Aplicação de coloração de mitocôndrias vivas na classificação de células para purificar hepatócitos derivados de células-tronco pluripotentes induzidas por humanos

Resumo

Os hepatócitos derivados de células-tronco pluripotentes podem ser purificados por meio da classificação celular, usando uma combinação de coloração mitocondrial e molécula de adesão de células leucocitárias ativadas (ALCAM, também conhecida como CD166).

Resumo

As células-tronco embrionárias humanas (ES) e as células-tronco pluripotentes induzidas (iPS) têm aplicações potenciais na medicina regenerativa baseada em células para o tratamento de órgãos gravemente doentes devido à sua proliferação ilimitada e propriedades pluripotentes. No entanto, diferenciar as células ES/iPS humanas em tipos de células-alvo 100% puras é um desafio devido à sua alta sensibilidade ao meio ambiente. A tumorigênese após o transplante é causada por células contaminadas, proliferantes e indiferenciadas, tornando a tecnologia de alta purificação essencial para a realização segura da medicina regenerativa. Para mitigar o risco de tumorigênese, uma tecnologia de alta purificação foi desenvolvida para hepatócitos derivados de células iPS humanas. O método emprega FACS (classificação de células ativadas por fluorescência) usando uma combinação de alto conteúdo mitocondrial e o marcador de superfície celular ALCAM (molécula de adesão de células leucocitárias ativadas) sem modificação genética. 97% ± 0,38% (n = 5) dos hepatócitos purificados usando este método exibiram expressão da proteína albumina. Este artigo tem como objetivo fornecer procedimentos detalhados para este método, aplicado ao método de diferenciação bidimensional mais atual para células iPS humanas em hepatócitos.

Introdução

Células-tronco embrionárias e pluripotentes induzidas (ES e iPS, respectivamente) são consideradas fontes celulares promissoras para terapias regenerativas. No entanto, a eficiência de diferenciar essas células em tipos específicos de células-alvo pode variar, mesmo quando se usa a mesma linhagem celular, protocolo e experimentador 1,2,3,4. Essa variabilidade pode ser atribuída à alta sensibilidade das células ES / iPS humanas ao seu ambiente. Portanto, atualmente é difícil obter consistentemente células-alvo puras. Para alcançar uma medicina regenerativa altamente segura, é crucial eliminar células proliferativas e células-tronco indiferenciadas em células terapêuticas, e a tecnologia avançada de purificação de células-alvo é essencial ^5,6,7.

Um classificador de células é um dispositivo que analisa instantaneamente células individuais e classifica células vivas de interesse com base nas intensidades do sinal fluorescente, oferecendo uma solução promissora. Isso pode ser feito por meio da coloração de anticorpos de marcadores de superfície específicos do tipo de célula ou utilizando expressões gênicas repórter específicas do tipo de célula. Utilizando essa técnica, existem vários relatos de métodos para purificação de cardiomiócitos derivados de células-tronco pluripotentes ^8,9,10 e hepatócitos^11,12. Hattori et al. desenvolveram um método inovador de purificação mitocondrial usando um classificador de células¹³. Aproveitando o fato de que os cardiomiócitos têm altas demandas de energia por meio da atividade mitocondrial, a coloração das células com o corante indicativo de mitocôndrias vivas TMRM (éster metílico de tetrametilrodamina) pode ser usada para marcar e purificar cardiomiócitos por FACS de corpos embrióides derivados de células ES humanas contendo vários tipos de células. A ausência de tumorigenicidade foi confirmada por ensaios de formação de teratoma com os cardiomiócitos purificados. Além disso, Yamashita et al. descobriram inesperadamente um método para purificar hepatócitos de corpos embrióides derivados de células ES humanas, isolando frações com alta atividade mitocondrial e expressão positiva para ALCAM¹⁴. A justificativa para esse método é que os hepatócitos também têm um número relativamente alto de mitocôndrias devido ao seu alto consumo de ATP para metabolismo e desintoxicação de nutrientes¹⁵, e os hepatócitos expressam ALCAM, um membro da superfamília de imunoglobulinas, que desempenha um papel na adesão e migração celular¹⁶.

