Uma ferramenta para criar automaticamente lacunas livres de células estáveis e reprodutíveis para melhorar a confiabilidade do ensaio de cicatrização de feridas celulares

Resumo

Por meio da incorporação do design da experiência de interação e da análise dos requisitos do usuário, introduzimos um raspador de células inovador que aprimora os ensaios de cicatrização de feridas celulares em termos de reprodutibilidade, confiabilidade, praticidade, integridade celular e experiência do usuário.

Resumo

A confiabilidade da medição da migração celular em ensaios de cicatrização de feridas é frequentemente prejudicada pela instabilidade metodológica prevalente, ou seja, método baseado em pontas. Apresentamos um instrumento inovador projetado para lidar com essas limitações. Nosso novo raspador de células supera a abordagem atual, gerando uma lacuna livre de células mais consistente e estável. Experimentos biológicos repetidos revelam que a lacuna livre de células produzida pelo raspador de células exibe bordas mais retas e tamanho e forma uniformes em comparação com a técnica baseada em ponta (p < 0,05). Em termos de design de produto, o raspador de células possui um esquema de cores refinado adequado para ambientes de laboratório, aprimorando o monitoramento dos resultados experimentais e permite a esterilização por meio de autoclavagem para reutilização. Notavelmente, após o tratamento, o raspador de células demonstra um efeito insignificante na viabilidade e proliferação celular (97,31% e 24,41%, respectivamente). Por outro lado, o método baseado em ponta produz menor viabilidade celular (91,37%) e proliferação (18,79%). Esta investigação apresenta o raspador de células como um novo dispositivo reutilizável capaz de gerar lacunas livres de células reprodutíveis, preservando a viabilidade celular, aumentando assim a confiabilidade dos ensaios de cicatrização de feridas em comparação com as técnicas existentes.

Introdução

Os tumores são caracterizados por características distintas, como vantagens de crescimento seletivo, religação metabólica e modulação imunológica, que contribuem de forma intrigante para o aumento da migração celular, um comportamento maligno crítico das células tumorais. Essa característica afeta diretamente a metástase à distância do tumor primário, comprometendo a sobrevida a longo prazo dos pacientes ^1,2,3. As vantagens do crescimento seletivo permitem que as células cancerígenas superem as células normais, enquanto a religação metabólica suporta essa rápida proliferação, alterando as vias de energia. Ao mesmo tempo, a modulação imunológica permite que os tumores escapem das defesas do corpo. Estudos ressaltam a gravidade desse problema, mostrando que a metástase pulmonar, muitas vezes resultado de uma migração celular aumentada, é um evento terminal que leva à morte de pacientes com vários tipos de câncer⁴. Por exemplo, câncer de mama⁵, carcinoma cervical⁴ e osteossarcoma⁶ são responsáveis por 20%, 9% e 30% desses casos, respectivamente. Portanto, avaliar a migração de células tumorais tornou-se parte integrante da pesquisa oncológica atual, destacando ainda mais a natureza multifacetada da progressão do tumor.

O ensaio de cicatrização de feridas celulares é um método fácil de usar para medir a migração celular in vitro , frequentemente empregado em estudos oncológicos⁷. A maioria dos experimentadores usa pontas de pipeta para criar feridas celulares manualmente⁸. Embora esse método possa formar feridas celulares de forma rápida e conveniente, ele ainda tem muitas limitações que afetam a reprodutibilidade e a precisão para avaliar a migração celular. Em primeiro lugar, o uso manual de ponteiras de pipeta para criar arranhões é altamente influenciado pelo ângulo de operação, força e velocidade do operador, afetando a repetibilidade do método⁸. Em segundo lugar, os defeitos celulares gerados pela ponta geralmente têm bordas irregulares em vez de bordas retas porque as pontas das pipetas são produtos plásticos com certa elasticidade⁹. Alguns estudos geram feridas colocando inserções de cultura pré-fabricadas diretamente na placa de cultura de células para restringir a amplitude de proliferação celular¹⁰. Essa abordagem contorna a limitação do método baseado em dicas, como bordas irregulares e reprodutibilidade. No entanto, mesmo com materiais biocompatíveis, a coexistência a longo prazo da incorporação com as células ainda afeta o crescimento celular¹¹. Além disso, a incorporação também pode causar alterações epigenéticas celulares na zona marginal devido à restrição de contato¹². Além disso, os insertos de contato produzidos a partir de materiais biocompatíveis são caros e difíceis de reutilizar, limitando sua viabilidade¹³. Portanto, uma ferramenta nova, reprodutível e prática é necessária para quantificar facilmente a migração celular in vitro .

