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Isolamento, Cultura e Caracterização de Células-Tronco da Polpa Dentária de Dentes Humanos Decíduos e Permanentes

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DOI:

10.3791/65767

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17 de maio de 2024

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Dentistry, Oral Health Institute, Hamad Medical Corporation, 2Pushpagiri Institute of Medical Sciences and Research Centre, 3Saveetha Dental College, Saveetha Institute of Medical and Technical Sciences, 4College of Applied Medical Sciences, King Saud University

Neste artigo

Resumo

Este protocolo enfatiza a extração, cultura e preservação de células-tronco multipotentes da polpa dentária por meio da digestão enzimática. Além disso, demonstra seu potencial de diferenciação em osteoblastos, adipócitos e condrócitos, destacando a importância da precisão e consistência no processo.

Resumo

No campo da medicina regenerativa e aplicações terapêuticas, a pesquisa com células-tronco está ganhando força rapidamente. As células-tronco da polpa dentária (DPSCs), que estão presentes nos dentes decíduos e permanentes, surgiram como uma fonte vital de células-tronco devido à sua acessibilidade, adaptabilidade e capacidade de diferenciação inata. As DPSCs oferecem um reservatório abundante e prontamente disponível de células-tronco mesenquimais, apresentando versatilidade e potencial impressionantes, principalmente para fins regenerativos. Apesar de sua promessa, o principal obstáculo está em isolar e caracterizar efetivamente as DPSCs, dada sua representação como uma fração minúscula dentro das células da polpa dentária. Igualmente crucial é a preservação adequada desse inestimável recurso celular. Os dois métodos predominantes para isolamento de DPSC são a digestão enzimática (ED) e o crescimento de explantes de tecido (OG), muitas vezes chamados de crescimento espontâneo. Este protocolo concentra-se principalmente na abordagem de digestão enzimática para isolamento de DPSC, detalhando intrincadamente as etapas que abrangem extração, processamento em laboratório e preservação celular. Além da extração e preservação, o protocolo investiga as proezas de diferenciação das DPSCs. Especificamente, descreve os procedimentos empregados para induzir essas células-tronco a se diferenciarem em adipócitos, osteoblastos e condrócitos, mostrando seus atributos multipotentes. A utilização subsequente de técnicas de coloração colorimétrica facilita a visualização precisa e a confirmação da diferenciação bem-sucedida, validando assim o calibre e a funcionalidade das DPSCs isoladas. Este protocolo abrangente funciona como um modelo que abrange todo o espectro de extração, cultivo, preservação e caracterização de células-tronco da polpa dentária. Ele ressalta o potencial substancial abrigado pelas DPSCs, impulsionando a exploração de células-tronco e prometendo futuros avanços regenerativos e terapêuticos.

Introdução

A pesquisa com células-tronco floresceu na ciência biomédica devido às suas aplicações promissoras em medicina regenerativa e engenharia de tecidos. As células-tronco da polpa dentária (DPSCs), derivadas do tecido pulpar de dentes decíduos e permanentes humanos, têm atraído interesse significativo como fonte de células-tronco devido à sua pronta disponibilidade e capacidade multipotente 1,2. Essas células têm o potencial de se diferenciar em vários tipos de células, incluindo adipócitos, osteoblastos e condrócitos, conforme confirmado por vários estudos3.

Nas últimas décadas, a pesquisa e as aplicações terapêuticas de células-tronco aumentaram. O potencial expansivo das células-tronco exige a diversificação das fontes de onde são obtidas. Vários fatores influenciam a eficiência, viabilidade e estaminalidade das células escolhidas. Apesar da existência de vários reservatórios de células-tronco conhecidos, como medula óssea e tecidos adiposos, os procedimentos invasivos, a morbidade do local e as preocupações éticas ligadas a essas fontes muitas vezes limitam sua exploração 4,5. Dentre as várias fontes de células-tronco, as células-tronco dentárias têm ganhado atenção devido à sua fácil acessibilidade, alta plasticidade e diversas aplicações potenciais. As células-tronco da polpa dentária humana, em particular, têm sido extensivamente pesquisadas por suas perspectivas terapêuticas6. Os dentes, comumente descartados como resíduos médicos, contêm uma grande quantidade de células-tronco mesenquimais7. Proteger esse valioso pool de células-tronco requer esforços coletivos de pacientes, dentistas e médicos para garantir que esses recursos não sejam desperdiçados, tornando cada célula-tronco da polpa dentária disponível para futuras necessidades regenerativas.

As células-tronco derivadas da polpa dentária, como células-tronco da polpa dentária adulta humana (DPSCs) e células-tronco de dentes decíduos humanos esfoliados (SHED), estão localizadas no nicho perivascular da polpa dentária. Acredita-se que essas células se originem de células da crista neural craniana e exibam marcadores precoces para células-tronco mesenquimais (MSCs) e células-tronco neuroectodérmicas. DPSCs e SHEDs demonstraram multipotência e capacidade de regenerar diversos tipos de tecidos8.

As fontes potenciais de células-tronco dentárias abrangem dentes decíduos e permanentes saudáveis. As células-tronco constituem apenas cerca de 1% da população total de células na polpa, destacando a importância de técnicas eficazes de isolamento e expansão9. Consequentemente, a extração e expansão dessas células-tronco são etapas fundamentais no isolamento do DPSC10. Os dentes extraídos ou esfoliados precisam ser armazenados em um meio de transporte rico em nutrientes, como solução salina tamponada com fosfato (PBS) ou solução salina tamponada com Hanks (HBSS).

