTs 21,25,26 que podem ser usados para estudos genômicos e telas de shRNA em escala genômica. A alta penetrância do fenótipo neste modelo também torna os camundongos P 0-GGFβ3 bastante úteis para ensaios pré-clínicos. Deve-se reconhecer, no entanto, que este não será o caso de todos os modelos de câncer GEM. É por isso que enfatizamos a importância de determinar a fração de animais que pode ser prevista para desenvolver tumores. Ao trabalhar com um modelo animal que menos comumente desenvolve tumores, achamos vantajoso usar modalidades de imagem como ressonância magnética ou tomografia por emissão de pósitrons para identificar definitivamente animais portadores de tumores que podem ser inseridos em ensaios pré-clínicos ou outros estudos. No entanto, essa abordagem pode ser proibitiva em termos de custo se forem necessárias varreduras repetidas. Por isso, também enfatizamos a importância de se estabelecer o tempo médio de sobrevida do modelo GEM de^interesse26 - entender quando se pode esperar que um animal desenvolva um tumor reduz o número de exames necessários para identificar animais com o fenótipo desejado e os custos associados.

Também é importante reconhecer que um grande tumor em um camundongo ainda é, na verdade, uma quantidade bastante pequena de tecido. Neste protocolo, recomendamos um processo em que o tecido tumoral é dividido em terços, com porções dedicadas à histologia/imunohistoquímica, estabelecimento de culturas celulares de passagem precoce e isolamento de biomoléculas (proteínas, RNA, DNA) de interesse. No entanto, o tamanho do tumor irá variar e se o tumor for muito pequeno, isso pode impedir que haja tecido suficiente para se dividir dessa maneira. Nesse caso, o investigador deve determinar se o diagnóstico do tumor ou outro uso do tecido tumoral é priorizado³². Nessas circunstâncias, nosso viés é que devemos ter um diagnóstico adequado para entender com o que estamos trabalhando antes de embarcar em outros experimentos. Descobrimos que o diagnóstico tumoral geralmente pode ser prontamente estabelecido usando menos de um terço da neoplasia. Ao lidar com pequenos tumores, normalmente removemos um pequeno fragmento de tecido tumoral, envolvemos-no em tecido histológico e o colocamos em um de tecido para garantir que o tecido não seja perdido durante o processamento. A desvantagem dessa abordagem é que ela pode fazer com que o investigador subestime a neoplasia se a classificação da OMS for desejada; Isso ocorre porque regiões de grau mais baixo e mais alto comumente coexistem em cânceres e, se uma amostra muito pequena for coletada, o grau obtido dependerá de onde a amostra do tumor foi retirada.

Os protocolos que descrevemos para estabelecer a identidade tumoral da bainha do nervo periférico dependem fortemente da imuno-histoquímica. Embora existam abordagens alternativas ocasionais que podem ser usadas para alguns tipos de células (por exemplo, realizando colorações de Unna para identificar mastócitos), isso não é uniformemente verdadeiro para a maioria dos tipos celulares presentes em neurofibromas e MPNSTs. Consequentemente, muito cuidado deve ser tomado para estabelecer que os procedimentos imunohistoquímicos que serão utilizados foram devidamente otimizados. Em nossa experiência, várias questões podem comprometer a imuno-histoquímica diagnóstica. É extremamente importante que o investigador realize uma série dilucional com um anticorpo primário que não tenha usado antes; Além disso, uma série dilucional deve ser realizada ao usar um novo lote de um anticorpo previamente otimizado³³. Devem também ser tomadas precauções para garantir que novos lotes de reagentes estejam à mão. Em nossa experiência, quando envelhecem, o peróxido de hidrogênio e o DAB são particularmente propensos a não funcionar adequadamente, o que pode levar o investigador a decidir inadequadamente que suas colorações são negativas.