O objetivo principal deste método é introduzir uma ferramenta inovadora para quantificar a migração celular in vitro em estudos oncológicos, abordando as limitações das técnicas existentes e aumentando a reprodutibilidade e a precisão na avaliação da migração celular.

A lógica por trás do desenvolvimento dessa técnica reside na importância crítica de avaliar a migração de células tumorais em oncologia. Os tumores exibem características distintas, incluindo vantagens de crescimento seletivo, religação metabólica e modulação imunológica, todos contribuindo para o aumento da migração celular, um aspecto fundamental da malignidade do câncer. Este método visa fornecer um meio mais confiável de estudar a migração celular, contribuindo para uma compreensão mais profunda do comportamento do tumor.

Este método oferece vantagens substanciais sobre as técnicas existentes. Os ensaios manuais de arranhões podem sofrer interferência dependente do operador, enquanto as inserções de cultura podem afetar o crescimento celular e a expressão gênica. Em contraste, este método oferece maior repetibilidade, precisão e praticidade, apresentando uma solução econômica para medir a migração celular in vitro na pesquisa oncológica. Ele atende a uma necessidade crucial de uma ferramenta confiável e acessível para estudar a migração celular em vários tipos de câncer, tornando-se uma adição valiosa ao campo.

Protocolo

O consentimento informado completo por escrito foi fornecido por todos os participantes. A aprovação ética não foi aplicável, uma vez que nenhuma amostra de tecido animal ou humano foi incluída no presente estudo.

1. Investigando os requisitos da comunidade de usuários

1. Entregue questionários aos biólogos/experimentadores que trabalham em ensaios de cicatrização de feridas celulares. Colete os questionários preenchidos e use-os para o estudo. Para este estudo, de 12 de outubro de 2021 a 3 de fevereiro de 2022, foram entregues 100 questionários a 100 biólogos. A porcentagem de resposta foi de 97%.
2. Peça aos entrevistados que respondam a perguntas como: qual dos experimentos de coçar células mais o incomodou? E qual ferramenta foi usada para realizar a coçadura da célula? Siga estas perguntas com subperguntas para rastrear as causas.
3. Investigue as percepções dos experimentalistas sobre ferramentas como pontas de pipeta e inserções de cultura de células em experimentos de cicatrização de feridas celulares. Compreender e reunir suas razões para selecionar uma ferramenta em detrimento de outra, usando a teoria da cadeia de meios-fim baseada em técnicas de escada na seção ^14,15 dos questionários.
   NOTA: O método da escada é dividido em dois tipos: o método da escada macia com entrevistas em profundidade e o método da escada dura com questionários ou questionários de papel e lápis¹⁶. O método de escada rígida foi a principal técnica utilizada neste estudo. A teoria da cadeia de meios-fim sugere que o conhecimento explícito detido pelos usuários-alvo é superficial e concreto, enquanto o conhecimento tácito é profundo e abstrato 17,18,19.