A obtenção da polpa dentária pode ser obtida por meio de vários métodos, dependendo do tipo de dente 7,11. Para dentes decíduos com raízes reabsorvidas, a extração pode ser realizada através do ápice radicular. Da mesma forma, brochas farpadas estéreis podem ser usadas para obter polpa de dentes permanentes com ápice aberto imaturo. Nos casos de dentes permanentes com raízes totalmente desenvolvidas, o acesso à câmara pulpar envolve a separação da coroa dentária da raiz. Isso é feito cortando o dente usando um disco de diamante na junção cemento-esmalte. Essa incisão expõe a câmara pulpar, possibilitando a recuperação do tecido pulpar 12,13,14.

As células-tronco da polpa dentária (DPSCs) podem ser isoladas por digestão enzimática (DE) ou crescimento a partir de explantes teciduais (GO), também conhecido como crescimento espontâneo. O método DE emprega enzimas, principalmente colagenase I e dispase, para quebrar o tecido em suspensões unicelulares15,16. O método OG, mais simples e rápido, consiste em cortar os fragmentos de polpa e colocá-los diretamente em uma placa de cultura, permitindo que as células cresçam a partir dos explantes de tecido17. Os pesquisadores utilizaram e compararam ambas as técnicas para avaliar as taxas de proliferação celular, preservação de propriedades de células-tronco isoladas, diferenciação e expressão de marcadores de superfície18. O estabelecimento e padronização de protocolos para aquisição de CPDP com alta eficiência e estaminalidade pode abrir caminho para terapias eficazes e seguras19. Este protocolo abrange a extração de DPSCs usando digestão enzimática, processamento em laboratório, preservação e diferenciação celular com coloração colorimétrica para adipogênese, osteogênese e condrogênese.

O protocolo descrito neste artigo apresenta um procedimento passo a passo, iniciando-se com o isolamento inicial da polpa dentária do dente, seguido de cultura e manutenção das DPSCs em laboratório, e concluindo com sua caracterização usando marcadores específicos de células-tronco (Figura 1). As técnicas de indução dessas células-tronco em diferentes linhagens celulares, destacando sua multipotência, também são descritas.

Protocolo

O protocolo aqui descrito está em conformidade com as diretrizes do comitê institucional de ética em pesquisa com seres humanos (IRB, Pushpagiri Research Center, Kerala). O uso de dentes extraídos foi realizado seguindo padrões éticos para garantir a integridade, dignidade e direitos dos participantes. Os participantes selecionados para este estudo foram indivíduos saudáveis com menos de 30 anos de idade que necessitaram de exodontia para tratamento ortodôntico. Aqueles com cárie dentária extensa ou periodontite grave foram excluídos do estudo. Foram coletados dentes decíduos de crianças que necessitaram da extração de dentes retidos. O consentimento informado por escrito também foi obtido dos sujeitos envolvidos neste estudo.

1. Extração e transporte de dentes

  1. Coleta de dentes decíduos e permanentes
    1. Explique aos participantes o objetivo do procedimento e o potencial uso dos dentes extraídos para fins de pesquisa.
    2. Realize a extração dos dentes sob anestesia local, administrando um agente anestésico nas proximidades do dente a ser extraído. Especificamente, 1,75 mL de lidocaína misturada com epinefrina (ver Tabela de Materiais) na proporção de 1:200.000 foi injetada para este estudo. A seleção de dentes que não apresentem cárie dentária grave ou periodontite é preferível20,21.
  2. Transporte dos dentes extraídos
    NOTA: Recomenda-se trabalhar em condições assépticas para evitar contaminação. Isso inclui o uso de equipamentos de proteção individual, como luvas e jaleco, e o trabalho em um ambiente estéril, como uma capa de fluxo laminar de risco biológico.
    1. Depois que o dente for extraído, enxágue-o com solução salina estéril tamponada com fosfato (PBS) para remover o sangue e outros detritos. Usando uma pinça estéril e bisturi, remova cuidadosamente quaisquer restos de tecido mole da superfície do dente (Figura 2A).
    2. Mergulhe o dente em uma solução desinfetante, como etanol a 70%, por 10 s. Após a desinfecção, enxágue o dente com PBS estéril para remover qualquer desinfetante residual.
    3. Coloque o dente em um recipiente estéril contendo o meio de transporte.
      NOTA: O meio de transporte consistia em Alpha-MEM, um meio de cultura comercial suplementado com antibióticos: 100 U / mL de penicilina / estreptomicina (ver Tabela de Materiais). Este meio forneceu nutrientes essenciais às células dentro do dente extraído, garantindo sua sobrevivência até o processamento laboratorial. Os antibióticos serviram para inibir o crescimento bacteriano.
    4. Mantenha uma temperatura de 4 °C durante o transporte para retardar as atividades metabólicas celulares e retardar a morte celular. Transporte o dente para o laboratório para as próximas etapas, incluindo o processamento e isolamento das células-tronco da polpa dentária.

2. Coleta de tecido pulpar

  1. Prenda o dente usando uma pinça dentária para garantir que ele permaneça no lugar durante o procedimento. Use um disco diamantado para cortar o dente em uma peça de mão odontológica (consulte a Tabela de Materiais) conectada a um refrigerante de água (Figura 2B).
    NOTA: O objetivo é expor a câmara pulpar sem causar danos desnecessários ao tecido pulpar interno.
  2. Utilize uma escavadeira odontológica (consulte a Tabela de Materiais) para remover o tecido pulpar. Este instrumento permite a extração da polpa sem causar danos, preservando assim a viabilidade das células-tronco da polpa dentária (Figura 2C).
  3. Coloque o tecido obtido em uma placa de Petri de vidro. Lave o tecido pulpar com solução salina tamponada com fosfato.

