Method Article

Isolamento, Identificação Comportamental e Avaliação de Patogenicidade de Fungos Entomopatogênicos de uma Broca da Madeira Florestal

DOI:

10.3791/65782

⸱

September 29th, 2023

 ,  ,  ,  , 
1School of Forestry and Biotechnology, Zhejiang A&F University, 2Key Laboratory of Vector Biology and Pathogen Control of Zhejiang Province, Huzhou University, 3Department of Biology, Lund University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Aqui apresentamos um protocolo para obtenção de fungos entomopatogênicos de uma broca florestal e uma forma substitutiva de avaliar suas atividades entomopatogênicas usando um inseto modelo coleóptero. Este método é eficiente e conveniente para explorar recursos fúngicos entomopatogênicos de pragas de insetos perfuradores de madeira em florestas naturais.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

As brocas florestais causam graves danos às árvores e perdas econômicas em todo o mundo. A liberação de fungos entomopatogênicos (PFE) durante o período de emergência do BEF é considerada uma alternativa aceitável ao controle químico. No entanto, os recursos do EPF têm sido significativamente menos explorados para FWBs, em contraste com as pragas de insetos agrícolas. Este artigo apresenta um protocolo para explorar os recursos do PFE de FWBs usando populações selvagens de Monochamus alternatus como exemplo. Neste protocolo, a atribuição de armadilhas iscadas com M. Alternatus atrativos para diferentes populações garantiram a coleta de amostras adequadas com sintomas naturais de infecção, durante os períodos de emergência do besouro. Após dissecar finamente os tegumentos e colocá-los em um meio seletivo, as espécies de fungos foram isoladas de cada parte dos corpos dos besouros e identificadas com base em características moleculares e morfológicas.

Várias espécies de fungos foram certificadas como EPFs parasitas por meio da reinfecção de M. alternatus saudáveis com suspensões de esporos. Seus fenótipos comportamentais em M. alternatus foram observados usando microscopia eletrônica de varredura e posteriormente comparados com os do inseto modelo coleóptero Tribolium castaneum. Para os EPFs que apresentam fenótipos de parasitismo consistentes em ambas as espécies de besouros, a avaliação de suas atividades sobre T. castaneum forneceu informações valiosas sobre letalidade para estudos futuros sobre M. alternatus. Este protocolo ajudou na descoberta de EPF recém-relatado em populações de M. alternatus na China, que poderia ser aplicado como uma abordagem eficiente para explorar mais recursos de EPF de outros FWBs.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

A devastação causada por insetos-praga levou a grandes perdas ecológicas e econômicas nos ecossistemas florestais e agrícolas. A maioria das pragas agrícolas se expõe a inimigos naturais ou agentes de controle artificiais enquanto danifica as plantas hospedeiras. Em vez disso, as brocas florestais (FWB) quase completam todos os seus ciclos de desenvolvimento dentro dos troncos das árvores hospedeiras1, o que levanta grandes desafios para explorar organismos eficientes de biocontrole de FWB no campo selvagem. O que é ainda pior é que os BEF carregam um grande número de fitopatógenos2 ou têm uma relação íntima com esses patógenos como seus vetores potenciais 3,4, ampliando drasticamente os efeitos negativos dos BEF na saúde da floresta. O uso excessivo de inseticidas químicos pode aliviar a gravidade da BEF, mas o surgimento de resistência a inseticidas 5,6 limita sua aplicação ambiental. Em certos casos, parasitóides de insetos, artrópodes predadores e micróbios entomopatogênicos foram liberados como agentes de biocontrole para as áreas de distribuição do FWB7 e provaram ser alternativas eficientes e economicamente aceitáveis ao controle químico 8,9,10.

Os fungos entomopatogênicos (PFE) são considerados como tendo a vantagem no controle do BEF sobre a maioria dos outros grupos microbianos. Seus esporos podem ser transportados por hospedeiros de insetos e fixados de forma estável nas superfícies do corpo por meio da penetração na cutícula ou tegumento 8,11. Os PFE também apresentam excelente adaptabilidade a estresses ambientais e algumas espécies colonizam bem o tecido das árvores como endófitos12,13, facilitando seu crescimento, sobrevivência e transmissão. No entanto, em comparação com as indústrias agrícolas, a diversidade de espécies de PFE usadas em ecossistemas florestais naturais é notavelmente restrita 14,15,16. Beauveria bassiana (cepa PPRI 5339) foi evidenciada como a cepa mais promissora para promover um programa de MIP para gorgulhos de eucalipto na África do Sul17 e a combinação de dois isolados promissores de B. bassiana proporcionou uma oportunidade para o controle microbiano prático do gorgulho vermelho da palmeira, Rhynchophorus ferrugineus, em diferentes estágios de vida em campos de palmeiras18. Além de Beauveria e do conhecido Metarhizium, outros gêneros de EPF da ordem Hypocreales, especialmente espécies de Lecanicillium (muitas das quais agora são classificadas no gênero Akanthomyces19,20), apresentaram forte patogenicidade e alto potencial no manejo de pragas florestais, como o pulgão Cypress no Chile21.