2. Design e modelagem tridimensional

1. Desenhe um esboço a partir dos insights coletados da pesquisa de questionário anterior e inicie o processo de design. Use este esboço preliminar como o projeto fundamental.
   1. Elabore as dimensões e o layout de cada componente aplicando as funções Dim, DimRadius e DimDiameter no software de modelagem.
   2. Realize medições pelo paquímetro com uma precisão de 0,02 mm em placas reais de 6 poços para determinar as dimensões finais do raspador de células. Confirme se eles têm 42,1 mm de comprimento, 42,1 mm de largura e 18,5 mm de altura. Preste atenção aos detalhes na fase de projeto, especialmente a altura do produto e a adequação ao poço, para facilitar uma montagem mais suave.
2. Construa um modelo tridimensional e renderize-o.
   1. Comece o design 3D em um software criando um modelo básico. Clique em botões como ExtrudeCrv para alongamento e Loft para moldar o design. Refine o modelo e clique em FileEdge para suavizar as arestas.
      NOTA: Outros botões de função usados incluem, Linhas - Para desenhar segmentos de linha reta, Polilinhas - Para criar linhas contínuas compostas por vários segmentos, Retângulos - Para desenhar formas retangulares, Círculos - Para desenhar formas circulares, Arcos - Para desenhar formas de arco ou elípticas, Pontos - Para colocar marcadores de ponto único, Texto - Para adicionar rótulos de texto, Dimensões - Para adicionar dimensões medidas a modelos, Matriz - Para criar padrões copiados de objetos, Girar - Para girar objetos nos ângulos desejados, Mover - Para mover objetos para novos locais, Dimensionar - Para redimensionar objetos maiores ou menores, Aparar / Estender - Para aparar ou estender objetos para atender a outra geometria, União booleana/Diferença / Interseção - Para combinar, subtrair ou encontrar a interseção de objetos, Camadas - Para organizar objetos em diferentes camadas, Renderizar - Para gerar vistas renderizadas com materiais e iluminação e Exportar - Para exportar a geometria do modelo para outros formatos de arquivo.
   2. Importe o modelo para um software de renderização 3D. Aplique materiais como plástico, esponja e aço e, em seguida, ajuste a iluminação para uma renderização realista.
      NOTA: Uma lista generalizada de botões de função inclui: Arrastar e soltar - Para aplicar materiais diretamente a peças ou modelos, arrastando um material da biblioteca e soltando-o no componente desejado na visualização em tempo real, Clique com o botão direito do mouse - Ao clicar com o botão direito do mouse em um material na biblioteca, você normalmente verá opções para: Aplicar à seleção - Aplicar o material a uma peça selecionada na visualização em tempo real. Editar material - Ajuste as propriedades do material. Propriedades do material (após selecionar um material) - Para acessar e modificar propriedades específicas do material, como cor, rugosidade, índice de refração e outros atributos. Barra de pesquisa - Para encontrar rapidamente um material na biblioteca digitando seu nome ou palavras-chave associadas. Categorias/pastas - Para navegar por diferentes categorias ou pastas de materiais como metais, plásticos, vidro, etc. Adicionar aos favoritos - Para marcar determinados materiais como favoritos para facilitar o acesso durante sessões futuras. Teclas de atalho - Algumas operações podem ser acessadas por meio de teclas de atalho. Por exemplo, M geralmente é a tecla de atalho para exibir rapidamente as propriedades do material de uma peça selecionada.
   3. Por fim, aprimore o contraste (+56) e a saturação da imagem (Vibração +19, Saturação +7) no software de foto e design e adicione elementos de plano de fundo (informações de texto e cor de fundo gradiente branco a cinza claro) para contexto para garantir uma representação realista e de alta qualidade do produto.
      1. Use Ajustes de > de imagem, Brilho/Contraste para ajustar o contraste de uma imagem. Use Imagem > Matiz/Saturação para modificar o nível de saturação da imagem. Use a Ferramenta Texto (ícone T) para adicionar informações de texto à imagem.
         NOTA: Uma lista generalizada de botões de função inclui a Ferramenta Elipse (U) - Para desenhar pontos/círculos. Defina a ferramenta para desenhar uma forma, escolha a cor de preenchimento desejada e clique e arraste (segurando a tecla Shift para manter um círculo perfeito) para criar um ponto. Ferramenta Linha (U) - Para desenhar linhas retas na imagem. Selecione a ferramenta, defina a largura da linha desejada e clique e arraste para desenhar uma linha. Ferramenta Pincel (B) - Uma maneira alternativa de desenhar pontos e linhas. Selecione o tamanho e a forma do pincel e clique (para pontos) ou clique e arraste (para linhas).
3. Depois de completar o modelo tridimensional, prossiga para produzir o raspador de células através do método de moagem e montagem 20,21,22.

3. Produção

1. Empregue a teoria de cor, materiais e acabamento (CMF) no estudo atual para projetar os protótipos do raspador de células. A teoria CMF serve como uma metodologia de design na pesquisa científica. Melhora a usabilidade do produto, molda a percepção do usuário e direciona a seleção de materiais 23,24,25.
   1. Selecione as cores a serem usadas no raspador de células do sistema de cores padrão, incluindo Preto 6 C, Cinza Frio 6 C e 11-0601TPG^26,27.
   2. Para construir o raspador de células que atenda aos padrões de laboratório, escolha materiais apropriados, incluindo polipropileno (PP), esponja e aço de alto carbono. Para a fabricação de protótipos físicos, comece empregando uma impressora 3D para produzir a estrutura estrutural. Posteriormente, utilize conectores ou agentes adesivos para concluir a montagem do raspador.
      NOTA: Para preparar o produto físico do raspador de células, triture e monte os materiais necessários. Os protocolos de segurança devem ser seguidos durante todo o processo para garantir um produto final seguro e eficaz.
   3. Passe para o processo de acabamento, que pode envolver corte, retificação, polimento, estampagem ou outras técnicas. Comece lixando o modelo usando uma lixa de grão médio e grão 120 para remover quaisquer arestas.
   4. Em seguida, aplique uma lixa de grão fino e grão 220 para obter uma superfície lisa.
   5. Pós-lixamento para alisar as superfícies, garantindo que os conectores plug-in ou embutidos sejam combinados corretamente.
   6. Junte a corrediça I e II com segurança usando os conectores (hastes fixas) para garantir uma montagem robusta e durável do raspador de células. Obtenha a forma fixa final do raspador de células por meio de uma combinação de fixação mecânica e colagem adesiva. Use fixadores, especificamente uma estrutura de encaixe e espiga, para prender as peças juntas por meio de força mecânica. Além disso, para aumentar a resistência do conjunto, aplique adesivo (cola) para unir ainda mais os componentes.
   7. Autoclave o raspador a 121,3 °C por 30 min para garantir que ele mantenha sua forma original e propriedades físicas.

