Os hepatócitos derivados de células-tronco pluripotentes podem ser purificados por meio da classificação celular, usando uma combinação de coloração mitocondrial e molécula de adesão de células leucocitárias ativadas (ALCAM, também conhecida como CD166).
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Artigo de método
Aplicação de coloração de mitocôndrias vivas na classificação de células para purificar hepatócitos derivados de células-tronco pluripotentes induzidas por humanos
Neste artigo
Resumo
Resumo
As células-tronco embrionárias humanas (ES) e as células-tronco pluripotentes induzidas (iPS) têm aplicações potenciais na medicina regenerativa baseada em células para o tratamento de órgãos gravemente doentes devido à sua proliferação ilimitada e propriedades pluripotentes. No entanto, diferenciar as células ES/iPS humanas em tipos de células-alvo 100% puras é um desafio devido à sua alta sensibilidade ao meio ambiente. A tumorigênese após o transplante é causada por células contaminadas, proliferantes e indiferenciadas, tornando a tecnologia de alta purificação essencial para a realização segura da medicina regenerativa. Para mitigar o risco de tumorigênese, uma tecnologia de alta purificação foi desenvolvida para hepatócitos derivados de células iPS humanas. O método emprega FACS (classificação de células ativadas por fluorescência) usando uma combinação de alto conteúdo mitocondrial e o marcador de superfície celular ALCAM (molécula de adesão de células leucocitárias ativadas) sem modificação genética. 97% ± 0,38% (n = 5) dos hepatócitos purificados usando este método exibiram expressão da proteína albumina. Este artigo tem como objetivo fornecer procedimentos detalhados para este método, aplicado ao método de diferenciação bidimensional mais atual para células iPS humanas em hepatócitos.
Introdução
Células-tronco embrionárias e pluripotentes induzidas (ES e iPS, respectivamente) são consideradas fontes celulares promissoras para terapias regenerativas. No entanto, a eficiência de diferenciar essas células em tipos específicos de células-alvo pode variar, mesmo quando se usa a mesma linhagem celular, protocolo e experimentador 1,2,3,4. Essa variabilidade pode ser atribuída à alta sensibilidade das células ES / iPS humanas ao seu ambiente. Portanto, atualmente é difícil obter consistentemente células-alvo puras. Para alcançar uma medici....
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Protocolo
Este estudo utilizou células iPS humanas obtidas comercialmente (cepa 253G1) (ver Tabela de Materiais).
1. Manutenção de células iPS humanas
- Manter as células iPS humanas em condições livres de alimentador em meio AK02 em placas de cultura revestidas com 0,25 μg/cm2 iMatrix-511 (ver Tabela de Materiais).
2. Diferenciação hepática de células iPS humanas em culturas 2D
NOTA: Consulte a Figura 1A para obter a programação diária da diferenciação hepática. Durante todo ....
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Resultados
A linha do tempo dos processos que induzem as células iPS humanas a se diferenciarem em hepatócitos por meio de cultura 2D (Figura 1A) e características celulares representativas (Figura 1B) são mostradas. Aproximadamente no dia 12 de diferenciação, as células começaram a exibir formas celulares poligonais e núcleos redondos, característicos dos hepatócitos. Alguns hepatócitos também exibiram multinucleação.
A análise FACS foi realiza.......
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Discussão
Devido às suas funções no metabolismo de nutrientes e na desintoxicação, os hepatócitos possuem um número relativamente grande de mitocôndrias em comparação com outros tipos de células15. O ALCAM é um membro da superfamília das imunoglobulinas e desempenha um papel na adesão e migração celular. É expressa em vários tipos celulares, incluindo células hepáticas, epiteliais, linfocíticas, mieloides, fibroblastas e neuronais16. Ao utilizar uma combinação do método baseado em mi.......
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Divulgações
Os autores não têm nada a divulgar.
