Avaliação do consumo de oxigênio mitocondrial usando um ensaio fluorescente baseado em leitor de placas

Summary

A avaliação do consumo de oxigênio fornece informações integrais sobre a função mitocondrial. Usando uma sonda fosforescente com um leitor de placa fluorescente, dados precisos e reprodutíveis podem ser obtidos facilmente sem equipamento especializado. Este ensaio permite que qualquer laboratório meça o consumo de oxigênio de mitocôndrias isoladas e calcule as taxas de controle respiratório.

Abstract

As mitocôndrias desempenham muitas funções importantes, incluindo respiração celular, produção de ATP, controle da apoptose e atuação como um hub central de vias metabólicas. Portanto, avaliar experimentalmente a funcionalidade mitocondrial pode fornecer informações sobre as variações entre diferentes populações ou estados de doença. Além disso, é valioso avaliar se as mitocôndrias isoladas são saudáveis o suficiente para prosseguir com os experimentos. Uma característica frequentemente usada para comparar a função mitocondrial em diferentes amostras é a taxa de consumo de oxigênio. O consumo de oxigênio e o cálculo subsequente da taxa de controle respiratório em células intactas ou mitocôndrias isoladas do tecido podem servir a todos os três propósitos. Usando mitocôndrias isoladas do fígado de lagartos em conjunto com uma sonda fosforescente sensível às flutuações na concentração de oxigênio de uma solução, medimos o consumo de oxigênio usando um leitor de placas fluorescentes. Este método não é apenas rápido e eficiente, mas também pode ser realizado com uma pequena quantidade de mitocôndrias e sem a necessidade de equipamentos especializados. O protocolo passo a passo descrito aqui aumenta a acessibilidade da avaliação funcional mitocondrial para os pesquisadores.

Introduction

As mitocôndrias são organelas, aproximadamente do tamanho de bactérias, encontradas em células eucarióticas. São organelas únicas porque contêm DNA e possuem duas membranas, uma externa e uma interna. As membranas externa e interna das mitocôndrias são separadas por um espaço intermembranar, e a membrana interna se dobra em estruturas chamadas cristas ao redor do compartimento mais interno, chamado de matriz. Essas cristas aumentam a área de superfície da membrana interna para que vários processos que usam as cristas possam ocorrer simultaneamente. Embora as mitocôndrias estejam envolvidas em muitas funções celulares, como controlar a apoptose e abrigar múltiplas vias metabólicas, seu papel vital na produção de ATP é essencial para a sobrevivência celular. Na verdade, 90% da energia de uma célula é derivada das mitocôndrias¹. A produção de ATP envolve a geração de uma diferença eletroquímica entre as membranas externa e interna, denominada potencial de membrana mitocondrial (Δψ), que surge quando os íons H⁺ são bombeados da matriz para o espaço intermembranar. A produção de ATP é finalmente aproveitada durante a oxidação de equivalentes redutores por meio do movimento de elétrons através da cadeia respiratória mitocondrial (ETC). O aceptor final de elétrons é o oxigênio molecular (O₂). À medida que o oxigênio é consumido, o diferencial de concentração de H⁺ aumenta até seu máximo, ponto em que os íons H⁺ descem seu gradiente de concentração do espaço intermembranar para a matriz, passando pelo complexo ATP sintase. O movimento dos íons H⁺ causa uma mudança conformacional na ATP sintase, e o ADP é aproximado do fosfato inorgânico para reagir e gerar ATP. Finalmente, o ATP é translocado da matriz mitocondrial para o citosol e pode ser armazenado ou usado para facilitar as reações devido à grande quantidade de energia livre liberada durante a hidrólise de seus fosfatos. Todo esse processo é denominado fosforilação oxidativa e, como o oxigênio é consumido, diz-se que as mitocôndrias respiram².