4. Cultura celular

1. Cultive células HOS em meio essencial mínimo suplementado com 10% de soro fetal bovino (FBS) e 1% de penicilina-estreptomicina. Cultive-os a 37 °C com 5% de CO₂.
2. Troque o meio de cultura a cada 2 dias.
3. Quando o crescimento celular ultrapassar 80% de confluência, adicione 1 mL de tripsina com 0,25% de EDTA e digerir por 60 s. Em seguida, centrifugue as células a 300 x g por 5 min para subcultura. Remova o sobrenadante e adicione o meio de cultura para obter uma concentração final de 5 x 10⁴ células por poço. Use um contador de células automatizado para contar células.

5. Avaliação do potencial de lesão celular do raspador de células e método baseado em dicas

1. Prepare todos os materiais para feridas e esterilize-os com radiação ultravioleta, expondo por 30 min.
2. Após a esterilização, enrole 100% de células HOS confluentes em placas de 6 poços a uma concentração de 5 x 10⁴ células por poço usando o método raspador de células ou o método baseado em pontas.
   1. Para o método baseado em ponta, use uma ponta de 100 μL e arraste-a pela célula contendo o meio com 1 traço na direção horizontal e o outro na direção vertical.
   2. Para o método do raspador de células, coloque o protótipo do raspador em um dos poços e com a ajuda da pinça pressione suavemente uma vez. As células estão feridas. Realize cada experimento de ferimento em triplicado.
3. Analise todas as feridas celulares usando um sistema de microscópio digital e software de imagem.

6. Medir a viabilidade celular e a proliferação celular

1. Realize todos os ensaios de viabilidade celular seguindo o protocolo fornecido no Kit CCK-8.
2. Incubar as células com a solução de CCK-8 durante 2 h a 37 °C e, em seguida, medir a sua absorvância a 450 nm utilizando um leitor de microplacas para quantificar as viabilidades celulares.
3. Projete o ensaio de incorporação de 5-etinil-20-desoxiuridina (EdU) para quantificar com precisão a duplicação do DNA e quantificar diretamente a taxa de proliferação celular. Determinar a influência de diferentes métodos para gerar feridas celulares na proliferação celular usando o ensaio EdU, seguindo o protocolo descrito na publicação anterior²⁸.
4. Pinte as células e visualize-as usando um sistema de microscópio digital. Certifique-se de que cada experimento seja realizado em triplicado.

Resultados

Dissecando as demandas dos usuários por ferramentas para gerar feridas celulares
O método experimental atual para gerar feridas celulares exige mais aprimoramento para abordar muitas questões que comprometem a reprodutibilidade biológica, robustez, consumo econômico e experiência do usuário do ensaio de cicatrização de feridas celulares. Utilizou-se o método de escada rígida para analisar as necessidades dos usuários envolvidos em experimentos biológicos por meio de questionários²⁹ (Figura 1A). As informações envolvidas no questionário, como nomes, foram anonimizadas para proteger sua privacidade. Os detalhes do questionário são apresentados na Tabela 1. Durante 6 semanas de pesquisa para 100 indivíduos, 97 questionários totalmente preenchidos foram recebidos, 3 questionários suspeitos e inválidos foram excluídos; A taxa de resposta foi de 97,00%.

Os resultados demonstram que os problemas mais preocupantes no ensaio de cicatrização de feridas celulares foram a borda serrilhada (não reta) e a largura instável ou áreas de feridas, representando 55,67% e 29,90%, respectivamente. Estes foram significativamente maiores do que aqueles de menor taxa de crescimento celular, contaminação celular e outras opções com 3,09%, 5,15% e 6,19%, respectivamente (p < 0,001, Figura 1B). Em relação à seleção de ferramentas para criar feridas, o uso de ponteiras de pipeta foi muito mais prevalente do que as pastilhas de cultura de células (Figura 1C). Foi atribuído principalmente ao fato de que as pastilhas de cultura de células são bastante caras e não reutilizáveis (Figura 1D), enquanto as ponteiras de pipeta são baratas, apresentam reprodutibilidade experimental (6,59%) e viabilidade celular (20,88%, Figura 1E). É importante ressaltar que até 69,23% dos usuários argumentaram que o preço das pastilhas de cultura de células estava acima de seu orçamento (Figura 1D). Em contraste, apenas 6 indivíduos escolheram inserções de cultura de células, nas quais apenas 16,67% acharam seu preço aceitável (Figura 1F). Por fim, quanto à ferramenta inovadora para gerar feridas celulares, 86,60% deles estavam otimistas, enquanto apenas menos usuários não estavam dispostos (4,12%, Figura 1G).

