Aplicação do pseudovírus Ha-CoV-2 para quantificação rápida de variantes do SARS-CoV-2 e anticorpos neutralizantes

Até maio de 2023, já foram mais de 766 milhões de casos de COVID-19¹. Apesar das campanhas mundiais de vacinação, o SARS-CoV-2 circula e infecta continuamente as pessoas, em grande parte devido ao surgimento de novas variantes como Delta (B.1.617.2) e Omicron (B.1.1.529), que impulsionam novas ondas de infecção ^2,3,4. Dado que o SARS-CoV-2 está em constante evolução, é importante desenvolver ensaios rápidos que possam medir com precisão a infectividade de variantes emergentes e a eficácia dos anticorpos neutralizantes induzidos pela vacina contra essas variantes. Esses ensaios são essenciais para a vigilância da pandemia e para determinar a eficácia das vacinas e seus reforços específicos de variantes.

Devido à natureza altamente contagiosa do SARS-CoV-2, o Centro de Controle e Prevenção de Doenças (CDC) exige que o estudo do SARS-CoV-2 e suas variantes seja conduzido em instalações de nível de biossegurança (BSL) 3 ^5,6. Este requisito BSL-3 limita o uso de vírus vivos para quantificar a infectividade de variantes virais e seus anticorpos neutralizantes em pesquisas comuns e laboratórios clínicos. Além disso, os ensaios tradicionais de neutralização do SARS-CoV-2, tais como os ensaios baseados no efeito da placa ou do cytopathic usando vírus vivos competentes da replicação, são demorados e requerem longos períodos de incubação⁷. Vários pseudovírus SARS-CoV-2 pseudotipados com proteína spike (S) foram desenvolvidos para quantificar a eficácia de anticorpos neutralizantes 8,9,10,11,12. No SARS-CoV-2, a proteína S é a proteína principal que medeia a entrada viral¹³, e é o antígeno principal usado em vacinas SARS-CoV-2 9,10,14,15,16. Os virions pseudotipados da proteína S, como os do vírus da estomatite vesicular (VSV-G) ou lentivírus, têm sido utilizados para a quantificação de anticorpos neutralizantes 17,18,19. No entanto, o pseudovírus baseado em lentivírus normalmente requer 2 a 3 dias de infecção para quantificar os sinais do repórter. Sistemas pseudovírus baseados em VSV geralmente contêm vírus VSV residuais, que podem resultar em altas taxas de resultados falso-positivos e tipicamente requerem 24 h de infecção²⁰.

Um novo sistema de pseudovírus SARS-CoV-2, o pseudovírus híbrido alphavirus-SARS-CoV-2 (Ha-CoV-2), foi recentemente desenvolvido por Hetrick et al¹². O Ha-CoV-2 fornece uma nova ferramenta para a quantificação rápida da infectividade do vírus e da sensibilidade do vírus a anticorpos neutralizantes em laboratórios BSL-2 comuns. Estruturalmente, o Ha-CoV-2 se assemelha à partícula do virion do SARS-CoV-2, consistindo de proteínas estruturais do SARS-CoV-2, incluindo a proteína S (S), a membrana (M), o nucleocapsid (N) e o envelope (E), e não há nenhuma proteína estrutural de outros vírus. Além disso, a partícula Ha-CoV-2 contém um genoma de RNA de expressão rápida de um alfavírus para rápida expressão em células. Foi demonstrado que o Ha-CoV-2 mede rapidamente a atividade neutralizante de anticorpos no soro de indivíduos vacinados e convalescentes¹². Como demonstrado por Hetrick et al., quando comparado com o pseudovírus SARS-CoV-2 baseado em lentivírus em um ensaio do curso do tempo, Ha-CoV-2 expressou o repórter de Luc tão cedo quanto 2-4 h pós-infecção, enquanto o pseudovirus do lentivirus expressou Luc após 24 h¹². Além disso, a aplicação potencial de variantes do Ha-CoV-2 para quantificar anticorpos neutralizantes é demonstrada com o uso de um anticorpo neutralizante monoclonal padrão, o 27BV (ver Figura Suplementar 1)¹². Este trabalho detalha o uso da plataforma Ha-CoV-2 para quantificação rápida da infectividade das variantes do SARS-CoV-2, usando as variantes Delta (B.1.617.2) e Omicron (B.1.1.529) como exemplos. Além disso, a aplicação potencial de variantes de Ha-CoV-2 para quantificar anticorpos neutralizantes é ainda demonstrada usando um anticorpo neutralizante monoclonal padrão, 27BV¹².

