Artigo de método

Desenvolvimento e caracterização de hidrogéis de matriz extracelular pulmonar decelularizada

DOI:

10.3791/65768

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8 de dezembro de 2023

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1Engineered Cancer and Organ Models Laboratory, Koç University, 2Research Center for Translational Medicine (KUTTAM), Koç University, 3Department of Chemical and Biological Engineering, School of Engineering, Koç University, 4Department of Medical Biology, School of Medicine, Koç University

* These authors contributed equally

Neste artigo

Resumo

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O protocolo elucida duas metodologias distintas de decelularização aplicadas a tecidos pulmonares bovinos nativos, fornecendo um relato abrangente de suas respectivas caracterizações.

Resumo

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O uso de hidrogéis derivados da matriz extracelular (MEC) na engenharia de tecidos tem se tornado cada vez mais popular, pois podem mimetizar o ambiente natural das células in vitro. No entanto, manter o conteúdo bioquímico nativo da MEC, alcançar estabilidade mecânica e compreender o impacto do processo de decelularização nas propriedades mecânicas dos hidrogéis da MEC são um desafio. Neste trabalho, foi descrito um pipeline para a descelularização do tecido pulmonar bovino utilizando dois protocolos diferentes, caracterização a jusante da eficácia da descelularização, fabricação de hidrogéis de MEC pulmonar decelularizada reconstituídos e avaliação de suas propriedades mecânicas e citocompatibilidade. A descelularização do pulmão bovino foi realizada por método físico (ciclos de congelamento-descongelamento) ou químico (à base de detergente). A coloração de hematoxilina e eosina foi realizada para validar a decelularização e retenção dos principais componentes da MEC. Para a avaliação do conteúdo residual de colágeno e glicosaminoglicano sulfatado (sGAG) nas amostras decelularizadas, foram empregadas as técnicas de coloração Sirius red e Alcian blue, respectivamente. As propriedades mecânicas dos hidrogéis de MEC pulmonar decelularizado foram caracterizadas por reologia oscilatória. Os resultados sugerem que hidrogéis de pulmão bovino decelularizados podem fornecer uma alternativa organotípica confiável aos produtos comerciais de MEC por reter a maioria dos componentes nativos da MEC. Além disso, esses achados revelam que o método de descelularização de escolha afeta significativamente a cinética de gelificação, bem como a rigidez e as propriedades viscoelásticas dos hidrogéis resultantes.

Introdução

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As condições convencionais de cultivo de monocamadas não oferecem uma representação fiel dos microambientes de tecidos nativos e carecem da capacidade de fornecer um arcabouço tridimensional (3D) com ligantes instrutivos que possibilitem interações célula-matriz e célula-célula1. A composição da matriz extracelular (MEC) e as propriedades mecânicas são altamente tecido-específicas, tempo-dependentes e sofrem alterações em condições patológicas. Portanto, há necessidade de modelos teciduais 3D biomiméticos que permitam a sintonia de tais características, a modulação do comportamento celular e o alcance da funcionalidade tecidual desejada. Biomat....

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Protocolo

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Pulmões nativos frescos de doadores bovinos jovens (1-2 anos de idade) foram obtidos de um abatedouro local e transportados em um recipiente plástico selado sobre gelo para o laboratório. O sacrifício dos animais é realizado para consumo geral de carne (pulmões descartados como resíduos) e não tem relação ou é devido ao estudo. Confirmamos que o matadouro cumpre as leis e regulamentos nacionais de sacrifício de animais. Além disso, confirmamos que utilizamos apenas resíduos e que o projeto de pesquisa não teve efeito sobre o número de animais sacrificados.

1. Colheita de órgãos e preparação de tecidos

  1. Conservar os....

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Resultados

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Descelularização
A descelularização do tecido pulmonar bovino para produzir hidrogéis de dECM que recapitulariam o microambiente pulmonar nativo foi obtida por métodos físicos (congelamento-descongelamento) e químicos (Triton-X-100). Após dissecção, pedaços de tecido foram lavados em antibióticos contendo dH2O para remover patógenos que podem afetar posteriormente a esterilidade dos hidrogéis de dECM. Um total de cinco ciclos alternados entre nitrogênio líquido a 37 °C em banho-maria foi ap.......

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Discussão

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Os hidrogéis derivados de órgãos tornaram-se modelos promissores que recapitulam a MEC tecidual nativa e mimetizam a função celular organotípica. Embora a MEC pulmonar decelularizada tenha sido frequentemente usada em engenharia de tecidos, uma caracterização completa da composição do biomaterial e das propriedades mecânicas beneficiará uma melhor compreensão de como as interações célula-MEC podem ser moduladas para modelar processos biológicos durante a homeostase ou doença. Particularmente, a avaliação e o controle das.......

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Divulgações

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Todos os autores declaram não haver interesses financeiros concorrentes.

Agradecimentos

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Este trabalho foi financiado pelo Conselho de Pesquisa Científica e Tecnológica da Turquia (TÜBİTAK) (Grant No. 118C238). Toda a responsabilidade da publicação/artigo é do proprietário da publicação. O apoio financeiro recebido da TÜBİTAK não significa que o conteúdo da publicação seja aprovado em sentido científico pela TÜBİTAK. Os autores agradecem o uso dos serviços e instalações do Centro de Pesquisa em Medicina Translacional da Universidade de Koç (KUTTAM). A Figura 1 e a Figura 2a foram criadas usando Biorender.com.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Etanol absolutoISOLAB64-17-5
Ácido acéticoISOLAB64-19-7
Solução de azul de alcianoSigma-AldrichB8438
Desoxirribonuclease I de pâncreas bovinoSigma-AldrichDN25
Discovery HR-2 reômetroTA Instruments
Meio de montagem EntellanMerck107960
Eosin soluçãoBright-slide2.BS01-105-1000
Microscopia Eletrônicade Formaldeído50-980-485
Ácido clorídricoMerck100317
IodoSigma-Aldrich3002
Cloreto de magnésioSigma-Aldrich7786-30-3
Solução de coloração de hematoxilina de MayerMerck2.BS01-103-1000
Composto OCTTissue-Tek4583
Penicilina / estreptomicinaBiowestL0018-100
Pepsina da mucosa gástrica suínaSigma-AldrichP6887
Ácido pícricoPolysciences88-89-1
Sirius RedPolysciences09400-25
Hidróxido de sódioSigma-AldrichS5881
Sucrose Sigma-AldrichS0389
Triton-X-100Merck112298
Ciências de

Referências

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  1. Zhu, X., et al. Ordered micropattern arrays fabricated by lung-derived dECM hydrogels for chemotherapeutic drug screening. Mater Today Bio. 15, 100274(2022).
  2. Ulldemolins, A., et al. Lung extracellular matri....

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