Identificação do Tipo de Fibra do Músculo Esquelético Humano

Resumo

Este protocolo demonstra o isolamento de fibra única do músculo esquelético humano liofilizado e a classificação do tipo de fibra de acordo com a isoforma da cadeia pesada da miosina (MHC) usando a técnica de dot blotting. Amostras de fibras MHC I e II identificadas podem então ser analisadas para diferenças específicas do tipo de fibra na expressão de proteínas usando western blotting.

Resumo

A técnica aqui descrita pode ser usada para identificar isoformas específicas da cadeia pesada de miosina (MHC) em segmentos de fibras musculares individuais usando dot blotting, doravante referido como detecção de cadeia pesada de Myosin por Do t Blotting for IDentification of muscle fiber type (MyDoBID). Este protocolo descreve o processo de liofilização do músculo esquelético humano e o isolamento de segmentos de fibras musculares únicas. Usando MyDoBID, as fibras do tipo I e II são classificadas com anticorpos MHCI- e IIa-específicos, respectivamente. As fibras classificadas são então combinadas em amostras específicas do tipo de fibra para cada biópsia.

A proteína total em cada amostra é determinada por eletroforese em gel de poliacrilamida com dodecil-sulfato de sódio (SDS-PAGE) e tecnologia de gel ativado por UV. O tipo de fibra das amostras é validado usando western blotting. A importância de realizar a normalização da carga proteica para melhorar a detecção de proteínas-alvo em vários western blots também é descrita. Os benefícios da consolidação de fibras classificadas em amostras específicas do tipo de fibra em comparação com as blots ocidentais de fibra única incluem versatilidade da amostra, maior rendimento da amostra, menor investimento de tempo e medidas de economia de custos, tudo isso enquanto retém informações valiosas específicas do tipo de fibra que são frequentemente negligenciadas usando amostras musculares homogeneizadas. O objetivo do protocolo é obter a identificação precisa e eficiente de fibras tipo I e tipo II isoladas de amostras de músculo esquelético humano liofilizado.

Essas fibras individuais são posteriormente combinadas para criar amostras específicas do tipo I e do tipo II de fibras. Além disso, o protocolo é estendido para incluir a identificação de fibras do tipo IIx, usando Actina como marcador para fibras negativas para MHCI e MHCIIa, que são confirmadas como fibras IIx por western blotting. Cada amostra específica do tipo de fibra é então usada para quantificar a expressão de várias proteínas-alvo usando técnicas de western blotting.

Introdução

O músculo esquelético é um tecido heterogêneo, com propriedades metabólicas e contráteis celulares distintas que dependem se a célula (fibra) é de contração lenta (tipo I) ou contração rápida (tipo II). O tipo de fibra pode ser identificado examinando-se as isoformas da cadeia pesada da miosina (MHC), que diferem entre si de várias maneiras, incluindo tempo de contração, velocidade de encurtamento e resistência à fadiga¹. As principais isoformas de MHC incluem tipo I, tipo IIa, tipo IIb e tipo IIx e seus perfis metabólicos são oxidativos (tipo I e IIa) ou glicolíticos (IIx, IIb)¹. A proporção desses tipos de fibras varia....

Protocolo

Amostras de músculo humano foram obtidas do vasto lateral de n = 3 (2 homens, 1 mulher), com idade entre 70 e 74 anos, em condições estéreis, utilizando-se anestesia local (xilocaína) e agulha de Bergstrom modificada para sucção manual^11,12. As amostras foram um subconjunto de um estudo prévio aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa com Seres Humanos da Victoria University (HRETH11/221) e conduzido de acordo com a Declaração de Helsinque¹³. Os participantes assinaram o termo de consentimento livre e esclarecido para participar deste estudo. Todos os detalhes de todos os mater....

Resultados

Identificação de fibras musculares MHCI, MHCIIa e MHCIIx individuais usando dot blotting
Uma característica do MyDoBID é a categorização da variação da intensidade de sinal MHC e Actina em uma dada fibra (Figura 4A). O tipo de fibra foi identificado pela presença ou ausência das isoformas MHCI e IIa (Figura 4B). Seis fibras não apresentaram detecção de MHC ou actina, indicando que não houve coleta de fibras. Os resultados desse dot blot espec.......