Métodos anteriores de alta purificação para hepatócitos derivados de células-tronco pluripotentes exigiam modificações genéticas, e os métodos de purificação não genéticos tinham baixa eficiência¹⁷. O método mitocondrial não genético tem mérito por alcançar alta pureza. Quando as células progenitoras hepáticas são necessárias, os métodos baseados em CD133 e CD13 ou Dlk1^18,19 podem ser escolhidos. Embora a precisão da tecnologia de edição do genoma tenha avançado, o risco potencial de alterações genômicas imprevistas (por exemplo, carcinogênese) não pode ser totalmente eliminado. Métodos baseados na atividade mitocondrial, sem envolver modificação genética, podem estar livres de tais riscos.

Como resultado do exame de vários indicadores mitocondriais em cardiomiócitos de ratos neonatais, observou-se que o TMRM desapareceu completamente em 24 horas, enquanto outros corantes permaneceram por pelo menos 5 dias¹³. Além disso, é importante notar que TMRM e JC-1 não afetaram a viabilidade celular quando avaliados com o ensaio de brometo de 3-(4,5-dimetil-tiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazólio (MTT), enquanto outros corantes demonstraram efeitos variados na viabilidade celular¹³. TMRM demonstra maior segurança.

Até o momento, vários métodos de diferenciação bidimensional (2D) foram desenvolvidos como abordagens mais eficientes para induzir a diferenciação em comparação com a formação de corpos embrióides tridimensionais (3D). Isso ocorre porque compostos indutores de diferenciação ou citocinas podem ser administrados uniformemente às células em um plano 2D, em vez de em um espaço 3D. Neste estudo, o método²⁰ relatado anteriormente foi modificado para induzir a diferenciação em hepatócitos derivados de células iPS humanas. Aqui, são descritos os detalhes dos procedimentos para a diferenciação e purificação 2D atualizada de hepatócitos derivados de células iPS humanas.

Protocolo

Este estudo utilizou células iPS humanas obtidas comercialmente (cepa 253G1) (ver Tabela de Materiais).

1. Manutenção de células iPS humanas

1. Manter as células iPS humanas em condições livres de alimentador em meio AK02 em placas de cultura revestidas com 0,25 μg/cm² iMatrix-511 (ver Tabela de Materiais).

2. Diferenciação hepática de células iPS humanas em culturas 2D

NOTA: Consulte a Figura 1A para obter a programação diária da diferenciação hepática. Durante todo o processo, use placas de cultura de 6 poços e adicione 2 mL do meio de lavagem ou cultura designado a cada poço. Manter a condição de cultura celular a 100% de humidade, 5% de CO₂ e 20% de O₂ a 37 °C.

1. Cubra cada poço de uma placa de 6 poços com 1 mL de matriz de membrana basal (diluída 1/25 em PBS (-)) e incube a 37 ° C por 1 h.
2. Passe células iPS humanas para o prato revestido a uma densidade de 20.000-30.000 células/cm² usando meio AK02N suplementado com inibidor de ROCK de 10 μM (Y-27632) (ver Tabela de Materiais). Substitua o meio sem Y-27632 no dia seguinte e cultive por mais 2 dias.
3. Lave as células uma vez com o meio RPMI-1640. Inicie a diferenciação da endoderme substituindo o meio por RPMI-B27-Glu (RPMI-1640 + 2% de insulina B27 + 1% de dipeptídeo L-alanil-L-glutamina) suplementado com 3-6 μM de CHIR-99021 e 100 ng/mL de ativina A por 24 h (ver Tabela de Materiais).
4. Substitua o meio por RPMI-B27-Glu suplementado com 50 ng/mL de Activina A por 24 h.
5. Para induzir a diferenciação do progenitor hepático, substitua o meio por RPMI-B27-Glu suplementado com dimetilsulfóxido (DMSO) a 1% por 5 dias.
6. Para promover a maturação dos hepatócitos, mude para o meio de maturação dos hepatócitos: meio L-15 de Leibovitz contendo 10 μM de hidrocortisona 21-hemisuccinato, 8,3% de caldo de fosfato de triptose, 100 nM de dexametasona (DEX), 50 μg/mL de sódio-L-ascorbato, 0,58% de insulina-transferrina-selênio (ITS), 8,3% de soro fetal bovino (FBS), 2 mM de dipeptídeo L-alanil-L-glutamina e 100 nM de N-hexanoico-try-ile-(6)-amino hexanoico amida (Dihexa) (ver Tabela de Materiais).
7. Troque o meio a cada 2 dias por 20 dias. Classifique as células aproximadamente 27 dias após o início da diferenciação.