3. Digestão do tecido pulpar e isolamento celular

  1. Trituração e digestão de tecidos
    1. Com uma lâmina cirúrgica estéril, pique cuidadosamente o tecido pulpar em pequenos fragmentos (Figura 2D) e coloque-o em um mini moedor de lenços de papel com PBS para obter uma mistura finamente homogeneizada. Esse processo aumenta a área de superfície do tecido, facilitando a ação enzimática mais eficiente durante a digestão.
    2. Transfira os fragmentos de tecido homogêneo picados para um tubo de 15 mL e digerir enzimaticamente utilizando uma mistura de 3 mg / mL de colagenase tipo I e 4 mg / mL de dispase (ver Tabela de Materiais). Essas enzimas foram dissolvidas na Solução Saleira Balanceada de Hank (HBSS) para atingir as concentrações desejadas.
    3. Incubar o tecido pulpar na mistura enzimática (etapa 3.1.2) durante cerca de 2 h a 37 °C. Após a incubação, neutralizar as enzimas e recolher as células por centrifugação (passo 3.2.1) para posterior cultura.
  2. Centrifugação e ressuspensão
    1. Após a incubação, transfira o tecido digerido para um tubo de centrífuga de 15 mL e gire a 300 x g por 5 min em temperatura ambiente para pellet as células. Esta etapa separa as células dos fragmentos de tecido e enzimas não digeridos restantes. Descarte cuidadosamente o meio sobrenadante, certificando-se de não perturbar o pellet celular no fundo do tubo.
    2. Ressuspenda o pellet celular em um meio de cultura fresco. Este meio fornece os nutrientes e o ambiente necessários para que as células isoladas sobrevivam e proliferem.

4. Cultura celular

  1. Plaqueamento e incubação de células
    1. Transferir cuidadosamente as células ressuspensas para um balão de cultura de 25 cm².
      NOTA: Todo o material de uma única polpa é transferido para um único balão de cultura de2 células de 25 cm. Um volume de mídia de 5-7 mL garante cobertura suficiente e disponibilidade de nutrientes para as células. Certifique-se de que o meio de cultura para DPSCs seja o Meio de Águia Modificado (DMEM) de Dulbecco, suplementado com 10% -20% de soro fetal bovino (FBS) (consulte a Tabela de Materiais) para fornecer os fatores de crescimento necessários. Além disso, suplemente o meio com penicilina / estreptomicina a 1% para evitar a contaminação bacteriana. Certifique-se de que as células estejam uniformemente distribuídas por todo o frasco para promover um crescimento homogêneo.
    2. Incubar o balão a 37 °C numa atmosfera contendo 5% de CO2.
  2. Mudança média e monitoramento da confluência
    1. Troque o meio de cultura a cada 2-3 dias para fornecer nutrientes frescos e remover resíduos metabólicos. Para fazer isso, aspire cuidadosamente o meio antigo usando uma pipeta sorológica estéril e substitua-o por um meio novo.
    2. Monitore regularmente a cultura de células ao microscópio para rastrear o crescimento das células e verificar se há sinais de contaminação.
    3. Continue esse processo até que as células atinjam 80% -90% de confluência, o ponto em que as células cobrem a maior parte da área de superfície do frasco, mas não estão excessivamente lotadas.
  3. Tripsinização celular e passagem ou congelamento
    1. Quando as células atingirem 80% -90% de confluência, remova o meio de cultura e lave as células com solução salina tamponada com fosfato (PBS) para remover o meio residual e as células não aderentes.
    2. Adicione uma solução de tripsina-EDTA a 0,25% ao frasco para separar as células da superfície do frasco. Incubar durante 2-5 min a 37 °C até as células levantarem.
    3. Neutralize a tripsina adicionando um volume igual de meio de cultura e, em seguida, pipete suavemente a suspensão celular para cima e para baixo para garantir o descolamento celular completo.
    4. Centrifugue a suspensão da célula a 300 x g por 5 min em temperatura ambiente para pellet as células.
    5. Ressuspenda as células em um meio de cultura fresco e coloque-as novamente em placas (passagem) para crescimento adicional ou congele-as para uso futuro. Ao congelar, use um meio de congelamento que contenha um crioprotetor, como o DMSO, para proteger as células contra danos durante o congelamento.

5. Caracterização das DPSCs

  1. Análise de citometria de fluxo
    1. Para confirmar a natureza das células-tronco mesenquimais das células isoladas, realize a análise de citometria de fluxo22,23. Inicialmente, tripsinize e colete células conforme descrito na etapa 4.3.
    2. Determine a viabilidade celular pela técnica de exclusão do corante tripano. Realize a análise usando um analisador de viabilidade celular (consulte a Tabela de Materiais) durante a2ª e8ª passagens. Realize a análise fenotípica por meio de um citômetro de fluxo durante a3ª e7ª passagens.
    3. Após a incubação, lave as células em um tampão de citometria de fluxo para remover o excesso de anticorpos e analise as células usando um citômetro de fluxo.
      NOTA: O tampão de citometria de fluxo é composto por solução salina tamponada com fosfato (1x PBS), 1%-2% de soro fetal bovino (FBS) e 0,1% de azida sódica (NaN3). O FBS ou BSA bloqueia a ligação não específica de anticorpos, enquanto a azida de sódio atua como conservante. Uma alta porcentagem de células deve expressar os marcadores de células-tronco mesenquimais e não possui os marcadores hematopoiéticos, confirmando sua identidade como DPSCs24.
    4. Separe as DPSCs e comode-as com anticorpos de imunofluorescência para análise de citometria de fluxo.
      NOTA: A seleção de marcadores para análise por citometria de fluxo de células-tronco mesenquimais (CTMs) é baseada no consenso estabelecido pela International Society for Cellular Therapy (ISCT), que afirma que as CTMs devem expressar CD105, CD73 e CD90, e não ter a expressão de CD45, CD34, CD14 ou CD11b, CD79a ou CD19 e HLA classe II25. Esses marcadores são comumente utilizados em estudos que investigam células-tronco da polpa dentária26. As concentrações de anticorpos para coloração podem variar dependendo do anticorpo específico usado, e recomenda-se seguir as instruções do fabricante (consulte a Tabela de Materiais) para diluições de anticorpos e condições de incubação25.
    5. Estabelecer os critérios de classificação 27,28 para a expressão dos marcadores DC mencionados: menos de 10%, sem expressão; entre 11% e 40%, baixa expressão; uma variação de 41% a 70%, expressão moderada; acima de 71%, alta expressão.
    6. Além disso, confirme a ausência de marcadores hematopoiéticos incubando uma alíquota celular separada com anticorpos contra CD34 e CD45.