1. Montagem de vírus e partículas virais

1. Vetores: Vetores de expressão de compra para SARS-CoV-2 M, E, ou N, bem como o SARS-CoV-2 S (Wild-type, Wt), Delta (B.1.617.2), e Omicron (B.1.1.529) comercialmente.
   Observação : sequências de proteína dos vetores de expressão são fornecidas no arquivo suplementar 1. O fornecedor desses vetores de expressão também pode ser encontrado na Tabela de Materiais.
2. Células e cultura celular: Manter HEK293T células em meio de Eagle modificado (DMEM) de Dulbecco contendo 10% de soro fetal bovino (FBS) inativado pelo calor, 50 unidades/mL de penicilina e 50 μg/mL de estreptomicina.
   NOTA: Todo o trabalho de cultura de células precisa ser feito em um gabinete de biossegurança de fluxo de ar laminar. A transfecção de polietilenoimina (PEI) normalmente requer 5-6 h de incubação. Os horários de início precisam ser considerados com cuidado antes.
3. Montagem de vírus e cotransfecção baseada em PEI: Montar partículas de Ha-CoV-2 por cotransfecção de células HEK293T. Células de sementes em uma placa de Petri de cultura celular de 10 cm (4-5 x 10⁶ células por placa) em 10 mL de meio DMEM completo no dia anterior à cotransfecção. Para este estudo, três placas de Petri são usadas para semear células para a montagem de Ha-CoV-2 selvagem, Delta e Omicron, respectivamente.
4. Incubar placas de Petri durante a noite em uma incubadora de CO₂ a 37 °C. Verifique os pratos na manhã seguinte para garantir que as células sejam 80% confluentes. Remover o meio completo e substituí-lo por 9 mL de meio sem soro DMEM.
5. Para cada prato, prepare uma mistura de cotransfecção com 2,5 μg de cada um dos vetores de expressão de proteína estrutural do SARS-CoV-2 (N, E, M), 10 μg de pAlphaPro-Luc-GFP-PreΨ (Genoma HaCoV2) e 2,5 μg do vetor de expressão da proteína S, variantes Delta ou Omicron S e 45 μL do reagente de transfecção baseado em PEI. Permitir que a mistura de cotransfecção forme complexos incubando por 13 min (não incubar por mais de 30 min).
6. Após a incubação, adicione a mistura de cotransfecção a cada placa de Petri lentamente, gota a gota. Coloque os pratos dentro de uma incubadora de CO₂ a 37 °C por 6 h. Após 6 h, remova o DMEM sem soro e substitua-o por meio DMEM completo. Vírus de colheita em 48-60 h pós-cotransfecção.
7. Colheita e armazenamento do vírus: Colher partículas 48 h após a cotransfecção. Separar as células pipetando repetidamente sobre a superfície da monocamada e coletar células de cada placa, colocar em tubos de centrífuga de 15 mL e centrifugar a 400 x g por 5 min. Recolher o sobrenadante e passá-lo através de um filtro de 0,22 μM. Conservar o pseudovírus Ha-CoV-2 a -80 °C.

