Isolamento, Identificação Comportamental e Avaliação de Patogenicidade de Fungos Entomopatogênicos de uma Broca da Madeira Florestal

Summary

Aqui apresentamos um protocolo para obtenção de fungos entomopatogênicos de uma broca florestal e uma forma substitutiva de avaliar suas atividades entomopatogênicas usando um inseto modelo coleóptero. Este método é eficiente e conveniente para explorar recursos fúngicos entomopatogênicos de pragas de insetos perfuradores de madeira em florestas naturais.

Abstract

As brocas florestais causam graves danos às árvores e perdas econômicas em todo o mundo. A liberação de fungos entomopatogênicos (PFE) durante o período de emergência do BEF é considerada uma alternativa aceitável ao controle químico. No entanto, os recursos do EPF têm sido significativamente menos explorados para FWBs, em contraste com as pragas de insetos agrícolas. Este artigo apresenta um protocolo para explorar os recursos do PFE de FWBs usando populações selvagens de Monochamus alternatus como exemplo. Neste protocolo, a atribuição de armadilhas iscadas com M. Alternatus atrativos para diferentes populações garantiram a coleta de amostras adequadas com sintomas naturais de infecção, durante os períodos de emergência do besouro. Após dissecar finamente os tegumentos e colocá-los em um meio seletivo, as espécies de fungos foram isoladas de cada parte dos corpos dos besouros e identificadas com base em características moleculares e morfológicas.

Várias espécies de fungos foram certificadas como EPFs parasitas por meio da reinfecção de M. alternatus saudáveis com suspensões de esporos. Seus fenótipos comportamentais em M. alternatus foram observados usando microscopia eletrônica de varredura e posteriormente comparados com os do inseto modelo coleóptero Tribolium castaneum. Para os EPFs que apresentam fenótipos de parasitismo consistentes em ambas as espécies de besouros, a avaliação de suas atividades sobre T. castaneum forneceu informações valiosas sobre letalidade para estudos futuros sobre M. alternatus. Este protocolo ajudou na descoberta de EPF recém-relatado em populações de M. alternatus na China, que poderia ser aplicado como uma abordagem eficiente para explorar mais recursos de EPF de outros FWBs.

Introduction

A devastação causada por insetos-praga levou a grandes perdas ecológicas e econômicas nos ecossistemas florestais e agrícolas. A maioria das pragas agrícolas se expõe a inimigos naturais ou agentes de controle artificiais enquanto danifica as plantas hospedeiras. Em vez disso, as brocas florestais (FWB) quase completam todos os seus ciclos de desenvolvimento dentro dos troncos das árvores hospedeiras¹, o que levanta grandes desafios para explorar organismos eficientes de biocontrole de FWB no campo selvagem. O que é ainda pior é que os BEF carregam um grande número de fitopatógenos² ou t....

Protocol

1. Isolamento de fungos de M. alternatus (Figura 1)

1. Colete a amostra de besouro
   1. Colete os besouros serradores de pinheiros M. alternatus usando armadilhas comerciais (ver Tabela de Materiais) iscadas com atrativos antes dos períodos de emergência previstos das populações de besouros em florestas de pinheiros naturalmente infectadas.
      NOTA: Neste estudo, os besouros foram coletados em cinco regiões geográficas do sul da China (Huzhou / Zhejiang, Liangshan / Sichuan, Xiamen / Fujian, Shaoguan / Guangdong, Yulin....

Results

Isolamento e identificação de isolados fúngicos de M. alternatus
Com a ajuda de armadilhas atrativas, um grande número (aproximadamente 500 besouros no total) de M. alternatus foram coletados em cinco regiões geográficas. Cadáveres de besouros com sintomas típicos de infecção por fungos entomopatogênicos foram colhidos; Em seguida, os tegumentos corporais de cada besouro foram dissecados em várias posições, conforme descrito na etapa 1.3 do protocolo. Como resultad.......

Discussion

Diferentes populações geográficas de BEF podem desenvolver interações variadas com os fungos entomopatogênicos naturais, devido à adaptação ambiental de longo prazo das espécies de PFE aos fatores climáticos locais e à população genotípica específica do inseto hospedeiro^44,45. A expansão dos locais de amostragem para múltiplas regiões de ocorrência de insetos ajuda a aumentar a possibilidade de aquisição de diversas cepas ou espé.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Tubos de centrífuga de 1,5 mL, 2 mL	Biosharp	BS-15-M
10 µ Pontas de pipeta L	Sangon Biotech	F601216
10 µ L, 20 µ L, 100 µ L, 200 µ L, 1.000 µ L pipetas	Rainin
1.000 µ Pontas de pipeta L	Sangon Biotech	F630102
2 mL frascos criogênicos	Corning	430659
20x PBS buffer	Sangon Biotech	B548117-0500
200 µ Pontas de pipeta L	Sangon Biotech	F601227
fabricante de 2.000 pb	TaKaRar	SD0531
Tubos de 50 mL	Nest	602052
solução de glutaraldeído a 50%	Sangon Biotech	G916054
tampão TAE 50x	Sangon Biotech	B548101
tampão de carga 6x	TaKaRar	SD0503
Armário	bioquímica	A610013
de etanol anidro	Jkchemical	LB10V37
Agarose	Shanghaiyiheng	LRH-250F
Chloroform	Juhua	61553
Armadilhas comerciais para besouros	FEIMENGDI	BF-8	www.yinyouji.com
Gerador de imagens em gel	Bio-Rad	GelDoc XR+
Glicerol	Sangon Biotech	A600232
Centrífuga refrigerada de alta velocidade	Sigma	D-37520
Pote de esterilização a vapor de alta pressão	Mettler Toledo	JA5003
Álcool isopropílico	Reagente geral	G75885B
Corante de ácido nucleico	Sangon Biotech	A616696
Microscópio óptico, OM	Leica	DM2000
Parafilm		Parafilm PM996
Medidor de PCR	Heal Force	Trident960
G	Marklin	GB15743
Ágar dextrose de batata, PDA	Oxoid	CM0139
Caldo de dextrose de batata, PDB	Solarbio	P9240
Primers	Sangon Biotech	/
Primers Taq	TaKaRar	RR902A
Kit de isolamento de DNA genômico de fungos rápidos	Sangon Biotech	B518229
Microscópio eletrônico de varredura, SEM	Hitachi	S-3400N
Estreptomicina	Marklin	S6153
Tetraciclina	Marklin	T829835
Tween-80	Marklin	T6336
Secador de congelamento a vácuo	Yamato	DC801
Agitador de vórtice	HLD	WH-861
β-Mercaptoetanol	Marklin	M6230