6. Diferenciação de várias linhagens

NOTA: As etapas a seguir descrevem protocolos para diferenciação osteogênica, adipogênica e condrogênica de células-tronco dentárias. Comece semeando culturas a uma densidade de 1 x 10,5 células por poço em uma placa de cultura de tecidos revestida com fibronectina com meio completo (CM). Monitore o crescimento celular até que 80% -90% de confluência seja alcançada antes de iniciar o protocolo de diferenciação desejado. Para avaliar o potencial de diferenciação multilinhagem das DPSCs, inicie o processo de diferenciação em direção a osteoblastos, adipócitos e condrócitos semeando células em placas de 24 poços e cultivando-as em meios de diferenciação apropriados.

  1. Diferenciação osteogênica
    1. Inicie cultivando DPSCs em um meio de crescimento regular sob condições padrão até que atinjam 70% -80% de confluência.
    2. Remova o meio de crescimento das células e, em seguida, lave as células uma vez com 1x PBS. Adicione o Meio de Diferenciação Osteogênica (ODM) às células.
      NOTA: O ODM consiste em meio essencial mínimo alfa (α-MEM) suplementado com 10% de FBS, 100 unidades/mL de penicilina, 100 μg/mL de estreptomicina, 0,25 μg/mL de anfotericina B, 50 μg/mL de ácido ascórbico, 10 mM de beta-glicerofosfato e 100 nM de dexametasona (ver Tabela de Materiais).
    3. Incubar as células no meio osteogênico a 37 ° C com 5% de CO2. Troque o meio osteogênico a cada 2-3 dias.
      NOTA: Após 14 a 21 dias, as DPSCs devem ter se diferenciado em células semelhantes a osteoblastos. Isso pode ser confirmado verificando se há um aumento na expressão de marcadores específicos para osteoblastos, como a fosfatase alcalina, ou usando técnicas de coloração para detectar matriz mineralizada, como a coloração com vermelho de alizarina S.
    4. Fixe as células incubando-as com etanol gelado a 70% por 1 h a -20 °C.
    5. Manchar as células fixas com solução de coloração 40 nM Alizarin Red S (pH 4,2) à temperatura ambiente no escuro por 10-15 min. Visualize a coloração ao microscópio para confirmar a diferenciação osteogênica (Figura 3). Confirmar a diferenciação colorando as células com Vermelho de Alizarina S, que identifica depósitos de cálcio indicativos de mineralização29,30.
  2. Diferenciação adipogênica
    1. Conforme detalhado na seção anterior, cultive DPSCs em condições padrão em uma atmosfera umidificada com 5% de CO2 a 37 °C. Passe as células quando atingirem cerca de 70% -80% de confluência.
    2. Aspire o meio e lave as células uma vez com 1x PBS. Substitua o meio lavado por meio de diferenciação adipogênica. Este meio geralmente consiste em DMEM, 10% FBS, 10 μg / mL de insulina, 1 μM de dexametasona, 200 μM de indometacina e 0,5 mM de IBMX (ver Tabela de Materiais).
    3. Troque o meio de diferenciação a cada 3-4 dias. Após cerca de 3 semanas, lave as DPSCs diferenciadas com PBS e fixe-as com paraformaldeído a 4% (PFA) por 20 min em temperatura ambiente.
    4. Pinte as células fixadas com Oil Red O (consulte a Tabela de Materiais) para visualizar o acúmulo de gotículas lipídicas (Figura 4). Para confirmar ainda mais a diferenciação adipogênica, realize a análise da expressão gênica de marcadores adipogênicos, como o receptor gama ativado por proliferador de peroxissomo (PPARγ) e adiponectina31,32.
  3. Diferenciação condrogênica
    1. Culturas de DPSCs mantidas em atmosfera umidificada com 5% de CO2 a 37 °C são usadas para diferenciação condrogênica. Passe as células quando atingirem cerca de 70% -80% de confluência.
    2. Aspire o meio e lave as células uma vez com 1x PBS. Substitua o meio lavado por meio de diferenciação condrogênica, que normalmente contém meio de Eagle modificado (DMEM) de Dulbecco com alto teor de glicose, 1% de ITS, dexametasona 100 nM, 50 μg/mL de ascorbato-2-fosfato, 40 μg/mL de prolina e 10 ng/mL de fator de crescimento transformador-beta 3 (TGF-β3) (ver Tabela de Materiais).
    3. Mantenha as células no meio de diferenciação condrogênica, trocando o meio a cada 2-3 dias. Após cerca de três semanas, as DPSCs devem ter se diferenciado em células semelhantes a condrócitos.
    4. Fixe as células incubando-as com paraformaldeído (PFA) a 4% por 20 min em temperatura ambiente. Após a fixação, core as células com Azul de Alcian (ver Tabela de Materiais) e visualize-as ao microscópio para confirmar a diferenciação condrogênica (Figura 5).
    5. Confirmar a diferenciação de DPSCs em condrócitos usando técnicas como coloração Alcian Blue para proteoglicanos ou análise da expressão gênica de marcadores condrogênicos como agrecan, SOX9 e colágeno tipo II33,34.

