Citometria de fluxo de imagem para estudar a autoagregação microbiana

Summary

Este protocolo descreve uma abordagem quantitativa para medir a autoagregação microbiana usando citometria de fluxo de imagem.

Abstract

As bactérias benéficas e probióticas desempenham papéis essenciais em seus hospedeiros, proporcionando vários benefícios à saúde, incluindo imunidade a doenças infecciosas. A família Lactobacillaceae consiste em bactérias Gram-positivas com propriedades probióticas confirmadas. Este estudo utiliza espécies de Lactobacillaceae como modelo para demonstrar a eficácia da análise de alto rendimento de célula única no estudo da agregação celular. O foco está em analisar a resposta dessas espécies benéficas aos carboidratos simples da dieta.

O estudo mostra como a citometria de fluxo de imagem (IFC) pode superar as diferenças fundamentais na montagem de bactérias probióticas na presença e ausência de carboidratos. O IFC combina o poder e a velocidade da citometria de fluxo convencional com a resolução espacial da microscopia, permitindo medições morfométricas complexas de alta taxa de maneira fenotipicamente definida em uma biblioteca de cepas e condições bacterianas benéficas. Este protocolo fornece informações sobre a autoagregação de espécies de Lactobacillaceae e lança luz sobre sua resposta aos carboidratos da dieta, contribuindo para a compreensão dos mecanismos por trás dos efeitos benéficos dessas bactérias probióticas.

Introduction

A autoagregação bacteriana é considerada uma etapa primária na formação do biofilme. Nesse processo (às vezes também chamado de autoaglutinação ou floculação), bactérias do mesmo tipo formam aglomerados multicelulares que eventualmente se depositam no fundo dos tubos de cultura ou se ligam ao tecido ou superfície alvo¹.

A autoagregação é um fenômeno amplamente observado e foi demonstrado até agora em patógenos Gram-negativos, como o patógeno oportunista Acinetobacter baumannii², o patógeno dentário Aggregobacter actinomycetemcomitans³ e o patógeno emer....

Protocol

O arquivo .ast, com o modelo para Lacticaseibacillus rhamnosus GG (LGG) como exemplo, é fornecido no Arquivo de Codificação Suplementar 1.

1. Preparação de mídia

1. Prepare o caldo Lactobacilli MRS seguindo as instruções do fabricante (55 g em 1 L de água deionizada) e placas de ágar Lactobacilli MRS com ágar 1,5% (p/v) (ver Tabela de Materiais). Após a esterilização em autoclave, o meio está pronto para uso direto ou pode ser armazenado a 4 °C.
2. Prepare 50% (15 g em 1 L de água deionizada) de caldo de soja tríptico (TSB) (ver Tabela de Materiais), ....

Results

Os resultados demonstram que este método pode medir facilmente as diferenças na autoagregação em resposta aos açúcares da dieta em bactérias LAB. Ao separar os indivíduos dos agregados, o método permite calcular a porcentagem da população dos eventos de agregação de todos os eventos em resposta aos açúcares fermentáveis ou não fermentáveis da dieta. Além disso, foi possível medir se há diferenças no tamanho médio da população agregada entre os tratamentos.

As imagens representativas na

Discussion

A citometria de fluxo é um método amplamente utilizado para quantificar intensidades de fluorescência em células eucarióticas, mas pode não fornecer medições precisas para células bacterianas devido ao seu tamanho maior ou agregados pequenos. Esses fatores podem impactar significativamente a quantificação precisa da autoagregação e o nível basal de formação de agregados em diferentes condições. Para resolver isso, a citometria de fluxo de imagem (IFC) foi empregada para obter uma melhor resolução de como os carboidratos .......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Tubos de cultura de 14 mL	Falcon	352051
Tubo de centrífuga de 15 mL	Falcon	352096
Bacto Agar	Baeton,Dickinson and Company	214010
Caldo de Soja Típico	Bacto Baeton,Dickinson and Company	211825
D-(+)-Glicose	Sigma	G7021-1KG
D-(+)-Rafinose pentahidratado	Sigma	83400-25G
Difco Lactobacilos MRS caldo	Baeton,Dickinson and Company	288130
EASY-LOCK MICROPR. 1.5 mL (Eppendorf)	FL medical	23053
IDEAS Software	Amnis/EMD Millipore	N/A	Detalhes disponíveis em: https://www.merckmillipore.com/INTL/en/20150212_144049?ReferrerURL=https%3A%2F%2Fwww.google.com%2F&bd=1
ImageStream X Mark II	Amnis/EMD Millipore	N/A	Detalhes disponíveis em: https://www.merckmillipore.com/INTL/en/20150121_205948?ReferrerURL=https%3A%2F%2Fwww.google.com%2F
MOPS, ácido 3-(N-morfolino)propanossulfônico	Biorreagentes Fisher	BP308-500
Fosfato de potássio dibásico	Fisher Scientific, 174,18 g/mol	BP363-1
Fosfato de potássio monobásico	Sigma, 136,09 g/mol	P0662-500G