2. Ensaio de infectividade viral

1. Células e cultura celular: Manter células HEK293T(ACE2/TMPRSS2) em meio de Eagle modificado (DMEM) de Dulbecco contendo 10% de SFB inativado pelo calor, 50 unidades/mL de penicilina e 50 μg/mL de estreptomicina.
2. Semeadura de células HEK293T(ACE2/TMPRSS2): Um dia antes do ensaio de infectividade viral, sementes HEK293T(ACE2/TMPRSS2) em uma placa de 96 poços em 50 μL de meio DMEM completo. Para cada placa de 96 poços, semeie 2,5 x 10⁴ células em cada poço, e um total de 2,5 x 10⁶ células são necessárias para uma placa. Coloque a placa de 96 poços em uma incubadora de CO₂ a 37 °C durante a noite.
3. Infecção de HEK293T(ACE2/TMPRSS2): Use partículas variantes de Ha-CoV-2 para infectar células HEK293T(ACE2/TMPRSS2). Na manhã da infecção, remover 50 μL de DMEM da placa pré-semeada de 96 poços. Substitua o meio por 50 μL de Ha-CoV-2 Wild-type, Delta ou Omicron por 18 h a 37 °C.
   NOTA: O protocolo pode ser interrompido aqui até que a infecção tenha atingido 18 h de incubação e a placa esteja pronta para ser analisada via Luciferase Assay. O sucesso da infecção é determinado pelo ensaio Luciferase resultante do gene Luciferase expresso nas células infectadas, portanto, quanto mais sinal é produzido, mais bem-sucedida é a infecção da variante Ha-CoV-2.
4. Ensaio de Luciferase: Após 18 h de incubação, adicionar 7,5 μL de tampão de lise celular diretamente a cada poço e misturar por agitação orbital por 2 min. Lise as células em tampão de lise por pelo menos 5 min à temperatura ambiente.
5. Prepare a solução de ensaio de luciferase Firefly misturando a solução de D-luciferina com a solução de ensaio de luciferase Firefly numa proporção de 1:50. Para uma placa inteira de 96 poços, combinar 3 mL da solução de substrato de luciferase com 60 μL da solução de D-luciferina com 2940 μL da solução tampão de luciferase Firefly.
6. Adicionar 25 μL da solução de ensaio de luciferase Firefly aos lisados celulares e misturar a placa por agitação orbital durante 1 min. Analise a atividade da luciferase usando um leitor comercial de microplacas de luciferase.

3. Extração de RNA de Ha-CoV-2 e PCR quantitativo de transcriptase reversa (RT-qPCR)

1. Extração de RNA viral: Extraia o RNA viral do tipo Ha-CoV-2 Wild e das partículas variantes Delta e Omicron do Ha-CoV-2 usando um kit comercial de extração de RNA viral, seguindo as instruções do fabricante. Armazenar o RNA viral extraído a -80 °C ou usá-lo imediatamente para RT-qPCR.
2. RT-qPCR: Realize RT-qPCR no RNA viral usando uma mistura mestre de uma etapa. Realizar a reação em uma máquina de PCR comercial. Observe que o alvo da amplificação é o RNA genômico do Ha-CoV-2. Use o DNA vetorial Ha-CoV-2 como padrão para criar uma curva padrão e calcular o número de cópias de RNA de cada variante.