O besouro serrador de pinheiro Monochamus alternatus é uma praga notória da floresta de pinheiros na China e países vizinhos, que se enterra em galhos e troncos de pinheiros para impedir o transporte de nutrientes e água 22,23,24. Além disso, M. alternatus também promove a invasão do nematóide parasita de plantas de madeira de pinheiro (Bursaphelenchus xylophilus, PWN) como seu principal besouro vetor. Outra espécie congenérica do besouro, M. galloprovincialis, espalhou o NMP em vários países da Europa nos últimos anos25. Pesquisas anteriores relataram vários gêneros de EPFs naturais de Monochamus spp., como Beauveria, Metarhizium e Lecanicillium (Verticillium, um nome ainda antigo de Lecanicillium), na Espanha, Japão e nas províncias de Anhui / Zhejiang da China26 , 27 , 28 , 29. No entanto, essas coleções de EPFs parecem ser comumente restritas em um determinado local, em comparação com a ampla ocorrência de besouros Monochamus em campos naturais. Como o besouro M. alternatus tem uma ampla distribuição geográfica na China, ele pode ser considerado uma broca representativa da madeira para explorar mais potenciais EPFs em diferentes populações.

No presente protocolo, introduzimos um procedimento específico explorando EPFs de várias populações geográficas de M. alternatus no sul da China. Este protocolo utiliza um modelo de coleóptero como substituto para realizar ensaios de entomopatogenicidade, sob a condição de que a espécie fúngica testada tenha um fenótipo comportamental consistente em ambas as espécies de besouros. Este protocolo também pode fornecer informações sobre a exploração do EPF para outras brocas florestais, nas quais a diversidade de suas espécies fúngicas entomopatogênicas é subestimada ou menos investigada.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Isolamento de fungos de M. alternatus (Figura 1)

  1. Colete a amostra de besouro
    1. Colete os besouros serradores de pinheiros M. alternatus usando armadilhas comerciais (ver Tabela de Materiais) iscadas com atrativos antes dos períodos de emergência previstos das populações de besouros em florestas de pinheiros naturalmente infectadas.
      NOTA: Neste estudo, os besouros foram coletados em cinco regiões geográficas do sul da China (Huzhou / Zhejiang, Liangshan / Sichuan, Xiamen / Fujian, Shaoguan / Guangdong, Yulin / Guangxi). A configuração da armadilha de cima para baixo é a seguinte: um topo redondo (50 cm de diâmetro), um painel em forma de cruz (35 cm de largura e 66 cm de comprimento), um funil (35,5 cm de diâmetro redondo superior e 5,5 cm de diâmetro redondo inferior), um copo coletor (10,5 cm de diâmetro e 26,5 cm de comprimento). Os voláteis do hospedeiro (por exemplo, etanol e α-pineno) e o feromônio de agregação (2-undeciloxi-1-etanol) são usados como isca30.
    2. Rotule a amostra antes de transferi-la para o laboratório. Coloque cada besouro em tubos esterilizados individuais com galhos frescos. Substitua os galhos por novos a cada 2 dias.
    3. Crie os besouros vivos a 25 ± 1 °C em uma incubadora não umidificada (16-8 ciclos L / D) e observe-os diariamente.
    4. Registre amostras mostrando diminuição da alimentação e mobilidade. Transfira morto M. alternatus que se tornam endurecidos e rígidos às câmaras úmidas para observar o crescimento de micélios fúngicos e conídios.
      NOTA: Uma vez infectados por fungos entomopatogênicos, os besouros apresentaram diminuição da alimentação e mobilidade no estágio inicial da infecção31,32. Após a morte, seus corpos tornaram-se endurecidos e rígidos, com micélios e conídios aparecendo vários dias após o armazenamento em câmara úmida33.
    5. Armazene cadáveres de besouros com infecções fúngicas a 4 ° C para uso futuro. Para seguir este protocolo, processe as amostras imediatamente dentro de algumas horas para evitar a contaminação com fungos mais saprotróficos.
  2. Preparação do meio de crescimento
    1. Adicione 39 g de pó de ágar batata dextrose (PDA) em 1 L de água pura e autoclave durante 30 min a 121 °C.
    2. Resfrie a uma temperatura operável (~ 50 ° C), adicione 0,05 g de estreptomicina, 0,05 g de penicilina G e 0,05 g de tetraciclina e agite para distribuir o meio.
    3. Coloque o meio em placas de Petri sob uma bancada limpa e use após a solidificação.
      NOTA: O meio PDA com antibióticos é usado para isolamento de besouros, o que impede o crescimento de bactérias sem afetar o crescimento de fungos durante o isolamento. No entanto, o meio PDA sem antibióticos é usado para cultivo e conservação diários.
    4. Coloque 35 g de pó de caldo de batata dextrose (PDB) em 1 L de ddH2O e autoclave por 30 min a 121 ° C. Resfrie-o para uso.
  3. Dissecção da amostra de besouro com sintomas de infecção fúngica
    1. Prepare tesouras, bisturis e alfinetes esterilizados; Em seguida, trabalhe sob uma bancada limpa com um queimador de álcool.
      NOTA: O uso de ferramentas de dissecação pode ser ajustado de acordo com as preferências pessoais. Os pinos de insetos são mais afiados do que as agulhas de dissecação padrão e especificações diferentes podem atender à necessidade de dissecação.
    2. Disseque os tegumentos do corpo do besouro com ferramentas em placas de Petri estéreis e de uso único. Tome cuidado para evitar possíveis danos aos tecidos do intestino médio e posterior que possam exalar conteúdo interno.
    3. Divida os corpos dos besouros nas posições principais da seguinte forma: antenas, cabeça, tórax, abdômen, asas (cada par) e pernas.
  4. Purificação de fungos
    1. Corte os tegumentos de cada posição em pedaços pequenos com uma tesoura. Pressione suavemente a superfície externa na superfície das placas de PDA com antibióticos.
      NOTA: Certifique-se de que os micélios fúngicos nos tegumentos foram inoculados na placa.
    2. Selar cuidadosamente com parafilme e cultivar numa estufa a 25 ± 1 °C até que os tecidos estejam completamente cobertos por micélio.
    3. Transferir colónias individuais de acordo com as propriedades fenotípicas (cor, forma) para um novo BDA com antibióticos para cultura a 25 ± 1 °C.
    4. Repita a etapa 1.4.3 duas ou três vezes no PDA com antibióticos até que as colônias puras sejam isoladas separadamente.
      NOTA: Se várias cepas de fungos crescerem nas placas originais, escolha o micélio com precisão para facilitar a classificação de mais espécies de fungos.
  5. Armazenamento dos isolados de fungos
    1. Transfira blocos de ágar (~ 5 mm de diâmetro) das colônias para novas placas de PDA.
    2. Cultura em incubadora a 25 ± 1 °C por 1-2 semanas.
    3. Coloque em uma geladeira a 4 ° C para armazenamento diário para uso posterior.
    4. Inocular estirpes fúngicas em 50 ml de PDB estéril num balão de 250 ml, agitando a 180 rpm/min a 25 °C durante 5-7 dias.
    5. Colha 1 mL do micélio fúngico recém-cultivado e suspenda-o em 1 mL de glicerol a 20% esterilizado em tubos de freezer estéreis de 2 mL (a concentração final de glicerol é de 10%).
    6. Selar os tubos com parafilme e pré-arrefecê-los a -20 °C e -40 °C. Em seguida, mantenha os tubos a -80 °C como estoques.

