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Artigo de método

Efeitos do Desmodium caudatum sobre os hormônios gastrintestinais e a flora intestinal em ratos com gastrite

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DOI:

10.3791/65744

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1 de março de 2024

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1Key Laboratory for Quality Control and Evaluation of Traditional Chinese Medicine of Mianyang City, Mianyang Normal University, 2The Traditional Chinese Medicine Hospital of Beichuan Qiang Autonomous County

* These authors contributed equally

Neste artigo

Resumo

O presente protocolo descreve o método de análise da flora intestinal utilizando o sequenciamento do gene 16S rRNA baseado em Illumina e fornece uma estrutura para avaliar a eficácia de decocções fitoterápicas.

Resumo

A fim de explorar preliminarmente os efeitos de Desmodium caudatum sobre a gastrite e flora intestinal em ratos, um modelo de gastrite crônica em ratos foi estabelecido usando o método clássico de salicilato de sódio. Dezoito ratos com FPS foram divididos em três grupos: grupo controle (Grupo C), grupo modelo (Grupo M) e grupo tratamento (Grupo T). Cortes anatomopatológicos da parede gástrica foram retirados dos ratos de cada grupo. Além disso, as concentrações de gastrina e malondialdeído no soro dos ratos de cada grupo foram determinadas por ELISA. Adicionalmente, os efeitos de D. caudatum na flora intestinal de ratos com gastrite foram explorados através de uma comparação detalhada das comunidades bacterianas intestinais nos três grupos, empregando o sequenciamento do gene 16S rRNA baseado em Illumina. Os resultados indicaram que a decocção de D. caudatum pode reduzir o conteúdo de malondialdeído e aumentar o conteúdo de gastrina. Além disso, a decocção de D. caudatum aumentou a diversidade e abundância da flora intestinal, exercendo um impacto positivo no tratamento da gastrite, regulando e restaurando a flora intestinal.

Introdução

A gastrite crônica (DC), uma das doenças clínicas mais comuns, caracteriza-se por alterações inflamatórias crônicas e persistentes no epitélio da mucosa gástrica, que é frequente e repetidamente atacado por vários fatorespatogênicos1. A taxa de incidência de CG ocupa o primeiro lugar entre todos os tipos de doenças estomacais, sendo responsável por 40% a 60% da taxa de atendimento ambulatorial do Departamento de Gastroenterologia2. Além disso, a taxa de incidência geralmente aumenta com a idade, especialmente em indivíduos de meia-idade e mais velhos3. Sem dúvida, o GC reduz significativamente a qualidade de vida das pessoas, enfatizando a necessidade crítica de descoberta de novos agentes terapêuticos.

Inúmeros estudos relatam que a ocorrência e o desenvolvimento do CG estão ligados à secreção de hormônios gastrintestinais, como a gastrina (GAS)4,5. GAS, um hormônio peptídeo gastrointestinal comum no trato digestivo, estimula as células a secretar ácido gástrico, promovendo a liberação de histamina dos eosinófilos. Além disso, melhora a nutrição e o suprimento sanguíneo da mucosa gástrica, promovendo a proliferação da mucosa gástrica e das células parietais6. Portanto, a gastrina pode ser utilizada como um indicador para avaliar o nível de desenvolvimento do GC. Além disso, produtos de peroxidação lipídica desencadeados por óxidos reativos podem ativar células inflamatórias, levando ao CG. Malondialdeído (MDA), um marcador de peroxidação lipídica, é um indicador comumente usado para medir o grau de estresse oxidativo. Reflete o nível de radicais livres na mucosa gástrica até certo ponto. O nível de MDA pode indicar o ataque de ácidos graxos insaturados na mucosa gástrica local causado por radicais livres 7,8.

A microecologia intestinal consiste em milhões de microrganismos que residem no intestino do hospedeiro, desempenhando um papel vital na manutenção da saúde do hospedeiro e na regulação da imunidade do hospedeiro. Uma flora intestinal saudável, caracterizada por alta riqueza, diversidade e função estável da microbiota, atua como barreira protetora contra a invasão de microrganismos patogênicos pela participação no metabolismo. Distúrbios na flora intestinal tornam os indivíduos mais suscetíveis a doenças gastrointestinais agudas ecrônicas9,10. Nos últimos anos, a terapia da microbiota para doenças gastrintestinais progrediu rapidamente e demonstrou eficácia significativa11. Em resumo, a consideração da flora intestinal é crucial na compreensão e abordagem das doenças gastrointestinais.

Como componente indispensável do tesouro da medicina tradicional chinesa, os materiais medicinais populares têm grande importância para a prática clínica e a modernização da medicina nacional. As raízes e partes inteiras de Desmodium caudatum (Thunb.) DC. tem sido amplamente utilizado para aliviar o desconforto estomacal na área de Beichuan Qiang da cidade de Mianyang por um longo período. Alguns artigos indicam a base científica para o tratamento de doenças gastrointestinais com D. caudatum, citando seus efeitos como hemostasia, antioxidante e proteção gastrointestinal 12,13,14. No entanto, devido à falta de pesquisas aprofundadas, nenhum mecanismo farmacodinâmico clínico foi estabelecido. Este artigo tem como objetivo estudar os efeitos de D. caudatum no tratamento de gastrites com base em hormônios gastrintestinais e flora intestinal, fornecendo uma base para sua aplicação clínica racional.