4. Ensaio de anticorpos neutralizantes

1. Semeadura de células HEK293T(ACE2/TMPRSS2): No dia anterior ao ensaio, semear células HEK293T(ACE2/TMPRSS2) em uma placa de 96 poços em 50 μL de meio DMEM completo. As células HEK293T(ACE2/TMPRSS2) são compradas comercialmente.
2. Para a contagem de células, obter 20 μL de células de um frasco T75 contendo células HEK293T(ACE2/TMPRSS2) e misturar com 20 μL de solução de azul de tripano. Adicionar 20 μL desta mistura à câmara de contagem de células e contar o número de células por ml. Para semear uma placa de 96 poços para infecção, use 2,5 x 10⁴ células por poço, e 2,5 x 10⁶ células serão necessárias no total. Coloque a placa de 96 poços em uma incubadora de CO₂ a 37 °C durante a noite.
3. Ensaio de anticorpos neutralizantes: Em uma placa estéril de polipropileno de 96 poços, prepare o anticorpo neutralizante padrão 27BV e a mistura de Ha-CoV-2. Adicionar 8 μL de 27BV (45 mg/mL) à placa e realizar diluições seriadas do anticorpo com 6 μL de DMEM livre de soro.
   NOTA: Certifique-se de trocar as pontas da pipeta entre as transferências de poço e certifique-se de que o meio livre de anticorpos e soro seja misturado completamente para produzir resultados precisos.
4. Ao anticorpo diluído em série, adicione 54 μL de partícula de Ha-CoV-2 e misture o vírus e o anticorpo. Pré-incubar partículas de Ha-CoV-2 com 27BV diluído em série por 1 h a 37 °C a 5% de CO₂. Após 1 h de incubação, aplicar 50 μL da mistura de anticorpos e Ha-CoV-2 na placa de 96 poços contendo as células HEK293T(ACE2/TMPRSS2) (2,5 x 10⁴ células por poço) semeadas no dia anterior.
5. Para os controles, deixe pelo menos três poços contendo apenas as células HEK293T(ACE2/TMPRSS2). Adicionar 50 μL de meio completo a esses poços para servir como poços não infectados para o sinal de fundo das leituras do ensaio de luciferase.
   NOTA: O protocolo pode ser interrompido aqui até que a infecção tenha atingido 18 h de incubação a 37 °C e, em seguida, a placa esteja pronta para ser analisada via ensaio de luciferase.
6. Ensaio de Luciferase: Após 18 h de incubação, adicionar 7,5 μL de tampão de lise diretamente a cada poço e misturar por agitação orbital por 2 min. Lise as células em tampão de lise por pelo menos 5 min à temperatura ambiente.
7. Prepare a solução de ensaio de luciferase Firefly misturando a solução de D-luciferina com a solução de ensaio de luciferase Firefly numa proporção de 1:50. Para uma placa inteira de 96 poços, combinar 3 mL da solução de substrato de luciferase com 60 μL da solução de D-luciferina com 2940 μL da solução tampão de luciferase de vagalume.
8. Adicionar 25 μL da solução de ensaio de luciferase Firefly aos lisados celulares e misturar a placa por agitação orbital durante 1 min. Analise a atividade da luciferase usando um leitor comercial de microplacas de luciferase.

5. Quantificação e análise estatística

1. Coleta de dados: Realizar dosagens de infecção e luciferase em triplicata conforme indicado (Figura 1). Quantificar a expressão da luciferase com leituras de ensaio de luciferase. A média é o valor médio das três leituras do ensaio de luciferase. As leituras do sinal de fundo de poços não infectados são subtraídas desse valor médio. O desvio padrão (DP) é determinado a partir do valor médio das leituras do ensaio de luciferase.
2. Análise dos dados: Plotar a atividade de neutralização de anticorpos e calcular os valores de ID₅₀ (50% de dosagem de inibição) usando um software gráfico comercial. O valor de ID₅₀ é definido como as diluições inibitórias de anticorpos nas quais se obtém uma redução de 50% na infecção de células HEK293T(ACE2/TMPRSS2) (com base nas leituras do ensaio de luciferase).

As partículas de Ha-CoV-2 foram montadas usando cinco vetores de DNA diferentes que expressam o genoma do RNA do Ha-CoV-2 e as proteínas estruturais (M, N, E e S) do SARS-CoV-2 em células HEK293T. O vetor da proteína S varia dependendo da variante S. A proteína S da cepa original Ha-CoV-2 de Wuhan (Wild-type, Wt) foi usada como controle positivo, e foi montada junto com a proteína S de cada uma das outras duas variantes: a Delta (B.1.617.2) ou a Omicron (B.1.1.529). Os mesmos M, N, E foram usados em todas as variantes. Ha-CoV-2(Wt) e partículas variantes foram coletadas 48 h após a cotransfecção e usadas para infectar células HEK293T(ACE2/TMPRSS2). A infectividade foi medida pela expressão de luciferase 18 h após a infecção. Nesse sistema, níveis mais elevados de expressão do sinal da luciferase refletem uma maior infecção de células por Ha-CoV-2. O sinal da luciferase foi normalizado com cópias de RNA genômico por RT-qPCR para cada variante. Como mostrado na Figura 1, a variante Ha-CoV-2 Omicron gerou sinal 4 a 10 vezes maior do que o Ha-CoV-2 original (Wt), sugerindo uma maior infectividade.