2. Identificação molecular e morfológica de isolados de fungos

  1. Extração de DNA genômico fúngico
    1. Cultura de fungos em PDB conforme descrito na etapa 1.5.4.
    2. Colha o micélio e filtre-o para separá-lo do PDB. Homogeneizar em nitrogênio líquido usando um almofariz e pilão pré-resfriados.
    3. Extraia o DNA genômico usando o Kit de Isolamento de DNA Genômico Fungi de acordo com as instruções do fabricante (consulte a Tabela de Materiais).
  2. Amplificação por PCR e sequenciamento de DNA
    1. Preparar a mistura de reacção PCR do seguinte modo: 25 μL de Taq ADN polimerase, 1 μL de molde, 2 μL de primários directos e inversos e ddH2O até um volume total de 50 μL.
    2. Amplificar a região rDNA-ITS da amostra de ADN utilizando os pares de iniciadores ITS1 e ITS434 (ver quadro 1) com o seguinte procedimento: desnaturação inicial a 95 °C durante 4 min, seguida de 35 ciclos de desnaturação a 94 °C durante 60 s, recozimento a 58 °C durante 60 s, alongamento a 72 °C durante 2 min, e um alongamento final a 72 °C por 10 min.
    3. Eletroforese de produtos amplificados usando gel de agarose a 1,5% a 100 V, 100 mA.
    4. Sequencie o PCR.
    5. Alinhe a sequência usando Clustal X2.0 e MEGA 6.0.
      NOTA: Durante o alinhamento de sequência, os locais com alinhamento ambíguo são excluídos e as lacunas são tratadas como dados ausentes.
    6. Compare a sequência obtida com as do banco de dados de sequências ITS no GenBank usando o BLAST no site do National Center for Biotechnology Information (NCBI). Identifique as informações preliminares sobre as espécies de cepas fúngicas.
  3. Identificação Morfológica
    1. Use uma câmera para capturar a morfologia pura da colônia de fungos maduros nos lados frontal e reverso das placas de PDA.
    2. Retire os conídios das colônias de fungos de cultura pura com uma agulha de inoculação e transfira-os para uma lâmina de vidro com uma gota de água estéril.
    3. Segure a lamínula e coloque-a lentamente em um ângulo de ~45°, para que a lamínula possa cobrir a amostra sem bolhas.
    4. Corte um bloco de ágar2 de 5 mm com um bisturi de colônias na borda da colônia de fungos e transfira-o para uma lâmina de vidro limpa com uma gota de água estéril. Separe cuidadosamente os fungos com uma agulha fina para ver estruturas específicas.
    5. Repita a etapa 2.3.3.
    6. Observe a morfologia assexuada dos fungos sob um microscópio óptico (OM), incluindo a forma, transparência e postura das hifas, conidióforos, fiálides e conídios. Registar e medir a forma e o tamanho das características assexuadas para distinguir os diferentes isolados de fungos uns dos outros.
      NOTA: Para maximizar a capacidade de observar estruturas fúngicas, use manchas e meio de montagem35.