O acúmulo e a força de Δψ, a quantidade de O₂ reduzida (denominada consumo de oxigênio), bem como a geração de ATP, podem ser usados como indicações da saúde celular. Estudos funcionais mitocondriais, como medição de Δψ, conteúdo e produção total de ATP e consumo de oxigênio, podem ser quantificados por métodos bioquímicos tradicionais ou fluorescência e luminescência em ensaios baseados em placas. Por exemplo, o potencial da membrana mitocondrial pode ser comparado entre diferentes amostras usando corantes fluorescentes, como o éster etílico tetrametilrodamina, que se liga especificamente às mitocôndrias. A geração de ATP pode ser monitorada pela adição de uma proteína luminescente a uma reação cujas alterações se correlacionam com a concentração de ATP. A quantificação das taxas de consumo de oxigênio, ou taxas absolutas de respiração, durante o OXPHOS, pode ajudar a elucidar as causas das disparidades na função mitocondrial e no metabolismo energético. A avaliação do consumo de oxigênio pode ser usada para calcular as taxas de controle respiratório (RCRs). Os valores de RCR descrevem a capacidade das mitocôndrias de produzir ATP em resposta ao influxo de ADP, que é a principal função das mitocôndrias. Os valores de RCR significam a condição geral das mitocôndrias isoladas e permitem a comparação das respostas a diferentes tratamentos experimentais. As diferenças nos valores de RCR podem representar disfunção mitocondrial ou indicar uma diferença biológica entre diferentes mitocôndrias isoladas de duas ou mais fontes. Outra medida importante de função em mitocôndrias isoladas é a eficiência mitocondrial definida como moles de ATP sintetizados por moles de O₂, ou a relação P / O³.

Dada a quantidade de informações que podem ser coletadas a partir da medição de parâmetros mitocondriais e vários casos em que essas informações podem ser utilizadas, a capacidade de coletar dados funcionais com eficiência pode ser útil em muitas áreas de pesquisa diferentes. As medições do consumo de oxigênio mitocondrial são realizadas há décadas com instrumentação muito específica - usando um eletrodo de Clark, que pode ser limitado pelo tamanho da amostra necessária para realizar medições e, mais recentemente, instrumentos sofisticados que podem medir a respiração mitocondrial e vários outros parâmetros, mas podem ter um custo proibitivo. Este protocolo é uma abordagem alternativa adaptada usando uma sonda fosforescente sensível ao oxigênio (MitoXpress)^4,5. O sinal da sonda é detectado com um leitor de placas no modo de fluorescência resolvido no tempo para medições contínuas ao longo do tempo. A fosforescência tem uma diferença de energia maior entre o fóton absorvido e emitido em comparação com a fluorescência e, portanto, é mais adequada para monitorar continuamente as mudanças no sinal. Isso permite que quase todos os laboratórios realizem essas medições, não apenas aqueles que se concentram no metabolismo mitocondrial ou que podem pagar por equipamentos altamente especializados. O sistema modelo que utilizamos é mitocôndrias isoladas de três lagartos arbóreos, duas espécies parentais e uma introgressada (contendo DNA nuclear de uma espécie parental e mitocôndrias da outra - híbridos). Esses lagartos foram escolhidos porque hipotetizamos que há consequências metabólicas e energéticas para híbridos com diferentes fontes de DNA nuclear e mitocondrial. Utilizamos um kit de ensaio disponível comercialmente com um leitor de placas multimodo que pode aumentar o acesso a esse tipo de ensaio para mais pesquisadores e campos de pesquisa.

Protocol

Os lagartos foram sacrificados por asfixia por CO₂ seguida de decapitação imediata, de acordo com as políticas descritas pelo Escritório de Bem-Estar de Laboratórios Animais e pelas diretrizes do Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais de Elon.

1. Isolamento das mitocôndrias⁶

NOTA: Mantenha todas as soluções frias (Tabela 1) e as amostras no gelo durante essas etapas.