3. Preparação celular para purificação de hepatócitos derivados de células iPS humanas

1. Lave as células hepáticas diferenciadas com 2 mL de PBS (-) por poço.
2. Adicione 1 mL de solução enzimática por poço, que inclui 0,1% de colagenase, 0,083% de tripsina, 10 μM de inibidor de ROCK (Y-27632), 20 nM de ciclosporina A e 50 μg/mL de sódio-L-ascorbato em tampão Ads (116 mM de NaCl, 12,5 mM de NaH₂PO₄, 20 mM de HEPES, 5,4 mM de KCl, 5,6 mM de glicose e 0,8 mM de MgSO4; pH 7,35) (ver Tabela de Materiais). Separar as células das placas rodando horizontalmente a 37 °C durante cerca de 2 h.
3. Depois de confirmar que as células estão destacadas e arredondadas ao microscópio, disperse-as em células individuais por pipetagem suave e colete-as em um tubo de 50 mL.
4. Centrifugue as células a 200 x g durante 5 min a 18 °C para as peletizar. Remova o sobrenadante usando um aspirador.
5. Corar as mitocôndrias das células dispersando-as em 5 mL de meio de maturação de hepatócitos contendo 100 nM TMRM (tetrametilrodamina, éster de metal) (ver Tabela de Materiais). Incubar durante 30 min a 37 °C enquanto protege da luz envolvendo em folha de alumínio.
6. Centrifugue as células a 200 x g durante 5 min a 18 °C para as peletizar. Remova o sobrenadante.
7. Ressuspenda as células com 1-5 mL de tampão Ads frio contendo 2% de FBS.
8. Conte o número de células usando uma solução de azul de tripano a 0,4% e uma placa de contagem de células.
9. Centrifugue as células a 200 x g durante 5 min a 4 °C para as pulverizar. Remova o sobrenadante.
10. Dilua um anticorpo anti-ALCAM (anticorpo primário, consulte a Tabela de Materiais) na proporção de 1:50 no tampão Ads e adicione 100 μL do anticorpo diluído por 10⁶ células. Manchar as células por 50 min no gelo. Prepare as células que não estão coradas com o anticorpo primário como controle negativo.
11. Lave as células com tampão de anúncios frio contendo 2% de FBS duas vezes.
12. Dilua um Alexa Fluor 488 burro anti-cabra IgG (anticorpo secundário, consulte a Tabela de Materiais) na proporção de 1:100 no tampão Ads e adicione 100 μL do anticorpo diluído por 10⁶ células. Manchar as células por 30 min no gelo. Células coradas que não foram coradas com o anticorpo primário usando o anticorpo secundário.
13. Lave as células com tampão de anúncios frio contendo 2% de FBS duas vezes.
14. Ressuspenda as células no buffer Ads e filtre-as através de um filtro de células de tampa de encaixe (malha de 35 μm) antes de classificar por FACS para remover grandes aglomerados de células e detritos.