3. Indução dos sintomas de infecção fúngica em M. alternatus para observar seus fenótipos comportamentais

  1. Preparação da suspensão de conídios
    1. Prepare 0,01% de Tween-80 com água pura e autoclave por 25 min a 121 °C. Use após o resfriamento.
    2. Adicione uma quantidade apropriada de pequenas esferas de vidro estéreis e solução de Tween-80 a 0,01% em um tubo de centrífuga de 2 mL.
    3. Raspe as colônias de fungos no tubo e agite-o o suficiente com um agitador de vórtice até que a colônia seja quebrada. Filtre através de duas camadas de gaze para remover o micélio.
      NOTA: A agitação é feita para garantir a suspensão do conidiósporo em solução Tween-80 a 0,01%.
    4. Conte o número de esporos sob a MO com um hemocitômetro, ajuste para 1 ×10 8 conídios / mL com Tween-80 estéril a 0,01% e mantenha a 4 ° C para uso.
  2. Preparação de besouros
    1. Autoclave os galhos de pinheiro (aproximadamente do mesmo tamanho) e seque no forno (~ 60 °C).
    2. Mantenha M coletado em campo. alternatus adultos com galhos de pinheiro em uma incubadora a 25 ± 1 °C.
    3. Deixe os besouros morrerem de fome por 24 horas e esterilize a superfície dos besouros com água sanitária, etanol e água destilada [10:10:80 (v:v)] antes de usar.
  3. Indução da infecção fúngica
    1. Trabalhe sob uma bancada limpa, mergulhe os galhos de pinheiro em suspensão de conídios por 10 s e seque-os ao ar.
    2. Mergulhe os besouros em suspensão de conídios por 10 s e, em seguida, transfira para tubos estéreis de 50 mL (um besouro e um galho por tubo). Substitua os galhos por novos a cada 2 dias.
    3. Para controle negativo, troque a suspensão de conídios por apenas solução estéril de Tween-80 a 0,01%. Faça cinco repetições para cada cepa de fungo e grupo de controle.
    4. Avalie a atividade dos besouros com base na quantidade de excremento produzido nos galhos do pinheiro. Quando a alimentação cessar, considere-os mortos.
    5. Transfira os besouros mortos para novos tubos estéreis de 50 mL e coloque um pedaço de algodão úmido estéril. Incubar a 25 ± 1 °C.
      NOTA: O algodão úmido é usado para manter a umidade, pois o crescimento de fungos requer umidade adequada, mas não muito.
    6. Observe e fotografe a mudança da superfície do besouro ao mesmo tempo todos os dias.
  4. Re-isolamento e confirmação de espécies de fungos
    1. Até que fenótipos claros de infecção fúngica apareçam na superfície dos besouros, escolha micélio de diferentes tecidos individualmente em novas placas de PDA.
    2. Cultivar a 25 ± 1 °C e observar para garantir que a morfologia é consistente com a dos fungos inoculados.
  5. Tratamento do besouro modelo
    1. Repita as etapas 3.2.1-3.3.6 no besouro modelo Tribolium castaneum, usando farelo de trigo como alimento, e esterilize o farelo de trigo com luz ultravioleta.
    2. Toque levemente nos besouros com uma pinça estéril. Suponha que eles estejam mortos se não houver resposta.