1. Remova o fígado, pese-o e enxágue-o com ~ 3 mL de solução salina tamponada com fosfato gelado (1x, -/-).
2. Pique o fígado em 1 mL de L-MIB com uma lâmina de barbear nova.
3. Traga o volume total de tecido mais L-MIB para 2 mL e interrompa mecanicamente as células do fígado por quatro passagens com um homogeneizador Dounce.
4. Centrifugar o homogeneizado a 300 × g (37 °C, 10 min).
5. Transfira o sobrenadante para um tubo novo e coloque-o no gelo.
6. Ressuspenda o pellet em 2 mL de L-MIB, homogeneize novamente e gire novamente a 300 × g (37 ° C, 10 minutos).
7. Combine os sobrenadantes de ambos os spins e centrifugue a 10.000 × g (37 °C, 10 min).
8. Ressuspenda o pellet em ~0,350 mL de L-MIB.
9. Determine a quantidade de proteína total (mg de mitocôndria / mL de L-MIB) para usar como uma aproximação para o conteúdo mitocondrial ^4,5,6.

2. Consumo de oxigênio

1. Pré-aqueça todas as soluções utilizadas (Tabela 1) nas etapas seguintes a 30 °C em banho-maria.
2. Diluir as mitocôndrias em LEB para 6 mg/ml com base nos resultados do ensaio de concentração de proteínas no passo 1.9.
3. Configure o ensaio em uma placa de fundo transparente de parede preta estéril de 96 poços (Tabela 2).
   1. Adicionar 50 μL da amostra (tampão L-EB ou amostra de mitocôndrias) aos alvéolos apropriados.
   2. Adicione 50 μL de tratamento (L-EB, glutamato / malato ou glutamato / malato com ADP).
   3. Dilua o estoque da sonda 1:10 em L-EB e, em seguida, adicione 100 μL da sonda fluorescente a cada poço.
   4. Adicione suavemente 50 μL de óleo mineral pesado a cada poço para excluir o oxigênio ambiente.
4. Leia as medições fluorescentes da parte inferior da placa a 380/650 nm de excitação/emissão a cada 1,5 min por 45 min. Use o modo cinético com um atraso de tempo de 30.000 μs e uma janela de medição de 100 μs.

3. Análise dos dados

1. Exporte o arquivo de dados brutos do computador leitor de placas como um arquivo .xls.
2. Abra o arquivo, copie e cole os dados brutos em uma nova guia e rotule as linhas e colunas adequadamente.
3. Plotar o tampão L-EB apenas para a amostra de controle e L-EB + G/M como unidades fluorescentes relativas (RFU) em função do tempo.
   NOTA: Essas linhas devem ser relativamente planas, pois não há mitocôndrias presentes e, portanto, nenhuma alteração na concentração de oxigênio deve ser detectada.
4. Plote os valores de amostra L-EB + G/M como RFU versus tempo.
5. Determine onde as leituras se tornam mais consistentes e se achatam para os controles.
   NOTA: É aqui que a análise de dados para amostras experimentais deve começar (marcada por setas na Figura 1A). As reações podem levar de 10 a 15 minutos para se achatar e atingir o máximo.
6. Faça um novo gráfico contendo apenas os dados após o ponto de tempo estabelecido na etapa 3.5 (chamados de dados "cortados") e adicione a linha de melhor ajuste para visualizar os dados brutos a serem analisados.
7. Calcule o valor médio de RFU dos dados somente de buffer de controle cortados (destacados em amarelo). Este valor é usado como o valor mínimo de RFU como linha de base no cálculo de oxigênio abaixo.
8. Cálculo da taxa de consumo de oxigênio (μM O₂/min)
   1. Copie e cole a região linear dos dados brutos da etapa 3.6 (ou seja, os dados aparados) para determinar a concentração de oxigênio nas amostras mitocondriais no tratamento G / M + ADP em cada ponto de tempo 7,8,9,10.
   2. Use a equação (1)⁵ para determinar a concentração de oxigênio em cada ponto de tempo. [O₂]_a é a concentração de oxigénio em tampão saturado de ar (235 mM a 30 °C). I(t), Ia e Io são o sinal fluorescente da amostra + sonda no tempo t (por exemplo, amostra + G/M + ADP), o sinal médio da sonda em tampão saturado de ar calculado na etapa 3.7 e o sinal máximo em tampão desoxigenado (definido no sinal máximo alcançável), respectivamente.
      Características (1)
   3. Plote os valores de [O₂]_t calculados na etapa 3.8.2 em relação ao tempo e adicione uma linha de tendência linear junto com a equação da linha de melhor ajuste.
      NOTA: Use a inclinação de cada linha como a taxa de consumo de oxigênio. Duplicatas ou triplicatas para qualquer amostra podem ser agregadas e usadas para a comparação da taxa de consumo.
9. Calcule o RCR dividindo a respiração mitocondrial com e sem ADP, que representam os estados 3 e 2, respectivamente.