Agradecimentos
Este trabalho foi apoiado pelo Ministério da Educação, Cultura, Esportes, Ciência e Tecnologia número de concessão [23390072].
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| linha celular humana do iPS 253G1 | Centro de pesquisa RIKEN BioResource | HPS0002 | |
| paraformaldeído de 4% | FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation | 163-20145 | |
| Activin A Solution, humano, recombinante | NACALAI TESQUE, INC. | 18585 | |
| Anti-Nuclei Anticorpo, clone 235-1 | Chemicon | MAB1281 | Anticorpo contra antígeno nuclear humano |
| B-27 Suplemento (50x), sem soro | Thermo Fisher Scientific | 17504044 | |
| BD FACSAria III | BD Biosciences | Cell sorter | |
| CHIR-99021 | MedChemExpress | HY-10182 | |
| Ciclosporina A | FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation | 035-18961 | |
| Colagenase | FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation | 034-22363 | |
| Corning Matrigel Matriz de Membrana Poral Reduzida do Fator de Crescimento (TFG) | Corning | 354230 | Matriz de membrana basal semelhante a gel |
| CultureSure Y-27632 | FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation | 036-24023 | Inibidor de ROCK |
| Dexametasona | FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation | 047-18863 | |
| Dimetilsulfóxido (DMSO) | FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation | 047-29353 | |
| Anticorpo secundário de adsorção cruzada IgG (H + L) anti-cabra anti-burro, Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher Scientific | A-11055 | |
| Anticorpo secundário anti-rato IgG (H+L) altamente adsorvido de burro, Alexa Fluor 546 | Thermo Fisher Scientific | A10036 | |
| Anticorpo secundário anti-coelho IgG (H+L) altamente adsorvido cruzado, Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher Scientific | A-21206 | |
| Falcon Tubo de ensaio de poliestireno de fundo redondo de 5 mL, com tampa de pressão de filtro de células | Corning | 352235 | |
| Fetal Bovine Serum | Biowest | 51820-500 | |
| GlutaMAX Suplemento | Thermo Fisher Scientific | 35050061 | Dipeptídeo L-Alanil-L-Glutamina |
| Humano/Camundongo/Rato/Canino ALCAM/CD166 Anticorpo R | & D Systems | AF1172 | |
| Hidrocortisona 21-hemisuccinato sal de sódio | Sigma-Aldrich | H2270 | |
| iMatrix-511 silk | Nippi | 892021 | |
| ImmunoBlock | KAC | de bloqueio | de CTKN001 |
| ITS-G Suplemento(× 100) | FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation | 090-06741 | |
| Leibovitz's L-15 Medium | FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation | 128-06075 | |
| N-Hexanoic-Try-Ile-(6) -amino Hexanoic amide (Dihexa) | Toronto Research Chemicals | H293745 | |
| Polyclonal Rabbit Anti-Human Albumin | Dako | A0001 | |
| Polioxietileno Sorbitano Monolaurato (Tween 20) | NACALAI TESQUE, INC. | 28353-85 | |
| RPMI-1640 | FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation | 189-02025 | |
| L-ascorbato de sódio | NACALAI TESQUE, INC. | 03422-32 | |
| StemFit AK02N | REPROCELL | RCAK02N | |
| TBS (10x) | NACALAI TESQUE, INC. | 12748-31 | |
| Tetrametilrodamina, éster metílico (TMRM) | Thermo Fisher Scientific | T668 | |
| Triton X-100 | NACALAI TESQUE, INC. | 28229-25 | |
| Solução Trypan Blue | NACALAI TESQUE, INC. | 20577-34 | |
| TRIPSINA 250 | Difco | 215240 | |
| Solução de caldo de fosfato de triptose | Sigma-Aldrich | T8159 |
Referências
- Yamamoto, T., et al. Differentiation potential of pluripotent stem cells correlates to the level of CHD7. Scientific Reports. 8 (1), 241(2018).
- Laco, F., et al.
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Reimpressões e permissões