4. Confirmar os fenótipos de infecção de fungos em M. alternatus e besouro modelo

  1. Preparação da amostra para observação
    1. Disseque o M infectado. alternatus com cuidado como na etapa 1.3.
    2. Escolha T. corpos de castaneum com sintomas óbvios de infecção fúngica.
    3. Corte os tampões de disco de 5 mm de quatro colônias de fungos maduros crescendo em BDA.
  2. Pré-tratamento da amostra
    1. Coloque tampões, tecidos de besouro infectados e corpos em glutaraldeído pré-resfriado a 2,5% a 4 ° C por 2 dias.
    2. Lave as amostras três vezes em tampão fosfato a 0,1% (pH 7,2-7,4) por 5 min e desidrate em etanol a 30%, 50%, 70%, 80%, 90%, 95%, 100% por 10 min.
    3. Seque as amostras em um liofilizador a vácuo.
      NOTA: Todo o processo de pré-tratamento deve ser cuidadoso, incluindo corte, imersão, desidratação, lavagem e secagem, para evitar danos à amostra.
  3. Observação de microscopia eletrônica de varredura (MEV)
    1. Cubra as amostras pré-tratadas com platina usando um revestidor de pulverização catódica e observe sob um microscópio eletrônico de varredura36.
    2. Registre as características morfológicas das hifas e conídios que crescem em PDA, M. alternatus e corpos de besouros modelo.
    3. Compare se os resultados são consistentes com os de OM na etapa 2.3.

5. Avaliação da atividade entomopatogênica

  1. Preparação da suspensão de conídios
    1. A preparação da suspensão de conídios é a mesma que nas etapas 3.1.1-3.1.4.
  2. Pré-tratamento do besouro modelo
    1. Cultive, alimente, esterilize e deixe T. Castaneum como na etapa 3.5.1.
    2. Esterilize o farelo de trigo por UV e coloque o mesmo peso nas placas de Petri estéreis.
  3. Teste de atividade entomopatogênica
    1. Trate o farelo de trigo com a suspensão de conídios e seque-o ao ar sob uma bancada limpa em temperatura ambiente.
    2. Mergulhe T. besouros castaneum na suspensão de conídios por 10 s e transferi-los para uma placa de Petri (n = 20 em cada placa de Petri). Substitua o farelo de trigo novo pelo mesmo tratamento de conídios a cada 4 dias.
    3. Para controle negativo, aplique apenas solução estéril de Tween-80 a 0,01%.
      NOTA: Separe pelo menos três réplicas para cada grupo de tratamento e o controle.
    4. Conte os besouros mortos diariamente.
      NOTA: Toque levemente nos besouros com uma pinça estéril. Suponha que eles estejam mortos se houver falta de resposta.
  4. Análise filogenética multigênica
    1. Extrair o ADN genómico de fungos entomopatogénicos conforme descrito no passo 2.1.
      NOTA: A identificação multigênica é realizada para os EPFs parasitas que mostram fenótipos de infecção significativos e fortes atividades entomopatogênicas contra o besouro modelo.
    2. Amplificar os seguintes genes, incluindo uma região que abrange o gene SSU34 ribossômico nuclear, um segmento do gene rRNA de subunidade grande (LSU37,38), parte do gene do fator de alongamento 1-alfa (tef-1α39), a segunda maior sequência de subunidades da RNA polimerase ІІ (rpb240) e parte da β-tubulina41 , usando os pares de primers NS1 / NS4, LR7 / LROR, EF-983F / EF-2218R, RPB2-5'F / RPB2-5'R e TUB1 / TUB22 (ver Tabela 1), respectivamente.
      1. Preparar a mistura de reacção PCR como indicado no passo 2.2.1.