Results

A taxa de consumo de oxigênio e a RCR mitocondrial foram determinadas a partir das mitocôndrias de três lagartos diferentes usando um kit de ensaio com uma sonda de detecção de oxigênio fosforescente e um leitor de placa de fluorescência padrão. Pesquisas anteriores estabeleceram que a sonda neste kit se correlaciona diretamente com o consumo de oxigênio, onde a fosforescência é extinta pelo oxigênio molecular e o sinal fluorescente aumenta à medida que os níveis de oxigênio diminuem devido à respiração mitocondrial ^7,11. Os valores de RFU são registrados ao longo do tempo para amostras de controle e experimentais e depois analisados. As leituras de RFU para poços de controle (somente tampão, tampão tratado com glutamato / malato e tampão tratado com glutamato / malato + ADP) foram plotadas em relação ao tempo para estabelecer que quaisquer alterações na fluorescência em poços de amostra experimentais são devidas à presença de mitocôndrias. Além disso, o controle glutamato/malato + ADP permite a quantidade basal de oxigênio durante a coleta de dados. Amostras experimentais contendo mitocôndrias isoladas também foram plotadas no mesmo gráfico que os controles.

A Figura 1A demonstra que as RFUs aumentam ao longo do tempo a partir de uma amostra de mitocôndrias isoladas, em oposição aos valores relativamente planos de RFU dos controles. Como as reações levam tempo para se equilibrar, as primeiras 10 leituras, até que as leituras da amostra de controle não sejam tão ruidosas e niveladas, são removidas do conjunto de dados (Tabela Suplementar S1 e Figura Suplementar S1). Em seguida, os valores restantes da amostra de mitocôndrias tratada com glutamato / malato + ADP são transformados na concentração de oxigênio em cada ponto de tempo usando a equação (1) (consulte a etapa 3.2 do protocolo) e, em seguida, plotados em relação ao tempo. A Figura 1B mostra o resultado da amostra experimental vista na Figura 1A (cruzes) onde o valor de R² é muito próximo de 1 e a inclinação da linha pode ser calculada. A inclinação da linha é negativa porque, à medida que o oxigênio é consumido, a concentração total de oxigênio nessa amostra diminui. Este mesmo processo é repetido para as mesmas amostras mitocondriais tratadas com glutamato/malato sem ADP para obter taxas de consumo de oxigênio (Tabela Suplementar S2 e Figura Suplementar S2). Em seguida, a respiração mitocondrial com e sem ADP, que representam os estados 3 e 2, respectivamente, pode ser usada para calcular o RCR para cada tipo de amostra (Figura Suplementar S2). Quando comparado lado a lado e, a RCR média entre os três tipos diferentes de lagartos arbóreos indica que a RCR do híbrido com mitocôndrias introgessadas é significativamente menor do que a de qualquer tipo parental (Figura 1C). As mitocôndrias de lagartos híbridos tiveram taxas de consumo de oxigênio intermediárias para os dois tipos parentais (Figura 2).