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Protocolo

Os procedimentos para o cuidado e uso de animais foram aprovados pelo Comitê de Ética da Universidade Normal de Mianyang, e todas as regulamentações institucionais e governamentais relevantes sobre o uso ético de animais foram rigorosamente seguidas. Para o presente estudo, ratos SPF (espécie Kunming, machos e fêmeas, pesando 180-220 g) foram utilizados. Os animais foram obtidos de fonte comercial (ver Tabela de Materiais). Todos os animais foram alojados em ambiente livre de patógenos e proporcionaram acesso ad libitum à ração.

1. Preparação dos reagentes

  1. Preparar uma solução de salicilato de sódio a 5% pesando 2,5 g de salicilato de sódio em pó (ver Tabela de Materiais) com uma balança eletrónica. Dissolva o pó em uma pequena quantidade de água destilada e dilua-o até um volume total de 50 mL.
  2. Preparar a decocção de D. caudatum (12,8 g/kg). Pesar 128 g de D. caudatum (ver Tabela de Materiais), colocá-lo num balão de fundo redondo contendo 1000 ml de água destilada de laboratório e concentrar-o num volume final de 100 ml.

2. Agrupamento e administração

  1. Divida os ratos em diferentes grupos e administre por via intragástrica as soluções necessárias.
    OBS: Para o presente estudo, 18 ratos (9 machos e 9 fêmeas) foram divididos em três grupos: grupo controle (Grupo C), grupo modelo (Grupo M) e grupo tratamento (Grupo T), com 6 ratos em cada grupo. O grupo controle recebeu solução salina e o grupo modelo recebeu solução de salicilato de sódio a 5% por 5 semanas na dose de 10 mL/kg/dia15. O grupo de tratamento foi pré-tratado com solução de salicilato de sódio a 5% por 5 semanas na dose de 10 mL/kg/dia, seguida da administração de decocção de D. caudatum na dose de 1 mL/100 g por 10 dias15,16.
  2. Coletar fezes dos ratos em tubos de microcentrífuga secos e estéreis usando o método de transporte de cauda17 no último dia do experimento e congelá-las em um freezer de ultrabaixa temperatura de nitrogênio líquido.
  3. Após o término da amostragem, sacrificar os ratos por deslocamento cervical (seguindo protocolos aprovados institucionalmente). Abra a cavidade abdominal com tesoura para expor a aorta abdominal.
    1. Insira a agulha (23-25 G) quase paralela na aorta abdominal, colete o soro e conserve-o em um freezer de ultrabaixa temperatura. Retire os estômagos da cavidade abdominal16 e mergulhe em uma solução de formalina a 10% para preservação.
      NOTA: No Grupo M, o modelo de gastrite crônica é considerado bem-sucedido se a mucosa gástrica estiver dilatada e congesta com morfologia glandularregular15, observando-se pequena quantidade de infiltrado de células inflamatórias na lâmina própria.

3. Secção patológica da parede gástrica

  1. Colher as amostras da parede gástrica dos ratos de cada grupo para cortes patológicos. Posteriormente, realizar coloração rotineira pela hematoxilina-eosina para observar e analisar as alterações patológicas18.

4. Determinação dos hormônios gastrointestinais séricos

  1. Na amostra de soro, detectar o conteúdo de gastrina (GAS) e malondialdeído (MDA)19 usando ELISA seguindo as instruções do fabricante (ver Tabela de Materiais). Utilize um leitor de microplacas para a análise.

5. Extração de DNA total fecal e amplificação e purificação por PCR

  1. Realizar extração de DNA microbiano utilizando o kit de isolamento de DNA disponível comercialmente (ver Tabela de Materiais) e determinar a concentração e pureza usando espectrofotômetro UV-Vis16. Posteriormente, avaliar a integridade do DNA por meio de eletroforese em gel de agarose1% 18.
  2. Amplificar o gene 16S rRNA da bactéria com os primers 338F (5′-ACT CCT, ACG, GGA, GGC, AGC, AG-3′) e 806R (5′-GAC TAC, HVG, GGG, GTW, TCT, AT-3′) usando um sistema de PCR termociclador17. Os primers são obtidos de fontes comerciais (ver Tabela de Materiais).
    NOTA: Siga o programa de PCR: desnaturação (3 min, 95 °C), seguida por 27 ciclos (30 s, 95 °C; 30 s, 55 °C; 45 s, 72 °C) e uma extensão final (10 min, 72 °C). Conduzir reações de PCR com os seguintes componentes: 4 μL de tampão DNA polimerase 5×, 2 μL de dNTPs 2,5 mM, 0,8 μL de cada primer (5 μM), 0,4 μL de DNA polimerase e 10 ng de DNA molde (ver Tabela de Materiais).
  3. Extrair, purificar e quantificar os produtos da PCR sequencialmente usando gel de agarose 2%, kit de extração de DNA em gel comercialmente disponível e fluorômetro, respectivamente17.