      2. Efectuar a amplificação da seguinte forma: desnaturação inicial a 95 °C durante 4 min, seguida de 35 ciclos (tef-1α, rpb2, SSU), 38 ciclos (LSU) ou 39 ciclos (β-tubulina) de desnaturação a 94 °C durante 60 s, recozimento a 47 °C durante 60 s (LSU), 55 °C durante 60 s (tef-1α), 54 °C durante 40 s (β-tubulina) e 50 °C durante 30 s (rpb2, SSU), alongamento a 72 °C por 1 min e alongamento final a 72 °C por 10 min.
    3. Seqüenciar e alinhar seguindo as mesmas etapas mostradas nas etapas 2.2.4-2.2.5.
    4. Realizar a análise filogenética pelo MEGA 6.0 com base no método de Máxima Verossimilhança (ML)42.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Isolamento e identificação de isolados fúngicos de M. alternatus
Com a ajuda de armadilhas atrativas, um grande número (aproximadamente 500 besouros no total) de M. alternatus foram coletados em cinco regiões geográficas. Cadáveres de besouros com sintomas típicos de infecção por fungos entomopatogênicos foram colhidos; Em seguida, os tegumentos corporais de cada besouro foram dissecados em várias posições, conforme descrito na etapa 1.3 do protocolo. Como resultad...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Diferentes populações geográficas de BEF podem desenvolver interações variadas com os fungos entomopatogênicos naturais, devido à adaptação ambiental de longo prazo das espécies de PFE aos fatores climáticos locais e à população genotípica específica do inseto hospedeiro44,45. A expansão dos locais de amostragem para múltiplas regiões de ocorrência de insetos ajuda a aumentar a possibilidade de aquisição de diversas cepas ou espé...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Os autores declaram não haver conflitos de interesse.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Esta pesquisa foi apoiada pelo Programa Nacional de Pesquisa e Desenvolvimento da China (2021YFC2600100) e pela Fundação de Ciências Naturais da Província de Zhejiang (LY21C040001).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Tubos de centrífuga de 1,5 mL, 2 mLBiosharpBS-15-M
10 µ Pontas de pipeta LSangon BiotechF601216
10 µ L, 20 µ L, 100 µ L, 200 µ L, 1.000 µ L pipetasRainin
1.000 µ Pontas de pipeta LSangon BiotechF630102
2 mL frascos criogênicosCorning430659
20x PBS bufferSangon BiotechB548117-0500
200 µ Pontas de pipeta LSangon BiotechF601227
fabricante de 2.000 pbTaKaRarSD0531
Tubos de 50 mLNest602052
solução de glutaraldeído a 50%Sangon BiotechG916054
tampão TAE 50xSangon BiotechB548101
tampão de carga 6xTaKaRarSD0503
ArmáriobioquímicaA610013
de etanol anidroJkchemicalLB10V37
AgaroseShanghaiyihengLRH-250F
ChloroformJuhua61553
Armadilhas comerciais para besourosFEIMENGDIBF-8www.yinyouji.com
Gerador de imagens em gelBio-RadGelDoc XR+
GlicerolSangon BiotechA600232
Centrífuga refrigerada de alta velocidadeSigmaD-37520
Pote de esterilização a vapor de alta pressãoMettler ToledoJA5003
Álcool isopropílicoReagente geralG75885B
Corante de ácido nucleicoSangon BiotechA616696
Microscópio óptico, OMLeicaDM2000
ParafilmParafilm PM996
Medidor de PCRHeal ForceTrident960
GMarklinGB15743
Ágar dextrose de batata, PDAOxoidCM0139
Caldo de dextrose de batata, PDBSolarbioP9240
PrimersSangon Biotech/
Primers TaqTaKaRarRR902A
Kit de isolamento de DNA genômico de fungos rápidosSangon BiotechB518229
Microscópio eletrônico de varredura, SEMHitachiS-3400N
EstreptomicinaMarklinS6153
TetraciclinaMarklinT829835
Tween-80MarklinT6336
Secador de congelamento a vácuoYamatoDC801
Agitador de vórticeHLDWH-861
β-MercaptoetanolMarklinM6230
de cultivo de de Sangon Biotech Penicilina