Figura 1: Exemplo de resultados de ensaio de consumo de oxigênio. (A) Dados brutos de reações de controle somente tampão e reações incluindo mitocôndrias isoladas que foram tratadas com glutamato e malato (G / M), com ou sem adição de ADP. A fluorescência foi monitorada ao longo do tempo. À medida que o oxigênio é consumido, a fluorescência aumenta. As reações somente tampão (G/M, indicadas por círculos, e G/M + ADP, indicadas por triângulos) e mitocôndrias com tratamento G/M (indicadas por quadrados) não apresentaram alterações. As mitocôndrias tratadas com G / M + ADP (indicado por sinais positivos) consumiram oxigênio. (B) Mudanças na concentração de oxigênio ao longo do tempo calculadas a partir dos dados brutos para mitocôndrias tratadas com G / M + ADP apresentados em A. (C) Valores RCR para mitocôndrias de três tipos diferentes de lagartos medidos à temperatura ambiente. Esta figura é reproduzida de Haenel e Del Gaizo Moore¹². A análise estatística foi realizada por meio de ANOVAs em R. Abreviaturas: G = glutamato; M = malato; RCR = razão de controle respiratório. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2: Taxas de consumo de oxigênio das mitocôndrias de três tipos de lagartos. Os boxplots mostram as taxas médias de consumo de oxigênio como uma barra e as médias como um ponto. Os tipos parentais, Urosaurus graciosus e Urosaurus ornatus, foram significativamente diferentes entre si. A forma introgressada (Híbrida) era intermediária em relação aos tipos parentais e não significativamente diferente de nenhum deles. Esta figura é reproduzida de Haenel e Del Gaizo Moore¹². Abreviaturas: Ug= Urosaurus graciosus; Uo = Urosaurus ornatus. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Tabela 1: Composição das soluções utilizadas no protocolo. Clique aqui para baixar esta tabela.

Tabela 2: Mapa de placas para ensaio de consumo de oxigênio. Para cada amostra, reserve pelo menos 6 poços (3 poços de controle: apenas L-EB, L-EB com tratamento G/M, L-EB com tratamento G/M + ADP; 3 poços/amostras experimentais: mitocôndrias com tratamento L-EB, L-EB + G/M e L-EB G/M + tratamento ADP). Quando possível, execute cada amostra experimental em duplicata ou triplicada. Abreviaturas: G = glutamato; M = malato; L-EB = tampão experimental específico para lagartos. Clique aqui para baixar esta tabela.

Figura Suplementar S1: Gráficos de dados. (A) Gráfico de todos os dados brutos para comparação de amostras e controles. (B) Gráfico dos dados brutos com bordas das colunas destacadas na Tabela Suplementar S1, demonstrando que apenas os poços que continham amostras de mitocôndrias tiveram um aumento apreciável nas RFUs. Clique aqui para baixar este arquivo.

Figura Suplementar S2: Consumo de oxigênio e taxas de controle respiratório. (A) Gráfico dos dados de consumo de oxigênio da Tabela Suplementar S1 para determinar os valores do Estado 2 e do Estado 3, encontrando as equações das linhas de melhor ajuste. (B) Cálculo da razão RCR usando as inclinações das linhas em (A), que representam o Estado 2 e o Estado 3. Clique aqui para baixar este arquivo.

Tabela Suplementar S1: Exemplo representativo de dados brutos. Colunas destacadas são dados usados para figuras e cálculos (ou seja, dados cortados). Clique aqui para baixar este arquivo.

Tabela Suplementar S2: Exemplo representativo de dados aparados e cálculos subsequentes de consumo de oxigênio. Clique aqui para baixar este arquivo.

