Rastreando a liberação de miRNA em vesículas extracelulares usando citometria de fluxo

Resumo

Aqui, descrevemos um protocolo simples que permite a avaliação in vitro da abundância de microRNAs marcados fluorescentemente para estudar a dinâmica do empacotamento de microRNA e exportação para vesículas extracelulares (EVs).

Resumo

As vesículas extracelulares (EVs) são importantes mediadores da comunicação celular que são secretadas por uma variedade de diferentes células. Esses EVs transportam moléculas bioativas, incluindo proteínas, lipídios e ácidos nucléicos (DNA, mRNAs, microRNAs e outros RNAs não codificantes), de uma célula para outra, levando a consequências fenotípicas nas células receptoras. De todas as várias cargas de EV, os microRNAs (miRNAs) têm recebido muita atenção por seu papel na formação do microambiente e na educação de células receptoras por causa de sua clara desregulação e abundância em EVs. Dados adicionais indicam que muitos miRNAs são ativamente carregados em EVs. Apesar dessas evidências claras, a pesquisa sobre a dinâmica de exportação e os mecanismos de classificação de miRNA é limitada. Aqui, nós fornecemos um protocolo usando a análise por citometria de fluxo de EV-miRNA que pode ser usado para entender a dinâmica de carregamento de EV-miRNA e identificar a maquinaria envolvida na exportação de miRNA. Nesse protocolo, os miRNAs pré-determinados para serem enriquecidos em EVs e depletados das células do doador são conjugados a um fluoróforo e transfectados para as células do doador. Os miRNAs fluorescentemente marcados são então verificados para carregamento em EVs e depleção de células usando qRT-PCR. Como um controle de transfecção e uma ferramenta para controlar a população transfectada de células, um RNA celular fluorescentemente marcado (retido e esgotado em EV) é incluído. Células transfectadas com o miRNA-EV e miRNA-retido celular são avaliadas para sinais fluorescentes ao longo de 72 h. A intensidade de sinal de fluorescência específica para os miRNAs EV diminui rapidamente em comparação com os miRNAs retidos na célula. Usando este protocolo simples, pode-se agora avaliar a dinâmica de carregamento de miRNA e identificar vários fatores responsáveis pela carga de miRNAs em EVs.

Introdução

MicroRNAs (miRNAs) são um dos subconjuntos mais bem caracterizados de pequenos RNAs não codificantes, que são conhecidos por seu papel crítico na regulação gênica pós-transcricional. A expressão e a biogênese da maioria dos miRNAs seguem uma série coordenada de eventos que começa com a transcrição dos miRNAs primários (pri-miRNAs) no núcleo. Após o processamento nuclear pelo complexo microprocessado em precursores-miRNAs (pré-miRNAs), os pré-miRNAs são exportados para o citoplasma, onde passam por processamento posterior pela RNase III endonuclease, dicer em 21-23 nucleotídeos maduros miRNA duplexes¹. Uma das fitas do miRNA maduro processado li....

Protocolo

NOTA: Como pré-requisito para o uso desta técnica, a identificação e validação de miRNAs exportados seletivamente é necessária. Uma vez que diferentes linhagens celulares variam com base na carga de miRNA classificada em seus EVs, recomenda-se que a linhagem celular de interesse e EVs associados sejam avaliados para miRNAs antes do uso. Além disso, a transfecção à base de lipofectamina é uma das etapas críticas do protocolo; Recomenda-se pré-determinar a eficiência da transfecção antes da instalação do experimento.

1. Crescimento de células em cultura e transfecção de células com miRNA-EV conjugado a fluoróforos

1. P....

Resultados

Aqui, utilizamos a citometria de fluxo como uma ferramenta poderosa para investigar a liberação de miRNA das células em EVs. Usando este protocolo, a análise por citometria de fluxo das células transfectadas com miRNA-celular e miRNA-EV revelou uma diminuição sequencial do sinal de fluorescência correspondente ao miRNA-EV, enquanto o sinal correspondente ao miRNA-celular foi retido nas células. Para garantir que a conjugação de fluoróforos não interfira na liberação de miRNA em EVs, o miR-451a foi conjugado a dois fluoró.......

Discussão

O protocolo recém-estabelecido permite capturar a cinética de liberação de miRNA em EVs pós-transfecção de EV-miRNAs. A abordagem permite a análise simultânea de múltiplos miRNAs EV e miRNAs celulares, sujeitos às capacidades do citômetro. Além disso, embora a análise por citometria de fluxo possa fornecer informações valiosas sobre a biologia do miRNA EV, ela não está isenta de limitações. No entanto, algumas das limitações podem ser superadas quando utilizadas em conjunto com outras técnicas para uma compreensão mais a.......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Tubos de microcentrífuga de 1,5 mL	Fisher	05-408-129
Tubos Falcon de 15 mL Corning		352097
Placas de cultura de tecidos tratadas com superfície plana de fundo plano transparente de 6 poços	Fisher Scientific	FB012927
ApogeeMix 25 mL, (PS80/110/500 & Si180/240/300/590/880/1300 nm)	Apogee Flow Systems	1527	Para configurar gating e parâmetros para detecção de partículas
Citômetro de Fluxo Attune Nxt	ThermoFisher Scientific	N/A	Para análise de fluorescência em EVs
BD Fortessa Cell Analyzer	BD Biosciences	N/A	Para análise de fluorescência em células
Incubadora de cultura de células	N/A	N/A	Mantendo a temperatura de 37  ° C e 5% CO2Meio de
cultura celular	N/A	N/A	específico para a linhagem celular de
interesse Linha celular de interesse	N/A	N/A	Qualquer linhagem celular testada e avaliada quanto a EV e abundância celular de miRNAs de interesse.
MiRNA celular (miRNA miRIDIANO Mimic Red Transfection Control)	Descoberta de horizonte	CP-004500-01-05	miRNAs predeterminados para serem retidos pela linhagem celular de interesse e não exportados seletivamente para EVs
EV-miRNA (miRNAs conjugados com fluoróforo)	Tecnologias de DNA Integradas (IDT)		miRNAs predeterminados para serem classificados seletivamente em EVs
Microscópio de fluorescência	N/A	N/A
Gibco Opti-MEM Medium Reduced Serum Fisher	Scientific	31-985-070
Hausser Scientific Hemocytometer	Fisher	02-671-54
Hyclone 1x PBS (para cultura de células)	Fisher	SH30256FS
Lipofectamine RNAimax	Fisher Scientific	13-778-150
miRCURY LNA Transcriptase Reversa	Qiagen	339340
miRCURY LNA SYBR Green PCR	Qiagen
mirVana RNA Isolamento	Qiagen	AM1561
Água livre de nuclease	Fisher Scientific	4387936
Paraformaldeído, 4% em PBS	Fisher	AAJ61899AK
Reservatório de reagente não estéril	VWR	89094-684
Thermo ABI QuantiStudio DX PCR em tempo real	ThermoFisher Scientific	N/A
Tripsina 0,25%	Fisher
Ultracentrífuga	N/A	N/A