Discussão

Coleção de fibras
Com base em vários anos de experiência, a maioria dos pesquisadores pode dominar essa técnica; no entanto, a prática leva a uma coleta de fibra mais rápida e eficiente para análises a jusante. Para poder isolar 30 segmentos de fibra única de qualidade para pooling, recomenda-se que sejam coletados 50 segmentos de fibra por amostra. Estudar o vídeo de coleta de fibras cuidadosamente e depois de realizar duas sessões de prática (~50 fibras por sessão) é recomendado para alcançar um pad.......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
1x tampão desnaturante	Faça de acordo com a receita	Os constituintes podem ser obtidos da Sigma-Aldrich ou de outras empresas distribuidoras de produtos químicos	1x tampão desnaturante é feito diluindo 3x tampão desnaturante 1 em 3 v/v com 1X Tris-HCl (pH 6,8). Armazene a -20 ° C.
3x tampão desnaturante	Faça de acordo com a receita	Os constituintes podem ser obtidos da Sigma-Aldrich ou de outros distribuidores químicos	3x tampão desnaturante contém: 0,125M Tris-HCI, 10% glicerol, 4% SDS, 4 M ureia, 10% 2-mercaptoetanol e 0,001% azul de bromofenol, pH 6,8.  Armazene a -20 ° C.
95% Etanol	N/A	100% etanol pode ser obtido de qualquer empresa	Diluído a 95% com H2O ultrapuro.
Anticorpo policlonal de coelho com actina	Sigma-Aldrich	A2066	Diluir 1 em 1.000 com tampão BSA.
Balanças analíticas	Mettler Toledo	Número do modelo: MSZ042101
Intensificador de anticorpos	Thermo Fischer Scientific	32110	nome do produto é Miser Antibody Extender Solution NC.
Copo (100 mL)	N/A	N/A
Centrífuga de bancada	Eppendorf	5452	Nome do modelo: Mini Spin.
Tampão de bloqueio: 5% de leite desnatado em tampão de lavagem.	Loja de Diploma	comprou
buffer BSA: 1% BSA/PBST, 0,02% NaN3	BSA: Sigma-Aldrich                          PBS: Laboratórios Bio-Rad. NaN3 : Sigma-Aldrich	BSA: A6003-25G                                                10x PBS: 1610780                                            NaN3: S2002	Albumina sérica bovina (BSA), solução salina tamponada com fosfato (PBS) e azida sódica (NaN3). Armazene a 4 ° C.
Alavanca de abertura do	Bio-Rad Laboratories	4560000	Usado para abrir os de gel pré-moldados.
Chemidoc MP Imager	Bio-Rad Laboratories	Número do modelo: Capuz universal III	Qualquer sistema de imagem com recursos de imagem em gel sem manchas.
Criterion blotter	Bio-Rad Laboratories	1704070	Inclui bolsa de gelo, bandeja de transferência, rolo, 2 porta-, papel de filtro, almofadas de espuma e tampa com cabos.
Criterion Cell (Bio-Rad)	Bio-Rad Laboratories	1656001
ECL (quimioluminescência aprimorada)	Bio-Rad Laboratories	1705062	Nome do produto: Clarity Max Western ECL Substrate.
Tampão de eletroforese 1x Tris Glycine SDS (TGS)	Bio-Rad Laboratories	1610772	Diluir 10x TGS 1 em 10 com H2O. ultrapuro
Papel de filtro, 0,34 mm de espessura	Whatmann	3030917	Tamanho a granel 3 MM, embalagem de 100 folhas, 315 x 335 mm.
Pinça de dissecação de tecidos finos	Dumont	F6521-1EA	Joalheiro' s fórceps nº 5.
Bandeja/tampa de plástico plana	N/A	N/A	Grande o suficiente para colocar a membrana. Certifique-se de que a superfície esteja completamente plana.
Sistema de liofilização	Labconco	7750030	Freezone 4,5 L com estágio de amostra em câmara de vidro.