Posteriormente, as características do produto de que os usuários precisavam urgentemente foram dissecadas 30,31,32. Essas características incluíam feridas retas, largura e área estáveis das feridas, alta reprodutibilidade e preço aceitável. Assim, as atividades de design subsequentes foram realizadas.

Decisão de projetar elementos e materiais usados no desenvolvimento do raspador de células
Os dados acima mostram que os suprimentos de laboratório implementados na pesquisa biológica de rotina devem ser estritamente estéreis para evitar a contaminação celular³³. Portanto, o raspador de células proposto deve ser estéril. Embora as ferramentas descartáveis possam ser esterilizadas por óxido de etileno, o custo experimental inevitavelmente aumentará 34,35,36. Portanto, em vez de materiais descartáveis, propomos projetar o raspador de células com um material reutilizável com grande tolerância à esterilização a vapor de alta pressão (121,3 °C), para reduzir o custo e aumentar a flexibilidade quando aplicado em diferentes casos³⁷. Para atender a esses requisitos, o material usado para construir o raspador de células deve ter certas características físicas e químicas, incluindo resistência ao calor, alta pressão e corrosão por vapor de água.

Para o uso pretendido do raspador de células, além de atender às funções básicas, como fazer as feridas retas, ele também deve ter um design e cor atraentes. Em termos de modelagem, considerando os campos alvo e de aplicação, o estilo geral deve ser adequado para os laboratórios. A aparência não deve ser muito ostensiva para impedir o pessoal de observar a progressão experimental. Além disso, seu tamanho deve ser adequado para placas de seis poços, e a superfície deve ter uma saliência para que a pinça a pegue de forma estável.

CMF em design é um aspecto crítico do design de produto que influencia a estética e a experiência do usuário. A escolha da cor afeta a resposta emocional, a seleção do material afeta a funcionalidade e a sustentabilidade e o acabamento determina a sensação tátil e o apelo visual. Os designers da CMF harmonizam esses elementos, considerando as tendências do mercado e a identidade da marca, para criar produtos que ressoam com os usuários.

De acordo com a teoria CMF, três fatores críticos, incluindo cor, material e processo de acabamento, foram considerados para determinar seus impactos na função e no efeito visual²⁴. A seleção de cores foi realizada primeiro. Nesse contexto, a cor refere-se à cor intrínseca, que é a cor inerente de um objeto ou substância sob condições de iluminação padrão, desprovida da influência de fontes de luz externas ou reflexos. Dado que a placa de seis poços é feita de PP com uma superfície transparente, o cinza escuro foi escolhido como cor intrínseca. Essa escolha foi feita para facilitar a identificação e a operação, pois o cinza escuro oferece contraste e visibilidade ideais quando sobreposto a outras cores. Além disso, o cinza escuro tem menos probabilidade de causar distorção de cor quando combinado com outras cores, o que também é crucial para a observação. Os componentes funcionais essenciais foram ainda distinguidos pelo preto (Figura 2A).

O sistema comercial de correspondência de cores foi selecionado como padrão para seleção de cores devido à sua ampla aceitação e uso em vários setores. Baseando-se na capacidade da empresa de reproduzir cores consistentes em diferentes mídias, ela foi escolhida para o estudo, pois isso é crucial para garantir uma representação de cores precisa e consistente.

A seleção do material foi realizada com base nos resultados dos questionários acima mencionados. O invólucro e os componentes do raspador foram feitos de um plástico resistente ao calor, polipropileno (PP), para atender aos requisitos de esterilização por autoclave, como exemplo mostrado na Figura 2B. O aço de alto carbono é adequado para molas, porque é estável contra ambientes de laboratório resistentes à corrosão de alta e baixa temperatura. Esponjas de alta densidade foram usadas para tamponamento e colocadas no final da lâmina.

Por fim, foi desenvolvido o processo de acabamento. Como o raspador de células é usado com frequência e facilmente contaminado e a qualidade da superfície afeta a esterilização, uma superfície lisa e brilhante é preferível para o raspador de células, pois ajuda o usuário a identificar rapidamente a fonte de contaminação e lidar com ela, dando uma sensação de limpeza. As pontas são parcialmente lixadas para evitar danos ao fundo da placa de cultura, o que pode afetar o ambiente de cultura e resultar em restrição da proliferação celular³⁸.