Resultados

A execução bem-sucedida do protocolo delineado produziu células-tronco pulpares dentárias (DPSCs) capazes de diferenciação de múltiplas linhagens, demonstrando sua multipotência.

Ensaios de viabilidade
A viabilidade dos DPSCs foi avaliada usando um ensaio de exclusão de Trypan Blue em vários momentos. Os resultados mostram uma viabilidade consistentemente alta (maior que 95%) ao longo do período de cultivo, demonstrando a robustez de nosso protocolo de isolamento e cultivo.

Ensaios de Unidade Formadora de Colônias (UFC)
Ensaios de UFC foram realizados para avaliar a capacidade de auto-renovação das DPSCs. Uma suspensão unicelular foi plaqueada em baixa densidade e cultivada por 14 dias. As colônias formadas foram então coradas e contadas. Os resultados mostram muitas colônias, indicando uma alta proporção de células auto-renovadoras dentro da população DPSC.

Tempo de duplicação da célula
O tempo de duplicação das células foi calculado com base na curva de crescimento das DPSCs. As células foram semeadas em uma densidade específica e contadas regularmente para construir uma curva de crescimento. O tempo de duplicação foi então calculado usando a fase de crescimento exponencial da curva. Os resultados mostram um tempo de duplicação consistente com o relatado para MSCs, sugerindo uma população de células saudáveis e proliferativas (Figura 6).

Análise de citometria de fluxo
A análise por citometria de fluxo mostrou que a grande maioria das CPDP (por exemplo, >95%) foi positiva para CD90, CD73 e CD105, confirmando sua identidade como CTMs (Figura 7). Além disso, menos de 2% das células foram positivas para CD45, CD34 e HLA-DR, confirmando a ausência de contaminação significativa de células hematopoiéticas ou endoteliais.

Diferenciação osteogênica
Após a conclusão da diferenciação osteogênica, as células exibiram uma matriz mineralizada, que é visualizada pela coloração com Vermelho de Alizarina S (Figura 3). A presença de coloração vermelha nas células coradas indica a deposição bem-sucedida de uma matriz mineralizada, característica essencial da diferenciação osteogênica. A incapacidade de obter com sucesso a coloração de diferenciação pode estar potencialmente ligada aos desafios enfrentados durante o procedimento de coleta de amostras.

Diferenciação adipogênica
Durante a diferenciação adipogênica, as DPSCs acumularam gotículas lipídicas, indicativas de adipogênese. As gotículas lipídicas podem ser observadas com a coloração Oil Red O (Figura 4). Uma diferenciação bem-sucedida resultou em gotículas lipídicas coradas de laranja-avermelhado dentro das células.

Diferenciação condrogênica
Por fim, após a diferenciação condrogênica, as DPSCs produziram glicosaminoglicanos, um componente crítico da cartilagem confirmado pela coloração Alcian Blue, que se liga a esses glicosaminoglicanos. As células submetidas à condrogênese com sucesso exibiram coloração azul após a coloração (Figura 5).

As células que não exibiram as respectivas mudanças de cor nos procedimentos de coloração podem ser devidas à diferenciação abaixo do ideal, possivelmente devido a problemas com o meio de diferenciação ou a qualidade inicial dos DPSCs. Garantir a qualidade do meio e dos suplementos e a saúde e o número de DPSCs usados é importante. A diferenciação bem-sucedida de DPSCs em osteoblastos, adipócitos e condrócitos valida a natureza multipotente dessas células e ressalta seu potencial na medicina regenerativa e em aplicações terapêuticas.

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Figura 1: Visão geral do isolamento, caracterização e diferenciação de células-tronco da polpa dentária. Esta figura fornece uma representação esquemática do fluxo de trabalho para isolar, caracterizar e diferenciar células-tronco da polpa dentária (DPSCs). O processo começa com a extração do dente (ou dentes), seguido pelo isolamento do tecido pulpar, do qual derivam as DPSC. Após o isolamento, as DPSCs passam por vários testes de caracterização para confirmar sua identidade de células-tronco e avaliar sua viabilidade, taxa de proliferação e outros atributos-chave. A etapa final representada neste diagrama envolve a indução da diferenciação, onde as DPSCs são tratadas com fatores específicos para orientar sua transformação em tipos celulares especializados, como osteoblastos, adipócitos ou condrócitos. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Figura 2: Recuperação pulpar de dentes extraídos. (A) Um dente extraído preparado para extração de tecido pulpar. (B) Secção do dente extraído usando uma broca de diamante. (C) Remoção do tecido pulpar da câmara pulpar. (D) Fragmentação do tecido pulpar com lâmina cirúrgica. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Figura 3: Diferenciação osteogênica de células-tronco da polpa dentária (DPSCs) evidenciada pela coloração com Vermelho de Alizarina S (40x). A coloração vermelha brilhante revela a deposição da matriz mineralizada, uma característica dos osteoblastos, confirmando a diferenciação osteogênica bem-sucedida. Barra de escala = 100 μm. Clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

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Figura 4: Diferenciação adipogênica de células-tronco da polpa dentária (DPSCs) demonstrada pela coloração Oil Red O. A presença de gotículas vermelhas brilhantes representa o acúmulo de lipídios, uma marca registrada dos adipócitos, confirmando a diferenciação adipogênica bem-sucedida. Barra de escala = 100 μm. Clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