Os perfis imuno-histoquímicos que descrevemos para neurofibromas plexiformes, MPNSTs e os diversos tipos de neoplasias que são considerados no diagnóstico diferencial de MPNSTs são os que temos encontrado mais comumente 21,25,26,34. No entanto, como a diferenciação divergente não é incomum em MPNSTs e nessas outras neoplasias, o investigador pode encontrar perfis de coloração que diferem um pouco do que descrevemos aqui. Essas nuances são o motivo pelo qual recomendamos fortemente que a equipe que caracteriza um novo modelo GEM de tumorigênese inclua um patologista humano ou veterinário experiente. Neste protocolo, aplicamos a classificação da OMS a GEMs e MPNSTs humanos. Preferimos esse sistema de graduação porque os critérios de graduação são relativamente bem definidos e fáceis de comparar entre MPNSTs humanos e camundongos ^2,28. Note-se, no entanto, que os critérios de classificação da OMS não são uniformemente aceitos pelos patologistas. Isso ocorre porque não está claro se os três graus da OMS aplicados aos MPNSTs são preditivos de desfechos clínicos em pacientes. Por causa disso, muitos patologistas preferem classificar as MPNSTs simplesmente como malignidades de baixo ou alto grau. Usando essa abordagem, aproximadamente 85% dos MPNSTs são considerados malignidades de alto grau caracterizadas por atividade mitótica intensa, atipia celular acentuada e hipercromasia que pode ser acompanhada de necrose tumoral. MPNSTs de baixo grau mostram menor celularidade, hipercromasia e atividade mitótica.

Descobrimos que aloenxertar células MPNST de passagem precoce é um meio simples de verificar a tumorigenicidade dessas culturas. Entretanto, algumas questões devem ser consideradas quando as células não estabelecem um aloenxerto³². Em nossa experiência, enquanto a esmagadora maioria das células MPNST de passagem precoce estabelecerá um aloenxerto, ocasionalmente encontramos culturas de passagem precoce que não o fazem. Apesar dessa falha, a hibridização genômica comparativa por arranjo (aCGH) e o sequenciamento completo do exoma demonstraram que essas culturas de passagem precoce apresentavam múltiplas anormalidades genômicas consistentes com o fato de serem células tumorais^25,26. Também encontramos culturas de passagem precoce que não são saudáveis, geralmente porque as culturas foram deixadas confluentes antes de colhê-las para enxertia. As células danificadas pelo manuseio áspero (por exemplo, incubadas por muito tempo com solução de dissociação celular não enzimática pipetada para cima e para baixo um número excessivo de vezes) também apresentam um desempenho ruim quando enxertadas. Ressaltamos também que os tempos que indicamos para o estabelecimento do enxerto são uma estimativa baseada em nossa experiência. Por vezes, encontramos culturas de passagem precoce que estabelecem aloenxertos com sucesso, mas levam mais tempo para fazê-lo.