Projeto e protótipo do raspador de células
Três protótipos de raspador de células foram projetados com base nos resultados mencionados acima (Figura 3A). Estudos mostram que as feridas celulares mais comumente usadas dentro de placas de cultura de células eram em forma de cruz³⁹, o que é bem diferente do protótipo I que empregava feridas retangulares; portanto, o protótipo I foi dispensado (Figura 3A). Embora os protótipos II e III pudessem criar áreas livres de células em forma de cruz, o trilho deslizante do protótipo II era difícil de fixar em discos de cultura de células e sua infraestrutura era bastante complicada (Figura 3A). Após discussões prudentes, o protótipo III foi distinguido como o modelo final para produzir raspador de células.

Notavelmente, dado que a forma das pontas pode afetar diretamente a área livre de células em termos de bordas e tamanhos, três esboços foram projetados para seleção. O esboço eu tinha um topo afiado, que poderia fornecer bordas muito retas; no entanto, a interface de cultura que permite a proliferação celular pode ser prejudicada se as pontas forem muito afiadas (Figura 3B). O esboço II ofereceu um topo quadrado, o que pode evitar o comprometimento das placas de cultura de células. No entanto, como a superfície de contato entre a ponta e o fundo da placa de cultura é quadrada, ela é instável ao usá-la (Figura 3B). O esboço III forneceu uma ponta arredondada romba, evitando efetivamente os problemas acima (Figura 3C). Portanto, foi selecionado como o projeto final.

O design foi otimizado em três aspectos: o método de fixação do fixador, a esponja de almofada embutida e a facilidade de preensão, respectivamente. Primeiro, os métodos de fixação do produto esperados incluíam flambagem⁴⁰, encaixe e espiga⁴¹ e giro⁴². Considerando o custo real de produção e operabilidade, uma garra foi projetada sob o fixador em forma de cruz para facilitar a fixação da borda do poço. Além disso, no teste de cicatrização de arranhões celulares, observamos que as pontas se recuperaram após tocar a parede perto do final devido ao comprimento fixo e à dureza das lâminas, o que afetou o estado de arranhões. Portanto, adicionamos uma esponja de amortecimento na extremidade do slide para estabilizar o movimento das pontas. (Figura 3A,C). Finalmente, uma depressão superficial foi adicionada à saliência para facilitar a preensão da pinça.

Um modelo tridimensional foi construído usando o software de design 3D. Sua renderização é mostrada na Figura 4A. O gráfico explosivo elabora as estruturas internas detalhadas do raspador de células, o que mostra suas características necessárias discutidas acima (Figura 4B). Além disso, para atingir o objetivo de deslizamento suave das pontas e bordas retas, a estrutura interna de transmissão de energia mecânica é adotada. Toda a unidade funcional do raspador de células é composta pela parte de controle. No trabalho real, a alavanca de articulação dentro do raspador de células é conectada ao botão superior e a extremidade se move para baixo após a aplicação de pressão para fazer a extremidade se curvar. A mola dentro do slide é liberada para empurrar as pontas para se mover. Finalmente, ele para na esponja com uma fenda estreita para terminar a raspagem e, em seguida, alterna para reiniciar quando usado novamente (Figura 5A). Além disso, a facilidade de aprendizado e a conveniência de operação são os critérios para um biólogo medir a qualidade do produto. Portanto, para o design da aparência do produto, o layout da superfície seguiu o princípio de simetria e limpeza^43,44, distinguindo e destacando diferentes componentes por meio de diferentes tons de preto, branco e cinza (Figura 5A).

O raspador de células é superior ao método de arranhar as pontas no uso prático
O produto físico do raspador de células foi preparado usando o método de moagem e montagem (Figura 5B). Como esperado, o raspador de células integrou-se perfeitamente à placa de seis poços, com o suporte superior em forma de cruz encaixando-se perfeitamente na borda da placa, proporcionando uma forte fixação (Figura 5C). Além disso, as pontas se encaixavam precisamente no fundo da placa de seis poços, facilitando a geração suave de áreas livres de células. Finalmente, o raspador de células foi autoclavado para testar se poderia ser reutilizável. Conforme os resultados mostrados na Figura 5D, o raspador de células atual manteve a forma original e o desempenho físico mesmo após autoclavagem sob 121,3 ° C por 30 min.