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Figura 5: Diferenciação condrogênica de células-tronco da polpa dentária (DPSCs) demonstrada pela coloração com azul de Alcian (40x). A cor azul intensa indica a presença de uma matriz extracelular rica em proteoglicanos, característica dos condrócitos, confirmando a diferenciação condrogênica bem-sucedida. Barra de escala = 100 μm. Clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

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Figura 6: Tempo de duplicação celular para células-tronco da polpa dentária (DPSCs). Esta figura ilustra a curva de crescimento das DPSCs ao longo do tempo. As células foram inicialmente semeadas em uma densidade específica e as contagens de células foram feitas em intervalos regulares (representadas no eixo x) para monitorar a taxa de proliferação. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Figura 7: Expressão de marcadores de superfície de células-tronco em cultura de DPSC. Esta figura demonstra a expressão de marcadores de superfície específicos em DPSCs. Os marcadores de células-tronco mesenquimais CD44, CD90 e CD105 apresentam altos níveis de expressão, indicando a presença de traços mesenquimais nessas células. Por outro lado, a expressão de marcadores hematopoiéticos (CD34 e CD45) e da molécula do complexo principal de histocompatibilidade classe II (HLA-DR) é quase insignificante, confirmando a ausência de células de linhagem hematopoiética na cultura. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Discussão

O protocolo descreve o isolamento, cultura e caracterização de células-tronco da polpa dentária (DPSCs) de dentes decíduos e permanentes humanos. Inclui uma descrição do armazenamento e proliferação dessas células, bem como a avaliação de seu potencial de diferenciação in vitro em osteoblastos, adipócitos e condrócitos35.

Chen et al.36 demonstraram que as células-tronco da polpa dentária (DPSCs) podem ser obtidas de várias fontes, incluindo dentes humanos vitais infectados afligidos por condições como periodontite, reabsorção radicular, pericoronarite e fraturas dentárias, bem como dentes supranumerários e desalinhados. Esse achado foi corroborado por estudos subsequentes que identificaram dentes vitais infectados como fontes potenciais de DPSCs 37,38,39,40. No entanto, Bernardi et al.10 apontaram que o aumento da reabsorção radicular poderia afetar negativamente a viabilidade dessas células-tronco. Um obstáculo significativo no processo é preservar as células e evitar sua degradação, que começa imediatamente após a extração ou esfoliação do dente. Além disso, é importante ressaltar que dentes afetados por condições graves, como abscessos periapicais, tumores ou cistos, não devem ser utilizados para extrair células-tronco40,41.

As DPSCs podem ser obtidas por meio da técnica de digestão enzimática (DE) ou do método de crescimento a partir de explantes teciduais (GO), também conhecido como técnica de crescimento espontâneo14,15. Os pesquisadores usam essas estratégias para investigar a eficiência da proliferação celular ou a manutenção de atributos morfológicos e fenotípicos de células-tronco isoladas17. Estudos descobriram que as células-tronco isoladas pelo método OG apresentam uma taxa de proliferação mais lenta e uma expressão mais fraca de marcadores de células-tronco18. Por outro lado, as DPSCs isoladas pelo método ED demonstraram proliferação, diferenciação e expressão aumentada mais rápidas de marcadores de superfície adicionais do que aquelas isoladas pelo método OG. Curiosamente, células-tronco imaturas da polpa dentária (IDPSCs) extraídas de dentes decíduos usando a técnica OG mostraram que a cultura celular estimulou a proliferação seletiva de IDPSCs, impedindo assim a diferenciação precoce42.

A purificação de DPSCs é crucial para a obtenção de células altamente regenerativas e requer marcadores celulares específicos. A seleção de células é realizada usando métodos de classificação de células ativadas por fluorescência ou magneticamente. Além dos marcadores acima mencionados, vários outros antígenos de superfície também são usados devido à natureza heterogênea das DSCs43. No entanto, nenhum marcador único foi identificado para segregar as subpopulações.

Em comparação com as células-tronco mesenquimais derivadas da medula óssea, as DPSCs têm sido reconhecidas como uma fonte promissora de células multipotentes devido ao seu potencial de multilinhagem44. Essa estaminalidade é provavelmente resultado da relativa imaturidade dos tecidos de origem, já que os dentes do siso, muitas vezes a fonte de extração de DPSCs, são os últimos dentes permanentes a se desenvolver e, portanto, são menos maduros que a medula óssea45. Este protocolo explora com sucesso a natureza multipotente das células-tronco da polpa dentária, induzindo essas células a sofrer adipogênese, osteogênese e condrogênese. Notavelmente, as DPSCs são o único tipo de célula que regula positivamente a expressão de DSPP quando cultivadas em condições osteogênicas, indicativas de sua futura diferenciação em odontoblastos46.

As células-tronco dentárias, isoladas de várias fontes, apresentam muitos potenciais de proliferação e diferenciação47. Os avanços significativos feitos em sistemas in vitro impactaram profundamente a biologia e a terapêutica das células-tronco. Apesar desses avanços, os desafios permanecem ao traduzir terapias com células-tronco da bancada para a beira do leito. Deve ser dada especial atenção à sobrevivência e estabilidade das células estaminais, a fim de garantir que as técnicas de preservação não comprometam a viabilidade dessas células. Embora a pesquisa com células-tronco dentárias tenha produzido resultados promissores em modelos animais, há uma necessidade urgente de estender essas descobertas aos testes em humanos. Ao continuar a impulsionar pesquisas e desenvolvimento rigorosos, as células-tronco dentárias estão prontas para desempenhar um papel substancial no avanço do campo do banco de células-tronco.