Freezer -80 oC	N/A	N/A	Qualquer freezer com temperatura constante de -80 &graus; C é adequado.
Os liberadores de gel	1653320	Bio-Rad	Deslize sob a membrana para reunir ou mover a membrana.
Lápis de grafite cinza	N/A	N/A
Software de laboratório de imagem	Bio-Rad Laboratories	N/A	Figures refere-se à versão 5.2.1 do software, mas outras versões podem ser usadas.
Incubadora	Bio-Rad	Laboratories 1660521	Qualquer incubadora que possa ser configurada para 37 ° C seria suficiente.
Lâmpada	N/A	N/A
Agitador magnético com pulga	N/A	N/A
Rolo de membrana	Bio-Rad Laboratories	1651279	Pode ser comprado no pacote de transferência. No entanto, se este produto não estiver disponível, qualquer tubo cilíndrico de superfície lisa longo o suficiente para rolar sobre a membrana seria suficiente.
Tubos de microcentrífuga (0,6 mL)	N / A	N / A
Mouse IgG HRP secundário	Thermo Fisher Scientific	31430	Cabra anti-Mouse IgG (H + L), RRID AB_228341. Diluir em 1 em 20.000 no tampão de bloqueio.
Mouse IgM HRP secundário	Abcam	ab97230	Goat Anti-Mouse IgM mu cadeia. Utilizar na mesma diluição que a IgG de ratinho.
Anticorpo primário de Cadeia Pesada de Miosina I (MHCI)	DSHB	A4.840	Intervalo de diluição: 1 em 200 a 1 em 500 em tampão BSA.
Anticorpo primário de Cadeia Pesada de Miosina IIa (MHCIIa)	DSHB	A4.74	Intervalo de diluição: 1 em 200 a 1 em 500 em tampão BSA.
Anticorpo primário de cadeia pesada de miosina IIx (MHCIIx)	DSHB	6H1	Faixa de diluição: 1 em 200 a 1 em 500 em tampão BSA.
Membrana de Nitrocelulose 0.45 µ m	Bio-Rad Laboratories	1620115	para Western blotting.
Tampa da placa de Petri	N/A	N/A
Pinças de plástico	N/A	N/A
Power Pack	Bio-Rad Laboratories	164-5050	Nome do produto: Fonte de alimentação básica.
Escada de proteína	Thermo Fisher Scientific	26616	PageRuler Escada de proteína prestada, 10 a 180 kDa.
Membrana PVDF 0.2 µ m	Bio-Rad Laboratories	1620177
Rabbit HRP secundário	Thermo Fisher Scientific	31460	Goat anti-Rabbit IgG (H+L), RRID AB_228341. Diluição igual à dos anticorpos secundários de ratinho.
Régua	N/A	/A
Tecido (sem fiapos)	Kimberly-Clark professional	34120	Nome do produto: Kimwipe.
Tampão de transferência (1x tampão Tris Glycine (TG), 20% de metanol)	TG: Bio-Rad Laboratories    Metanol: Merck	TG buffer: 1610771                    Metanol: 1,06018	diluir 10x tampão TG com H2O ultrapuro a 1x. Adicionar 100% de metanol a uma concentração final de 20% de metanol. Armazene a 4 ° C.
Bandeja de transferência	Bio-Rad Laboratories	1704089
Gel pré-moldado de ativação UV	Bio-Rad Laboratories	5678085	Tipo de gel: 4– 15% Criterion TGX Gel de Proteína Sem Corantes, 26 poços, 15 µL.
Vortex	N/A	N/A
Wash buffer (1x TBST)	10x TBS: Astral Scientific  Tween 20: Sigma	Receita de BIOA0027-4L	1x TBST: 10x solução salina tamponada com Tris (TBS) é diluída até 1x com H2O ultrapuro, Tween 20 é adicionado a uma concentração final de 0,1%. Armazene o buffer a 4 ° C.
Recipientes de lavagem	Sistema	Store comprado	Qualquer recipiente tupperware, que se adapte às dimensões aproximadas da membrana seria suficiente.

O N Tesoura N/A N/A Stereomicroscope Motic SMZ-168 do estereomicroscópio N/A N/A Thermo Fisher Scientific 21059 Nome do produto: Restaure o tampão de descascamento ocidental do borrão.