Discussion

Medir a função mitocondrial é útil ao comparar diferentes amostras, como estados de doença versus não doença, diferentes tipos de tecido do mesmo animal ou entre diferentes tipos de amostra. Usamos a comparação posterior para testar nossa hipótese de que há uma consequência metabólica para lagartos híbridos que têm mitocôndrias introgessadas. Existem várias maneiras de determinar a função das mitocôndrias experimentalmente, incluindo quantificação de Δψ, conteúdo total de ATP, produção de ATP e controle respiratório e taxa de consumo de oxigênio. As medições do consumo de oxigênio de mitocôndrias isoladas podem ser realizadas com equipamentos especializados, como um eletrodo de Clark ou os mais sofisticados Seahorse XFs. No entanto, esses métodos podem ser limitantes pelo tamanho da amostra necessária para realizar as medições ou proibitivos em termos de custo. Os leitores de placas multimodo que podem ler fluorescência tornaram-se um equipamento padrão em laboratórios de biologia celular e bioquímica. Assim, uma abordagem alternativa para analisar quantitativamente o consumo de oxigênio mitocondrial é usar um kit disponível comercialmente com um leitor de placa fluorescente. Este protocolo passo a passo descreve como medir o consumo de oxigênio, bem como realizar os cálculos. e economicamente em mitocôndrias isoladas. Medir com precisão a capacidade das mitocôndrias de produzir ATP quando fornecidas com ADP, conhecida como respiração de Estado 3, permite a comparação direta de OXPHOS entre amostras e as diferenças podem significar disparidades funcionais. Além disso, a respiração do Estado 3 também indica a qualidade das mitocôndrias que foram isoladas, o que pode determinar se um procedimento de isolamento funcionou e/ou se a amostra é boa o suficiente para ser usada em outros ensaios. Os valores de RCR, que são calculados usando os valores de Estado 2 (glutamato e malato apenas, para construir Δψ) e Estado 3 (glutamato e malato mais ADP, para permitir que Δψ seja usado para a produção de ATP), fornecem mais uma informação para comparação e sobre a saúde das mitocôndrias isoladas. Os dados apresentados demonstram que o método oferecido neste artigo pode ajudar a decifrar variações entre diferentes tipos de amostra e medir taxas de consumo de oxigênio e valores de RCR sem a necessidade de equipamentos altamente especializados, tornando esses tipos de medição mais acessíveis.

Neste protocolo, isolamos recentemente as mitocôndrias de lagartos, e o consumo de oxigênio foi determinado usando um ensaio MitoXpress Xtra Hs seguindo o protocolo do fabricante e modificado de acordo com Hynes et ^al.4 e Will et ^al.5 Os lagartos variaram de 3,3 g a 5,1 g de massa corporal total com uma média de 0,170 g de tecido hepático/lagarto, que rendeu ~ 0,350 mL de mitocôndrias concentradas e brutas. As mitocôndrias isoladas foram utilizadas no ensaio de consumo de oxigênio a 6 mg/mL de proteína. Se a concentração de proteína mitocondrial, conforme determinado na etapa 1.7 do protocolo, for baixa, a amostra pode ser girada novamente a 10.000 × g e o pellet ressuspenso em um volume menor de L-MIB. Também deve ser observado que usamos com sucesso apenas 4 mg / mL para pequenas amostras de fígado ou quando a totalidade do fígado não estava disponível.

Para assegurar o equilíbrio entre os gases e a temperatura das amostras no início do ensaio, todas as soluções utilizadas na secção 2 do protocolo devem ser pré-aquecidas a 30 °C em banho-maria. Na seção 3 do protocolo, as taxas de variação do oxigênio dissolvido (mM/min) são extrapoladas a partir das inclinações iniciais dos perfis de concentração decrescente de oxigênio para cada amostra (etapa 3.3 do protocolo; Tabela Suplementar S1 e Figura Suplementar S1). A amostra + taxas de tratamento G/M representam a respiração mitocondrial do Estado 2, enquanto a amostra com taxas de tratamento G/M + ADP representa a respiração mitocondrial do Estado 3. Assim, os RCRs são calculados para cada amostra dividindo os valores do estado 3 pelos valores do estado 2 para cada amostra (Tabela Suplementar S2).

O consumo de oxigênio pode ser comparado entre amostras únicas, conforme demonstrado aqui, ou entre diferentes tratamentos em uma amostra. Neste último caso, podem ser necessários controlos adicionais, tais como o controlo apenas do veículo com e sem mitocôndrias, para excluir a possibilidade de o próprio tratamento químico não interagir com a sonda fosforescente. Além disso, os dados de consumo de oxigênio e RCR coletados podem ser usados em conjunto com os dados coletados das mesmas amostras com outros ensaios. Uma vez que as mitocôndrias são isoladas, elas podem ser utilizadas em vários ensaios para fornecer uma imagem mais completa de sua função¹². A medição de Δψ, o conteúdo total de ATP e a taxa de renovação de ATP são alguns dos ensaios que foram combinados. Além disso, o uso de inibidores de ETC, OXPHOS e ATP sintase com os ensaios fornece uma compreensão ainda mais completa dos diferentes tipos de amostras mitocondriais, fortalecendo quaisquer conclusões tiradas dos dados gerados.