Embora amplamente utilizada, a abordagem de digestão enzimática para isolar células-tronco da polpa dentária (DPSCs) apresenta várias limitações. Acima de tudo, o processo pode comprometer a viabilidade celular, pois enzimas como colagenase e dispase podem danificar inadvertidamente as membranas celulares, produzindo menos células-tronco vivas17. Além disso, esse método geralmente resulta na degradação da matriz extracelular vital (MEC), que é crucial para preservar as propriedades inerentes das células-tronco48. O procedimento também pode alterar os marcadores de superfície celular, dificultando a identificação e caracterização precisas das DPSCs43. Além dessas restrições biológicas, a abordagem é demorada, elevando os riscos de contaminação microbiana devido a incubações prolongadas a 37 °C. Além disso, a inconsistência entre os lotes de enzimas pode levar a resultados variáveis, desafiando a reprodutibilidade do procedimento de isolamento. O ônus financeiro não pode ser negligenciado, pois enzimas de alta qualidade adequadas para a digestão tecidual são caras49. Além disso, o rescaldo da digestão pode ver atividade enzimática residual que pode afetar negativamente as culturas de células, influenciando sua saúde, proliferação e diferenciação. Por fim, o potencial da digestão enzimática para isolar preferencialmente certas subpopulações de DPSC em detrimento de outras pode inadvertidamente distorcer o pool de células resultante, influenciando seu potencial terapêutico50.

Divulgações

Os autores não têm nada a divulgar.