6. Sequenciamento

NOTA: As etapas 6 e 7 são executadas seguindo métodos publicados anteriormente20,21.

  1. Utilize a plataforma Illumina para sequenciamento.
    NOTA: Uma extremidade do fragmento de DNA complementa a base do conector embutido no chip, prendendo-o no chip. A outra extremidade complementa aleatoriamente a base de outra junta adjacente enterrada, formando uma "ponte".
  2. Realizar amplificação por PCR para gerar clusters de DNA. Linearize amplificadores de DNA em fitas simples.
  3. Introduzir uma DNA polimerase alterada ao lado de desoxirribonucleotídeos trifosfatos (dNTPs) com quatro marcadores fluorescentes distintos. Sintetizar apenas uma base por ciclo.
  4. Utilizar um laser para escanear a superfície da placa de reação e determinar os tipos de nucleotídeos polimerizados durante a reação inicial de cada sequência de molde.
  5. Clivar quimicamente o "grupo de fluorescência" e o "grupo de terminação" para restabelecer a extremidade pegajosa de 3'. Posteriormente, avançar para a polimerização do segundo nucleotídeo.
  6. Obter a sequência de fragmentos de DNA molde analisando os resultados do sinal de fluorescência coletados em cada rodada.

7. Tratamento de dados de sequenciação

  1. Inicialmente, corte as leituras de dados brutos do fastq em qualquer local com uma pontuação < Q20 e elimine leituras com bases incertas. Além disso, permita duas incompatibilidades em primers precisamente combinados. Posteriormente, mesclar as sequências com uma sobreposição >10 pb.
  2. Agrupar unidades taxonômicas operacionais (OTUs) com 97% de similaridade usando UPARSE, e remover sequências quiméricas com UCHIME20,21.
  3. Empregar o algoritmo Classificador RDP para analisar a taxonomia de cada sequência do gene 16S rRNA contra o banco de dados Silva (SSU123) 16S rRNA, usando um limiar de confiança de 70%.
  4. Realizar análise de diversidade Alpha e análise de diversidade Beta usando Mothur e Qiime, respectivamente (consulte Tabela de Materiais).

8. Análise estatística

  1. Analise os dados deste estudo usando um software de análise estatística (ver Tabela de Materiais). Empregar análise de variância (ANOVA) one-way para comparações entre múltiplos grupos e utilizar o teste de diferença mínima significativa (LSD) para comparações entre dois grupos.
  2. Considerar P < 0,05 como estatisticamente significante em todas as comparações. P < 0,01 é considerado extremamente significativo.

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Resultados

Os resultados do corte anatomopatológico da parede do estômago estão representados na Figura 1. Em comparação ao Grupo C, o Grupo M apresentou atrofia discreta da parede gástrica e inflamação leve. No entanto, quando comparado ao Grupo M, o Grupo T não apresentou inflamação evidente, metaplasia intestinal ou atrofia. Isto sugere que a decocção de D. caudatum pode efetivamente melhorar a gastrite.

Os resultados da dosagem hormonal gastrintestinal sérica es...

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Discussão

D. caudatum, uma medicina popular comumente utilizada pela nacionalidade Qiang12, tem demonstrado eficácia significativa no tratamento de doenças gastrointestinais. Com o avanço das pesquisas farmacológicas modernas, o desequilíbrio da flora resultante do desequilíbrio da microecologia gastrointestinal é identificado como um fator-chave nas doenças gastrointestinais agudas ecrônicas22,23. Certos micro-organismos no trato intestina...

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Divulgações

Os autores não têm nada a revelar.

Agradecimentos

Este trabalho foi financiado pelos principais projetos de P&&D do Departamento de Ciência e Tecnologia da Província de Sichuan (2020YFS0539).

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Análise de diversidade alfaMothur 1.30.2
Kit de extração de gel de ácido desoxirribonucléico (DNA) AxyPrep Axygen Biosciences AP-GX-50
Análise de diversidade betaQiime 1.9.1
Geladeira criogênicaForma-86C ULT freezer
Desmodium caudatumHospital de Medicina Tradicional Chinesa de Beichuan Qiang Condado
E.Z.N.A. kit de soloOmega Bio-tekD5625-01
Illumina MiSeq PlatformIllumina Miseq PE300 / NovaSeq PE250
Multiskan SpectrumspectraMax i3
OTU clusteringUparse 7.0.1090
Estatísticas OTUUsearch 7.0
Instrumento de PCRTransGen AP221-02
Instrumento de PCRABI GeneAmp 9700
QuantiFluor-ST de fita dupla Sistema de DNA (dsDNA)Promega Corp.
Anotação de classificaçãode sequência Classificador RDP 2.11
Salicilato de sódioSichuan Xilong Chemical Co., Ltd54-21-7
Ratos SPFChengdu Dashuo Experimental Animal Co., Ltd
SPSS 18.0IBM
Autônomo

Referências

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