As abordagens descritas acima fornecem um meio abrangente de caracterizar aspectos-chave de um modelo GEM recém-desenvolvido de neoplasia do sistema nervoso periférico e diagnosticar adequadamente quaisquer neurofibromas e MPNSTs que esses animais desenvolvam. Os métodos que delineamos para o estabelecimento de culturas de MPNST de passagem precoce e o uso dessas culturas para aloenxertia também fornecem evidências claras da tumorigenicidade de neoplasias identificadas em modelos de GEM. Ressaltamos que não estamos realizando a seleção de clones individuais ao estabelecer culturas de passagem precoce. Embora reconheçamos que alguma seleção é inevitável ao colocar células tumorais em culturas, esses achados iniciais sugerem que as mutações identificadas em culturas de MPNST GEM de passagem precoce permanecem altamente semelhantes àquelas presentes no tumor de origem. No entanto, usando aCGH, também descobrimos que continuar a transportar essas culturas de passagem precoce para passagens mais longas resulta em mudanças genômicas que começam a divergir do que é visto nas passagens anteriores dessas células tumorais.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Placas de Cultura de Tecidos de 100 mm	Corning Falcon	353003
3, 3'- Diaminobensidina (DAB)	Vector Laboratories	SK-400
Placas de 6 poços	Corning Costar	3516
Ácido Acético	Fisher Scientific	A38-212
Alexa Fluor 488 Secundário (Anti-Rato de Cabra)	Invitrogen	A11029
Alexa Fluor 568 Secundário (Anti-Rato de Cabra)	Invitrogen	A21043 ou A11004
Alexa Fluor 568 Secundário (Anti-Coelho de Cabra)	Invitrogen	A11036
Cloreto de Amônio (NH4Cl)	Fisher Scientific	A661-500
	Thermo Scientific	23225
Albumina	de Soro BovinoFisher Scientific	BP1600-100
Caldesmon	ABCAM	E89, ab32330
CD117	Cell Marque	117R-18-ASR
CD163 Leica		NCL-L-CD163
CD31	ABCAM	ab29364
CD34	ABCAM	ab81289
CD86	ABCAM	ab53004
Raspador de Células	Sarstedt	83.183
Descascador de Células	Corning	25-056-CI
Lamínula Circular	Fisher Scientific	12-545-100
Citrisolve Hybrid (solvente à base de d-limoneno)	Decon Laboratories	5989-27-5
Critic Acid	Fisher Scientific	A104-500
Citoqueratina	ABCAM	C-11, ab7753
Desmin	Agilent Dako	clone D33 (M0760)
Diaminobensizdina (DAB) Solução	Vector Laboratories	SK-4100
DMEM	Corning	15-013-CV
Eosina Y	Thermo Scientific	7111
Etanol (200 Provas)	Decon Laboratories	2716
Soro de bezerro fetal	Omega Scientific	FB-01
Forksolin	Sigma-Aldrich	F6886
Glicerol	Sigma-Aldrich	G6279
Hank's Balanced Salt Solution (HBSS)	Corning	21-022-CV
Harris Hematoxilina	Fisherbrand	245-677
Hemacitômetro	Brightline-Hauser Scientific	1490
Ácido Clorídrico	Fisher Scientific	A144-212
Peróxido de Hidrogênio	Fisher Scientific	327-500
Iba1	Wako Chemicals	019-19741
Kit de Polímero ImmPRESS HRP (Peroxidase), Mouse on Mouse	Mouse Vector Laboratories	MP-2400
Kit de Polímero ImmPRESS HRP (Peroxidase), Horse Anti-Rabbit	Vector Laboratories	MP-7401
Incubadora	Thermo Scientific	Heracell 240i Incubadora
Isoflurano	Piramal	NDC 66794-017-25
Isopropanol	Fisher Scientific	A415
Ki-67	Sinalização Celular	12202
Laminin	Thermo Fisher Scientific	23017015
Nitrogênio Líquido
MART1	ABCAM	M2-9E3, ab187369
Micrótomo
Nestin	Millipore	Humano: MAD5236 (10C2), Humano: MAB353 (Rat-401)
Neuregulin 1 beta	Fabricado	internamente pela S.L.C. (também disponível como 396-HB-050/CF da R& D Systems)
Neurofibromin	Santa Cruz Biotechnology	sc-67
NOD. Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ ratos	Jackson Laboratory	5557
Leite em Pó Desnatado	Walmart	Marca
P0-GGFβ 3 camundongos	Cera
	Leica	Paraplast 39601006
Parafilm M	Sigma-Aldrich	PM-999
Paraformaldeído (4%)	Thermo Scientific	J19943-K2
Permount (Meio de Montagem de Xileno)	Fisher Scientific	SP15-100
	Mettler Toldedo	Seven Excellence, 8603
Phosphate Buffered Saline (Dulbecco's)	Corning	20-031-CV
PMEL	ABCAM	EP4863(2), ab137078
Bromidrato de Poli-L-Lisina	Sigma-Aldrich	P5899-5MG
	Sistemas de Anestesia por
PVA-DABCO (Meio de Montagem Aquosa)	Millipore Sigma	10981100ML
	Beech Hamilton
S100B	Agilent Dako	Z0311  (agora GA504)
Sistemas Médicos SMA	Ventana	clone 1A4
Cloreto de Sódio	Fisher Scientific	S640
Citrato de Sódio (Dihidratado)	Fisher Scientific	BP327-1
Sox10	ABCAM	ab212843
			de histologia de aço
Superfrost Plus Lâminas de microscópio	Fisher Scientific	12-550-15
TCF4/TCFL2	Sinalização Celular	(CH48H11) #2569
de Tecido Toluidina Azul	ACROS Organics	348600050
Triton X-100	Fisher Scientific	BP151-500
TRIzol	Invitrogen	15596026
Trypsin	Corning	25-051-31