O raspador de células superou o método de criação de feridas celulares existente no teste de referência. Após repetidos testes, o arranhador de células apresentou alta estabilidade e reprodutibilidade no preparo da ferida, apresentou baixa flutuação na área de cada ferida e bordas quase retas, com desvio padrão da área livre de células de 483,73 e desvio para borda reta de 5041,33 ± 2420,00. Em contraste, a área de cada ferida preparada pelas pontas da pipeta apresentou maior flutuação, com desvio padrão da área livre de células de 3905,80 e desvio para a borda reta de 19562,33 ± 1068,39 (Figura 6A-C).

Finalmente, o efeito na viabilidade celular após feridas celulares foi avaliado (Figura 6D). Os resultados demonstraram que 12 h após a conclusão da ferida celular, a viabilidade celular foi ligeiramente, mas significativamente maior no grupo raspador de células do que no grupo pontas. O ensaio EdU foi realizado para confirmar ainda mais esses resultados e esclarecer o impacto de diferentes métodos de preparação de feridas celulares na proliferação celular, ou seja, na replicação do DNA. Os resultados do ensaio EdU mostraram que a porcentagem de células em proliferação no grupo raspador de células (24,41% ± 0,48) foi significativamente maior do que no método tips (18,79% ± 1,46) após 12 h (Figura 6E,F).

Esses dados atestaram fortemente que o atual gerador de feridas celulares superou o método atual para criar feridas celulares em termos de estabilidade e reprodutibilidade biológica. Teve um baixo impacto na viabilidade e proliferação celular. Todas essas vantagens notáveis do gerador de ferida celular confirmaram seu potencial para melhorar os ensaios atuais de ferida celular, garantindo a confiabilidade e a repetibilidade dos dados resultantes.

Figura 1: Análises de demandas do usuário. (A) O gráfico de Sankey apresenta o fluxo de trabalho da investigação baseada em questionários para experimentadores. (B) a (G) exiba os resultados dos questionários, incluindo as perguntas 1 a 6. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2: Design do produto com cores e materiais utilizados. (A) Seleção de cores. (B) Autoclave usada em experimentos biológicos. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3: Projeto de produto de estruturas detalhadas. (A) Três protótipos candidatos de raspador de células. (B) Três esboços de design de ponta. (C) Desenho de três vistas do protótipo III selecionado apresentando seu projeto geral e os parâmetros físicos e espaciais. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 4: Modelo tridimensional renderizado e exibição de estruturas internas. (A) Renderização do modelo tridimensional. (B) Gráfico explosivo demonstrando as estruturas internas do raspador de células proposto. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 5: Mecanismos de trabalho do raspador de células. (A) Os esboços mostram como funciona o raspador de células. (B) Produto físico do raspador de células. (C) O raspador de células se encaixa em uma placa de 6 poços. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 6: Validação experimental do raspador de células. (A) As feridas celulares geradas por diferentes métodos e seus resultados de comparação agrupados foram mostrados em (B) e (C), a barra de escala é de 100 μm. (D) Resultados de viabilidade celular. (E) e (F) Resultados do ensaio Edu, a barra de escala é de 50 μm. Para a avaliação estatística, foi realizado o teste t para comparação agrupada, e o valor de p original foi ajustado pelo teste de Holm-Bonferroni para evitar resultados falso-positivos. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

I) Qual das opções a seguir é a questão mais preocupante para você no experimento de arranhar células?

A) Sem bordas retas

B) Largura instável

C) Proliferação lenta

D) Contaminação celular

E) Outros

II) Quais ferramentas você usa para gerar feridas celulares

A) Ponteiras de pipeta (consulte a pergunta III)

B) Insertos de cultura de células (consulte a pergunta IV-V)

III) Por que você não escolhe inserções de cultura de células?

A) Viabilidade celular

B) Não reutilizável

C) Custo

D) Outros

IV) Por que você escolheu as pastilhas de cultura de células?

A) Custo

B) Repetibilidade

C) Outros

V) Quais você acha que são os problemas mais graves com as inserções de cultura de células?

A) Status da célula

B) Não reutilizável

C) Caro

D) Outros

E) Satisfeito

VI) Se houvesse uma ferramenta de arranhar barata, reutilizável (autoclavável) e altamente reproduzível, quão disposto você estaria a comprá-la e usá-la?

A) Muito disposto

B) Disposto

C) Não tenho certeza

D) Relutante

Tabela 1: O questionário utilizado neste estudo compreende seis perguntas destinadas a compreender as situações que os biólogos encontram durante os ensaios de cicatrização de feridas celulares.

Discussão

O presente estudo teve como objetivo desenvolver uma ferramenta mecanizada automática para ensaio de cicatrização de feridas celulares. Até onde sabemos, representa a primeira tentativa de aplicar uma estrutura mecanizada para criar feridas celulares automaticamente com um clique. Com isso, pretendemos resolver as deficiências do método tradicional baseado em dicas, como baixa reprodutibilidade e estado de arranhão instável. Beneficiando-se dos resultados positivos e do feedback encorajador da comunidade de usuários, espera-se que o raspador de células forneça aos experimentadores uma alternativa eficiente e estável para a criação de feridas celulares, melhorando significativamente o nível de confiança dos resultados da análise experimental.