Outro parâmetro que pode ser medido em mitocôndrias isoladas é a eficiência mitocondrial, que é definida como a relação P/O de moles de ATP sintetizado por mol de O₂³. As relações P / O podem ser calculadas em uma extensão deste protocolo, permitindo que as mitocôndrias do Estado 3 esgotem o ADP fornecido na reação e, em seguida, adicionando uma alíquota do substrato ADP seguida pela inibição da ATP sintase pela adição de oligomicina. Essas etapas adicionais permitem o cálculo do Estado 4, que ocorre quando as mitocôndrias continuam a consumir oxigênio e mantêm um forte Δψ para produzir ATP máximo, fornecem informações sobre o vazamento das mitocôndrias (se os íons H⁺ estão cruzando de volta para a matriz sem o uso da ATP sintase e, portanto, dissipando Δψ), indicando disfunção mitocondrial. Além disso, as medições do Estado 4 também podem revelar se o translocador ADP / ATP, que move o ATP recém-formado da matriz e, ao mesmo tempo, traz substrato ADP, está funcional e se está ocorrendo algum vazamento de ADP e ATP através das membranas. A adição de oligomicina, que inibe a ATP sintase, é um controle para determinar se as mitocôndrias estão vazando devido à disfunção real. Embora a medição do Estado 4 para que a relação P/O pudesse ser calculada estivesse além do escopo das informações que buscamos para comparação entre os três tipos de amostras mitocondriais, é outro dado sobre a função mitocondrial e poderia ser feito como uma extensão deste protocolo. Finalmente, vale a pena notar que as mitocôndrias podem ser isoladas de células em cultura e diferentes tecidos de um camundongo ou rato (por exemplo, fígado, coração, medula espinhal), entre outros. Ajustes nas formulações MIB e EB, bem como nos protocolos de isolamento, podem ser necessários 4,13,14,15,16. Além disso, de acordo com as instruções do fabricante, este ensaio pode ser realizado com células inteiras e intactas. Portanto, o método apresentado não se limita a lagartos ou mitocôndrias hepáticas, permitindo que seja adequado a uma ampla gama de modelos experimentais em muitas subdisciplinas científicas diferentes.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Placas de fundo pretas/ópticas de 96 poços	Thermo Fisher	265301	Placas de parede preta não tratadas com fundos transparentes.
ADP	Sigma	A2754	Dilute 100 µ Estoque M com EB imediatamente antes do uso.
BSA	Thermo Fisher	BP1600-100	Faça estoque de 2 mg / mL em água para ensaio de proteína.
Dulbeccos 1x PBS (-/-)	Sigma	D8537	Certifique-se de que o PBS esteja sem íons Mg2+ ou Ca2+.
EGTA	Sigma	E3889
K2HPO4	Sigma	P3786
KH2PO4	Sigma	P0662
Ácido L-glutâmico	Sigma	G1251
Sal de potássio de ácido L-glutâmico	Sigma	S372226
Ácido L-málico	Sigma	M8304
Sal monopotássico de ácido L-málico	Sigma	49601
MitoXpress	O kit Agilent	MX-200-4	contém estoque de sonda e óleo mineral HS.
MOPS	Sigma	M3183
Protien Assay Dye (5x)	BioRad	500-0006	Qualquer ensaio de proteína pode substituir.
R versão 3.3	R Core Development Team 2016
Leitor de microplacas Thermomax EnSpire Leitor de placas multimodo e software	PerkinElmer		Leitor de placas fluorescentes padrão
Base Trisma	Sigma	T6066	Qualquer versão da base Tris pode ser utilizada.