Além disso, a capacidade do 27BV de neutralizar as variantes HaCoV-2(Wt), Delta e Omicron foi quantificada. 27BV é um anticorpo monoclonal do coelho que foi desenvolvido contra o domínio RBD da proteína SARS-COV-2 S1. Para os ensaios de neutralização, diluições seriadas de 27BV foram realizadas em uma placa de 96 poços, pré-incubada com Ha-CoV-2 e, em seguida, adicionadas às células-alvo de HEK293T(ACE2/TMPRSS2). Os resultados demonstraram que o 27BV apresentou atividade neutralizante contra todas as variantes testadas (Figura 2). Curiosamente, o ID50 de 27VB para Omicron foi aproximadamente 10 vezes menos potente do que o ID50 para Ha-CoV-2(WT) e Ha-CoV-2(Delta; Gráfico 2). Esses resultados demonstram que a plataforma Ha-COV-2 pode ser usada como um método rápido para quantificar anticorpos neutralizantes induzidos por vacinas em variantes emergentes.

Gráfico 1. Montagem e quantificação de variantes do Ha-CoV-2. (A) Ilustração da montagem do Ha-CoV-2 e partículas variantes. Os vetores que expressam o genoma do repórter Ha-CoV-2 e as proteínas estruturais (M, S, N e E) são cotransfectados em células HEK293T. As partículas foram colhidas 48 h após a cotransfecção (a imagem da partícula do virion e as células HEK293T foram criadas com Biorender.com). (B) Quantificação da infectividade das variantes do Ha-CoV-2. A infectividade relativa das duas variantes (Delta e Omicron) é quantificada e normalizada usando cópias de RNA genômico de variantes individuais do Ha-CoV-2 (Luc). O tipo selvagem é o Ha-COV-2 (Wt), que é usado como um controle para comparação. Os ensaios de infecção e luciferase foram realizados 3x. UR, unidade relativa. A média e o desvio padrão (DP) são mostrados. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Gráfico 2. Quantificação da atividade de neutralização do 27BV contra variantes do Ha-CoV-2(Luc) A atividade de neutralização do 27BV foi analisada 18 h após a infecção de células HEK293T(ACE2/TMPRSS2). O ID50 foi calculado usando a taxa de infecção relativa (atividade da luciferase) versus a concentração de 27BV. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Gráfico 3. Infecção de HEK293T(ACE2/TMPRSS2) com Ha-CoV-2(GFP). Partículas de Ha-CoV-2 (GFP) foram montadas e usadas para infectar células HEK293T(ACE2/TMPRSS2). A expressão de GFP foi observada 48 h após a infecção usando microscopia fluorescente. O campo branco das células infectadas é mostrado à esquerda, e a imagem da GFP é mostrada à direita. A barra branca representa 100 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura suplementar 1. Resumo Gráfico. A estrutura e aplicação do pseudovírus Ha-CoV-2. Imagem criada com Biorender.com. Clique aqui para baixar este arquivo.

Arquivo Suplementar 1. Sequências de Proteínas. Lista das sequências das proteínas S, M, N e E do SARS-CoV-2. As sequências da proteína S também incluem as variantes do SARS-CoV-2 Omicron (B.1.1.529) e Delta (B.1.617.2). Clique aqui para baixar este arquivo.

Uma patente foi registrada pela Universidade George Mason e licenciada para a Virongy Biosciences Inc. Y.W. é fundador e membro do conselho consultivo da Virongy Biosciences. B. H é atualmente o CEO e Diretor Científico da Virongy Biosciences. Os autores não têm outros conflitos de interesse.