4. Análises FACS e triagem de hepatócitos derivados de células iPS humanas

1. Configure a máquina FACS para classificação de células seguindo as instruções do fabricante (consulte a Tabela de Materiais).
   NOTA: Use um tamanho de bico de 85 μm ou 100 μm e um filtro ND de 2.0 para hepatócitos. Use o canal FITC para detectar Alexa Flour 488 para ALCAM e o canal PE para detectar fluorescência TMRM para mitocôndrias.
2. Ajuste as tensões FSC (dispersão direta) e SSC (dispersão lateral) para visualizar adequadamente a população de células.
3. Ajuste as tensões dos canais fluorescentes FITC e PE. Comece com células não rotuladas e centralize a população de células na parte inferior de cada gráfico de canais. Certifique-se de que as células rotuladas estejam posicionadas adequadamente dentro do gráfico.
4. Use uma estratégia de gating comum para eliminar os dupletos: Gate o principal FSC-A vs. SSC-A (Figura 2A), seguida por FSC-H vs. -W e, em seguida, SSC-H vs. -W (Figura 2B,C).
5. Gate a população TMRM^hi e ALCAM⁺ (P2 na Figura 2E) para classificar os hepatócitos. Gate a população TMRM^hi e ALCAM^- (P1 na Figura 2E) para classificar os não hepatócitos. Colete hepatócitos e não hepatócitos selecionados em tubos de coleta de 15 mL contendo meio de maturação de hepatócitos.
6. Centrifugar o tubo de recolha contendo as células triadas a 200 x g durante 5 min a 18 °C.
7. Remover o sobrenadante e ressuspender as células em meio de maturação de hepatócitos.
8. Semeie as células em fibroblastos embrionários de camundongo tratados com mitomicina C (MEFs) ou matriz de membrana basal semelhante a gel com meio de maturação de hepatócitos suplementado com 10 μM de Y-27632 e 20 nM de ciclosporina A. Cultive as células em uma incubadora de CO₃₇ ° C 2 por 5 dias.

5. Imunocitoquímica para detecção de hepatócitos derivados de células iPS humanas

1. Lave as células cultivadas por 5 dias após a triagem com PBS (-).
2. Fixe as células com paraformaldeído a 4% por 5 min em temperatura ambiente.
3. Lave as células com tampão TBS-T (1x TBS com 1% Tween 20) duas vezes para remover o paraformaldeído.
4. Incube as células com tampão TBS-T diluído Triton X-100 a 0,1% por 5 min em temperatura ambiente.
5. Lave as células com tampão TBS-T duas vezes para remover o Triton X-100.
6. Adicione a solução de bloqueio disponível comercialmente (consulte a Tabela de Materiais) às células por 30 min em temperatura ambiente.
7. Adicione anticorpos primários contra albumina (marcador de hepatócitos) e antígeno nuclear humano (hNA, ver Tabela de Materiais), diluídos 1:50 em solução de bloqueio.
8. Incubar as células a 4 °C durante a noite. Lave as células com tampão TBS-T duas vezes.
9. Adicione anticorpos secundários: Alexa Fluor 488 IgG anti-coelho para burros e Alexa Fluor 546 IgG anti-rato para burros, diluídos 1:100 em solução de bloqueio (ver Tabela de Materiais).
10. Incube as células em temperatura ambiente por 30 min. Lave as células com tampão TBS-T duas vezes.
11. Avalie a pureza dos hepatócitos contando células positivas para albumina e hNA positivas sob um microscópio de fluorescência. Calcule a porcentagem de células positivas para albumina por célula positiva para hNA para as populações P1 e P2.

Resultados

A linha do tempo dos processos que induzem as células iPS humanas a se diferenciarem em hepatócitos por meio de cultura 2D (Figura 1A) e características celulares representativas (Figura 1B) são mostradas. Aproximadamente no dia 12 de diferenciação, as células começaram a exibir formas celulares poligonais e núcleos redondos, característicos dos hepatócitos. Alguns hepatócitos também exibiram multinucleação.