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Hajek, A. E., Bauer, L. S. Microbial control of wood-boring insects attacking forest and shade trees. Field Manual of Techniques in Invertebrate Pathology. 10, 505-525 (2007).
  2. Linnakoski, R., Forbes, K. M. Pathogens-the hidden face of forest invasions by wood-boring insect pests. Frontiers in Plant Science. 10, 90(2019).
  3. Hulcr, J., Dunn, R. R. The sudden emergence of pathogenicity in insect-fungus symbioses threatens naive forest ecosystems. Proceedings of the Royal Society B: Biological Sciences. 278 (1720), 2866-2873 (2011).
  4. Humble, L. M., Allen, E. A. Forest biosecurity: alien invasive species and vectored organisms. Canadian Journal of Plant Pathology. 10, 90(2006).
  5. Ahmed, R., Freed, S. Biochemical resistance mechanisms against chlorpyrifos, imidacloprid and lambda-cyhalothrin in Rhynchophorus ferrugineus (Olivier) (Coleoptera: Curculionidae). Crop Protection. 143, 105568(2021).
  6. Al-Ayedh, H., Hussain, A., Rizwan-Ul-Haq, M., Al-Jabr, A. M. Status of insecticide resistance in field-collected populations of Rhynchophorus ferrugineus (Olivier) (Coleoptera: Curculionidae). International Journal of Agriculture and Biology. 18 (01), 103-110 (2015).
  7. Garcia, F. R. M., Ovruski, S. M., Suarez, L., Cancino, J., Liburd, O. E. Biological control of Tephritid fruit flies in the Americas and Hawaii: a review of the use of parasitoids and predators. Insects. 11 (10), 662(2020).
  8. Lacey, L. A., Shapiro-Ilan, D. I. Microbial control of insect pests in temperate orchard systems: potential for incorporation into IPM. Annual Review of Entomology. 53, 121-144 (2008).
  9. Wang, Z. Z., Liu, Y. Q., Shi, M., Huang, J. H., Chen, X. X. Parasitoid wasps as effective biological control agents. Journal of Integrative Agriculture. 18 (4), 705-715 (2019).
  10. Islam, W., et al. Insect-fungal-interactions: a detailed review on entomopathogenic fungi pathogenicity to combat insect pests. Microbial Pathogenesis. 159, 105122(2021).
  11. Ali, S., Huang, Z., Ren, S. Production of cuticle degrading enzymes by Isaria fumosorosea and their evaluation as a biocontrol agent against diamondback moth. Journal of Pest Science. 83 (4), 361-370 (2010).
  12. Vidal, S., Jaber, L. R. Entomopathogenic fungi as endophytes: plant-endophyte-herbivore interactions and prospects for use in biological control. Current Science. 109 (1), 46-54 (2015).
  13. Rasool, S., et al. Seed inoculations with entomopathogenic fungi affect aphid populations coinciding with modulation of plant secondary metabolite profiles across plant families. New Phytololgist. 229 (3), 1715-1727 (2021).
  14. Dara, S. K., Montalva, C., Barta, M. Microbial control of invasive forest pests with entomopathogenic fungi: a review of the current situation. Insects. 10 (10), 341(2019).
  15. Rajula, J., Rahman, A., Krutmuang, P. Entomopathogenic fungi in Southeast Asia and Africa and their possible adoption in biological control. Biological Control. 151, 104399(2020).
  16. Sharma, L., et al. Advances in entomopathogen isolation: a case of bacteria and fungi. Microorganisms. 9 (1), 16(2020).
  17. Echeverri-Molina, D., Santolamazza-Carbone, S. Toxicity of synthetic and biological insecticides against adults of the Eucalyptus snout-beetle Gonipterus scutellatus Gyllenhal (Coleoptera: Curculionidae). Journal of Pest Science. 83 (3), 297-305 (2010).
  18. Yang, T. H., et al. Entomopathogenic fungi-mediated biological control of the red palm weevil Rhynchophorus ferrugineus. Journal of Asia-Pacific Entomology. 26 (1), 102037(2023).
  19. Kepler, R. M., et al. A phylogenetically-based nomenclature for Cordycipitaceae (Hypocreales). IMA Fungus. 8 (2), 335-353 (2017).
  20. Zhou, Y. M., Zhi, J. R., Qu, J. J., Zou, X. Estimated divergence times of Lecanicillium in the family Cordycipitaceae provide insights into the attribution of Lecanicillium. Frontiers in Microbiology. 13, 859886(2022).
  21. Montalva, C., et al. Lecanicillium attenuatum isolates affecting the invasive cypress aphid (Cinara cupressi) in Chile. BioControl. 62 (5), 625-637 (2017).
  22. Futai, K. Pine wood nematode, Bursaphelenchus xylophilus. Annual Review of Phytopathology. 51 (1), 61-83 (2013).
  23. Kobayashi, F., Yamane, A., Ikeda, T. The Japanese pine sawyer beetle as the vector of pine wilt disease. Annual Review of Entomology. 29 (1), 115-135 (1984).
  24. Zhao, L., Sun, J. Pinewood nematode Bursaphelenchus xylophilus. (Steiner and Buhrer) Nickle. Biological invasions and its management in China. 13, 3-21 (2017).
  25. Akbulut, S., Stamps, W. T. Insect vectors of the pinewood nematode: a review of the biology and ecology of Monochamus species. Forest Pathology. 42 (2), 89-99 (2012).
  26. Shimazu, M. Effects of temperature on growth of Beauveria bassiana F-263, a strain highly virulent to the Japanese pine sawyer, Monochamus alternatus, especially tolerance to high temperatures. Applied Entomology and Zoology. 39 (3), 469-475 (2004).
  27. Han, B., Piao, C. G., Wang, L. F., Li, Y., Zheng, R. Z. Survey, identification and virulence test of pathogens of the pine sawyer beetle, Monochamus alternatus, at forest farm of maanshan, anhui province. Forest Research. 20 (20), 204-208 (2007).
  28. Ma, L., Zhang, L., Lin, H., Mao, S. Investigation of pathogens of Monochamus alternatus in east China and virulence. Chinese Journal of Biological Control. 25 (3), 220-224 (2009).