Agradecimentos

Os autores agradecem ao Dr. Mathew Mazhavancheril, Diretor e Chefe do Centro de Pesquisa Pushpagiri em Thiruvalla, por seu apoio na documentação dos procedimentos no Centro de Pesquisa.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
3-isobutil-l-metil-xantina Sigma-Aldrich Co. St. Louis, MO 63103.USAI5879
Ácido acéticoSigma-Aldrich Co. St. Louis, MO 63103.USAAS001
Alcian Blue Sigma-Aldrich Co. St. Louis, MO 63103.USARM471
Solução de coloração Alizarin Red SSigma-Aldrich Co. St. Louis, MO 63103.USAGRM894
Fosfatase alcalina - Kit de coloraçãoThermo Fisher Scientific, MA 02451, USA
Alpha Minimum Essential Medium (α-MEM) Thermo Fisher Scientific, MA 02451, EUAGibco
Alpha Minimum Essential Medium (α-MEM) Thermo Fisher Scientific, miliampère 02451, EUAGibco
Alpha-MEM, ou meio essencial mínimo alfaThermo Fisher científico, miliampère 02451, EUAGibco
Alpha-MEM, ou meio essencial mínimo alfaThermo Fisher científico, miliampère 02451, EUAGibco
antibiótico/antimicóticoSigma-Aldrich Co. St. Louis, MO 63103.USAP4333
Ascorbato-2-fosfatoSigma-Aldrich Co. St. Louis, MO 63103.USA012-04802
Beta-glicerofosfato Sigma-Aldrich Co. St. Louis, MO 63103.USAG9422-10G
Armário de biossegurança - Capa de fluxo laminarLabconco Corporation,MO 64132-2696,USA
CD90, CD105, CD73, CD34, CD45, e HLA-DRBioLegend, Inc.CA 92121,USA
Filtro de células (70 µ m )Laboratórios HiMedia  Ltd.Mumbai,ÍndiaTCP025Cell strainer
CentrifugeREMI Elektrotechnik Limited (REMI)
CentrifugeHiMedia Laboratories  Ltd.Mumbai,Índia1101 | 1102
CO2 IncubadoraThermo Fisher Scientific, MA 02451,EUA
Colagenase tipo IWorthington Biochem. Corp. NJ 08701, EUA
Colagenase tipo IWorthington Biochem. Corp. NJ 08701, EUA
Meio de Crescimento CompletoHiMedia Laboratories  Ltd.Mumbai,ÍndiaAT006DMEM
Tubos cônicos (15 ou 50Thermo Fisher Scientific, MA, EUA546021P/546041Pde 15 mL e 50 mL
Thermo Fisher Scientific, MA 02451, EUA15-350-50
Etiquetas criogênicasEtiqueta Índia:
Caixas de armazenamento crioval Caixas de Armazenamento
Cryostore CryovialsThermo Fisher Scientific, MA 02451, USA
Cryovials (1.8 mL)Thermo Fisher Scientific, MA 02451, USAPW1282autoportante
(25 cm²)Corning Inc.NY 14831, USA
Frascos de culturaHiMedia Laboratories  Ltd.Mumbai,ÍndiaTCG4/TCG6T25/T75
Placas de CulturaHiMedia Laboratories  Ltd.Mumbai,ÍndiaTCP129/TCP008de 60 mm/100 mm
Komet SC 29730, EUAKomet 
Brasseler dental da máquina escavadora da colher, GA 31419, EUA5023591U0
DexametasoneSigma-Aldrich Co. St. Louis, MO 63103.USAD4902-25MG
DexamethosoneSigma-Aldrich Co. St. Louis, MO 63103.USADexamethosone
Sigma-Aldrich Co. St. Louis, MO 63103.USAD4902-25MG
Dimethyl Sulfoxide (DMSO)Sigma-Aldrich Co. St. Louis, MO 63103.USATC185
DispaseRoche Diagnostics, Mannheim, Alemanha.
DispaseRoche Diagnostics GmbH, Mannheim,Alemanha
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)Thermo Fisher Scientific, MA, USA
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)Thermo Fisher Scientific ,MA 02451,USA
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)Thermo Fisher Scientific ,MA 02451,USA
Meio Eagle Modificado de Dulbecco (DMEM)Thermo Fisher Scientific,MA 02451,USA
Etanol (70%)HiMedia Laboratories  Ltd.Mumbai,ÍndiaMB106
Etanol -70%Thermo Fisher Scientific,MA 02451,EUAFisher Scientific
 Dentsply Sirona, EUA
Soro fetal bovino (FBS)Thermo Fisher Scientific Inc.,MA,USAF2442-500ML
Soro fetal bovino (FBS)Thermo Fisher Scientific Inc.,MA,USAF2442-500ML
Soro fetal bovino (FBS)HiMedia Laboratories  Ltd.Mumbai, ÍndiaRM9954
Soro bovino fetal (FBS)Thermo Fisher Scientific Inc.,MA,EUAF2442-500ML
Soro bovino fetal (FBS)Thermo Fisher Scientific Inc.,MA,EUAF2442-500ML
Placa de cultura de tecidos revestida com fibronectinaCorning Inc.Corning, NY 14831,EUA
Citômetro de fluxoBD Biosciences,CA 95131,EUA
Tampão de citometria de fluxoBD Biosciences,CA 95131,USA
Tampa de lamínula de vidro 22 x 22 mmHiMedia Laboratories  Ltd.Mumbai,ÍndiaTCP017
Hank's Balanced Salt Solution (HBSS)Lonza Group Ltd,4002 Basel, Suíça
Peça de mão odontológica de alta velocidade NSK Ltd, Tóquio 8216, JapãoTi-Max Z série
Soro de cavaloThermo Fisher Scientific, MA 02451, EUA
IBMX, ou 3-isobutil-1-metilxantinaSigma-Aldrich Co. St. Louis, MO 63103.USA
IndometacinaPfizer Inc. NY 10017, EUA
Insulina-Transferrina-Selênio (ITS)Thermo Fisher Scientific, MA 02451, EUAI5523
Insulina-Transferrina-Selênio (ITS)Thermo Fisher Scientific, MA 02451, EUAI5523
Premix CorningIncorporated, MA 01876, EUA
Microscópio invertidoOlympus Corp., Tóquio 163-0914, Japão
Isopropanol (60%)Sigma-Aldrich Co. St. Louis, MO 63103.USAI9516
Álcool isopropílicoSigma-Aldrich Co. St. Louis, MO 63103.USAMB063
Capa de fluxo laminarThermo Fisher Scientific, MA 02451, EUA
Lidocaína misturada com epinefrinaDENTSPLY, NC 28277, EUACitanest
Liquid NitrogenAir Liquide, 75007 Paris, França
Tanque de armazenamento de nitrogênio líquidoCryo Scientific Systems Pvt. Ltd.
MicropipetasEppendorf AG,22339 Hamburg,Alemanha30020Accupipet-2-20 µ L
Mini moedor de tecidosBio-Rad Lab, Inc. CA 94547, EUAMini moedores ReadyPrep Minus
80 freezerBlue Star Limited
Câmara de contagem NeubauerMarienfeld Superior, arktheidenfeld, Alemanha
Mancha O vermelha de óleoSigma-Aldrich Co. St. Louis, MO 63103.USA1024190250
Meio de Diferenciação Osteogênica (ODM) STEMCELL Technologies Inc.Vancouver, BC, V5Z 1B3,Canada
Paraformaldeído (PFA) Sigma-Aldrich Co. St. Louis, MO 63103.USATCL119
Penicilina-EstreptomicinaGibco-Thermo Fisher Scientific Inc., MA 02451, EUA
Solução Tamponada com Fosfato (PBS) sem Ca++ e Mg++HiMedia Laboratories  Ltd.Mumbai,ÍndiaTS1101
Solução salina tamponada com fosfato (PBS)Thermo Fisher ScientificGibco
Solução salina tamponada com fosfato (PBS)Thermo Fisher Scientific,MA, EUAGibco
Solução salina tamponada com fosfato (PBS)Thermo Fisher Scientific, MA, EUA
Solução salina tamponada com fosfato (PBS)Thermo Fisher Scientific, MA, EUAP3813-1PAK1x PBS, pH 7.4
Proline Sigma-Aldrich Co. St. Louis, MO 63103.USA
Lâmina de Bisturi Tamanho 15 Swann-Morton Ltd, Sheffield, S6 2BJ,UKBDF-6955C
Hipoclorito de SódioHiMedia Laboratories  Ltd.Mumbai, ÍndiaAS1024% w/v solução
Tubos de centrífuga estéreisTarsons Products Pvt. Ltd.
Recipiente estéril -20 mL3M Center, MN 55144-1000,EUA3 M
Solução salina estéril tamponada com fosfato (PBS)Sigma Aldrich, EUAP3813-1PAK1x PBS, pH 7,4
Pipetas estéreis (2, 5 e 10 mL)Eppendorf AG,22339 Hamburgo,Alemanha
Pipetas e pontas estéreisEppendorf India Limited
Surgical Blade Lidarcom Becton, Dickinson and Co., NJ, EUA371030BP Lidar com 3
Fator de Crescimento Transformador-beta 3 (TGF-β 3)R & D Systems, Inc.MN 55413, EUA
Fator de Crescimento Transformador-beta 3 (TGF-β 3)R & D Systems, Inc.MN 55413,USA
Trypan Blue 0.4% Sigma-Aldrich Co. St. Louis, MO 63103.USA
Trypan Blue 0.4% Sigma-Aldrich Co. St. Louis, MO 63103.USATCL046
Trypan Blue 0.4% Sigma-Aldrich Co. St. Louis, MO 63103.USATCL046
Tripsina-EDTA Gibco-Thermo Fisher Scientific Inc., MA 02451, EUA
Tripsina-EDTA 0,25%Gibco-Thermo Fisher Scientific Inc., MA 02451, EUA
Banho mariaThermo Fisher Scientific, MA 02451, EUABSW-01D
) Recipiente de congelamento criogênico Frasco de cultura Discos de Diamante Dental Pinça de Extração

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