A análise FACS foi realiza...

Discussão

Devido às suas funções no metabolismo de nutrientes e na desintoxicação, os hepatócitos possuem um número relativamente grande de mitocôndrias em comparação com outros tipos de células¹⁵. O ALCAM é um membro da superfamília das imunoglobulinas e desempenha um papel na adesão e migração celular. É expressa em vários tipos celulares, incluindo células hepáticas, epiteliais, linfocíticas, mieloides, fibroblastas e neuronais¹⁶. Ao utilizar uma combinação do método baseado em mi...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
linha celular humana do iPS 253G1	Centro de pesquisa RIKEN BioResource	HPS0002
paraformaldeído de 4%	FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation	163-20145
Activin A Solution, humano, recombinante	NACALAI TESQUE, INC.	18585
Anti-Nuclei Anticorpo, clone 235-1	Chemicon	MAB1281	Anticorpo contra antígeno nuclear humano
B-27 Suplemento (50x), sem soro	Thermo Fisher Scientific	17504044
BD FACSAria III	BD Biosciences		Cell sorter
CHIR-99021	MedChemExpress	HY-10182
Ciclosporina A	FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation	035-18961
Colagenase	FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation	034-22363
Corning Matrigel Matriz de Membrana Poral Reduzida do Fator de Crescimento (TFG)	Corning	354230	Matriz de membrana basal semelhante a gel
CultureSure Y-27632	FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation	036-24023	Inibidor de ROCK
Dexametasona	FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation	047-18863
Dimetilsulfóxido (DMSO)	FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation	047-29353
Anticorpo secundário de adsorção cruzada IgG (H + L) anti-cabra anti-burro, Alexa Fluor 488	Thermo Fisher Scientific	A-11055
Anticorpo secundário anti-rato IgG (H+L) altamente adsorvido de burro, Alexa Fluor 546	Thermo Fisher Scientific	A10036
Anticorpo secundário anti-coelho IgG (H+L) altamente adsorvido cruzado, Alexa Fluor 488	Thermo Fisher Scientific	A-21206
Falcon Tubo de ensaio de poliestireno de fundo redondo de 5 mL, com tampa de pressão de filtro de células	Corning	352235
Fetal Bovine Serum	Biowest	51820-500
GlutaMAX Suplemento	Thermo Fisher Scientific	35050061	Dipeptídeo L-Alanil-L-Glutamina
Humano/Camundongo/Rato/Canino ALCAM/CD166 Anticorpo R	& D Systems	AF1172
Hidrocortisona 21-hemisuccinato sal de sódio	Sigma-Aldrich	H2270
iMatrix-511 silk	Nippi	892021
ImmunoBlock	KAC	de bloqueio	de CTKN001
ITS-G Suplemento(× 100)	FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation	090-06741
Leibovitz's L-15 Medium	FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation	128-06075
N-Hexanoic-Try-Ile-(6) -amino Hexanoic amide (Dihexa)	Toronto Research Chemicals	H293745
Polyclonal Rabbit Anti-Human Albumin	Dako	A0001
Polioxietileno Sorbitano Monolaurato (Tween 20)	NACALAI TESQUE, INC.	28353-85
RPMI-1640	FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation	189-02025
L-ascorbato de sódio	NACALAI TESQUE, INC.	03422-32
StemFit AK02N	REPROCELL	RCAK02N
TBS (10x)	NACALAI TESQUE, INC.	12748-31
Tetrametilrodamina, éster metílico (TMRM)	Thermo Fisher Scientific	T668
Triton X-100	NACALAI TESQUE, INC.	28229-25
Solução Trypan Blue	NACALAI TESQUE, INC.	20577-34
TRIPSINA 250	Difco	215240
Solução de caldo de fosfato de triptose	Sigma-Aldrich	T8159