  29. Alvarez-Baz, G., Fernandez-Bravo, M., Pajares, J., Quesada-Moraga, E. Potential of native Beauveria pseudobassiana strain for biological control of pine wood nematode vector Monochamus galloprovincialis. Journal of Invertebrate Pathology. 132, 48-56 (2015).
  30. Dong, Y., Xie, P., Zheng, K., Gu, Y., Fan, J. Teflon coating and anti-escape ring improve trapping efficiency of the longhorn beetle, Monochamus alternatus. Applied Sciences. 13 (3), 1664(2023).
  31. Gul, H. T., Saeed, S., Khan, F. Z. A. Entomopathogenic fungi as effective insect pest management tactic: a review. Applied Sciences and Business Economics. 1 (1), 10-18 (2014).
  32. Takuji Noma Strickler, K. Effects of Beauveria bassiana on Lygus hesperus (Hemiptera: Miridae) feeding and oviposition. Environmental Entomology. 29 (2), 394-402 (2000).
  33. Thakur, R., Sandhu, S. S. Distribution, occurrence and natural invertebrate hosts of indigenous entomopathogenic fungi of Central India. Indian Journal of Microbiology. 50 (1), 89-96 (2010).
  34. White, T. J., Bruns, T., Lee, S., Taylor, J. Amplification and direct sequencing of fungal ribosomal RNA genes for phylogenetics. PCR Protocols. 18 (1), 315-322 (1990).
  35. Zaman, G., Chayen, J. An aqueous mounting medium. Journal of Clinical Pathology. 34 (5), 567-568 (1981).
  36. Koon, M. A., et al. Preparation of prokaryotic and eukaryotic organisms using chemical drying for morphological analysis in scanning electron microscopy (SEM). Journal of Visualized Experiments. (143), e58761(2019).
  37. Vilgalys, R., Hester, M. Rapid genetic identification and mapping of enzymatically amplified ribosomal DNA from several Cryptococcus species. Journal of Bacteriology. 172 (8), 4238-4246 (1990).
  38. Rehner, S. A., Samuels, G. J. Taxonomy and phylogeny of Gliocladium analysed from nuclear large subunit ribosomal DNA sequences. Mycological Reasearch. 98 (6), 625-634 (1994).
  39. Aphidech, S., Kusavadee, S. Isolation, identification, culture and production of adenosine and cordycepin from cicada larva infected with entomopathogenic fungi in Thailand. African Journal of Microbiology Research. 7 (2), 137-146 (2013).
  40. Wang, Y., et al. Polycephalomyces yunnanensis (Hypocreales), a new species of Polycephalomyces parasitizing Ophiocordyceps nutans and stink bugs (hemipteran adults). Phytotaxa. 208 (1), (2015).
  41. Qi, M., Xie, C. X., Chen, Q. W., Yu, Z. D. Pestalotiopsis trachicarpicola, a novel pathogen causes twig blight of Pinus bungeana (Pinaceae) in China. Antonie Van Leeuwenhoek. 114 (1), 1-9 (2021).
  42. Tamura, K., Stecher, G., Peterson, D., Filipski, A., Kumar, S. MEGA6: molecular evolutionary genetics analysis version 6.0. Molecular Biology and Evolution. 30 (12), 2725-2729 (2013).
  43. Wu, S., et al. Discovery of entomopathogenic fungi across geographical regions in southern China on pine sawyer beetle Monochamus alternatus and implication for multi-pathogen vectoring potential of this beetle. Frontiers in Plant Science. 13, 1061520(2022).
  44. Brodeur, J. Host specificity in biological control: insights from opportunistic pathogens. Evolutionary Applications. 5 (5), 470-480 (2012).
  45. Croll, D., Mcdonald, B. A. The genetic basis of local adaptation for pathogenic fungi in agricultural ecosystems. Molecular Ecology Resources. 26 (7), 2027-2040 (2017).
  46. Perez-Gonzalez, V. H., et al. Specific diversity of the entomopathogenic fungi Beauveria and Metarhizium in Mexican agricultural soils. Journal of Invertebrate Pathology. 119, 54-61 (2014).
  47. Debono, M., Gordee, R. S. Antibiotics that inhibit fungal cell wall development. Reviews of Microbiol. 48, 471-497 (1994).
  48. Li, S., et al. Exploring the accuracy of amplicon-based internal transcribed spacer markers for a fungal community. Molecular Ecology Resources. 20 (1), 170-184 (2019).
  49. Wan, J., Dai, Z., Zhang, K., Li, G., Zhao, P. Pathogenicity and metabolites of endoparasitic nematophagous fungus Drechmeria coniospora YMF 1.01759 against nematodes. Microorganisms. 9 (8), 1735(2021).
  50. Ammon, V., Wyllie, T. D., Brown, M. F. Investigation of the infection process of macrophomina phaseolina on the surface of soybean roots using scanning electron microscopy. Mycopathologia. 55 (2), 77-81 (1975).
  51. Throne, J. E., Hallman, G. J., Johnson, J. A., Follett, P. A. Post-harvest entomology research in the United States department of agriculture-agricultural research service. Pest Management Science. 59 (6-7), 619-628 (2003).
  52. Silver, K., et al. The Tribolium castaneum cell line TcA: a new tool kit for cell biology. Scientific Reports. 4 (1), 6840(2014).
  53. Fatehi, S., et al. Characterization of iflavirus in the red flour beetle, Tribolium castaneum (Coleoptera; Tenebrionidae). Insects. 14 (3), 220(2023).
  54. Li, C., et al. Identification and characterization of development-related microRNAs in the red flour beetle, Tribolium castaneum. International Journal of Molecular Sciences. 24 (7), 6685(2023).
  55. Li, J., et al. The TGF-β receptor gene saxophone influences larval-pupal-adult development in Tribolium castaneum. Molecules. 27 (18), 6017(2022).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Entomopathogenic FungiForest Wood BorersMonochamus AlternatusFungal IsolationPathogenicity AssessmentScanning Electron MicroscopyMolecular IdentificationParasitic FungiPhylogenetic AnalysisInsect Pathogenicity

Related Articles