Para o uso do raspador de células atual, o usuário deve 1) preparar as células pendentes para criar uma lacuna livre de células semelhante aos métodos tradicionais, como o método baseado em pontas, ou seja, semear células em uma placa de seis poços em uma determinada densidade; 2) esperar que a taxa de convergência celular atinja > 90%; 3) coloque o raspador de células estéreis em um poço de placa, clique no botão conforme ilustrado na Figura 5 e a lacuna livre de células será criada automaticamente dentro de 1-2 s.

O ensaio de cicatrização de feridas celulares tem sido amplamente empregado para medir a capacidade de migração celular. Normalmente, os experimentadores usam pontas de pipeta para criar feridas celulares. Por exemplo, Tariq et al. usaram uma ponta de pipeta para criar feridas celulares para avaliar a capacidade de migração celular⁴⁵; não por coincidência, Rahimi et al. usaram uma ponta de pipeta em um ensaio para observar a capacidade migratória das células PC3⁴⁶; no ensaio de migração de células mesenquimais de camundongos, Cormier et al. também usaram uma pistola de pipeta⁴⁷; ao demonstrar o efeito do arsênio na migração de células da pele, Pinto et al. utilizaram uma ponta de pipeta para raspagem vertical⁴⁸, entre outros.

No entanto, como mencionado anteriormente, o uso de uma ponta para criar feridas celulares apresenta vários problemas, como área livre de células variável, bordas irregulares e dependência da força do operador e do ângulo de arranhões, resultando em baixa reprodutibilidade⁴⁹. Os resultados atuais dos questionários também provaram que o método baseado em ponta tem vantagens mais aparentes sobre as inserções de cultura de células, especificamente em termos de preço, taxa de sobrevivência celular e reutilização da ferramenta. Alternativamente, as inserções de células são muito caras e difíceis de reutilizar, enquanto qualquer uma das ferramentas apresenta defeitos. Portanto, a comunidade de usuários geralmente é otimista e disposta a experimentar ferramentas inovadoras. Este estudo projetou e desenvolveu uma nova ferramenta de preparação de área livre de células para facilitar e estabilizar a criação de feridas celulares.

A contribuição mais importante do presente estudo reside no desenvolvimento e validação experimental do raspador celular. Em comparação com os estudos anteriores, as melhorias do raspador de células atual incluem os três pontos principais a seguir. 1) fabricação estável e conveniente de feridas celulares. Este estudo mostrou que, em comparação com o método tradicional baseado em pontas, as feridas celulares fabricadas pelo raspador de células atual tinham bordas retas e poderiam criar feridas semelhantes em experimentos repetidos, o que melhorou muito a reprodutibilidade e a confiabilidade dos experimentos de cicatrização de feridas celulares. 2) O raspador de células atual teve menos efeito sobre o estado celular. Não afetou a viabilidade e proliferação celular (amplificação do DNA), que foi significativamente melhor do que o método baseado em pontas. Portanto, espera-se que este raspador de células reduza ainda mais a influência de fatores externos no ensaio de cicatrização de feridas celulares em experimentos de rotina. 3) Este raspador de células está de acordo com as demandas da comunidade de usuários. Os resultados da pesquisa de questionário anterior mostraram que os requisitos dos usuários para a nova ferramenta de feridas celulares incluem principalmente largura de curso uniforme, alta reprodutibilidade, procedimento de operação simples e preço moderado, que foram alcançados no atual raspador de células. Além disso, o raspador de células é projetado em cores neutras para transmitir o conceito de design simples e prático deste produto. Ao mesmo tempo, o forte contraste preto e branco destaca efetivamente suas áreas funcionais. O estilo geral é uma forma de cruz formada pela articulação arredondada da superfície curva, referenciando a forma convencional da ferida e sugerindo o papel do produto. A dificuldade da operação é reduzida simplificando a operação e a função de reinicialização manual. Em resumo, os resultados indicam uma ferramenta alternativa promissora para os experimentadores prepararem arranhões celulares de maneira automatizada e robusta com um clique, melhorando assim a reprodutibilidade dos resultados científicos.

As limitações deste estudo devem ser reconhecidas. O tamanho da amostra dos entrevistados do questionário limita a generalização deste estudo; portanto, expandiremos ainda mais o tamanho da amostra em um estudo de acompanhamento para melhorar o raspador de células. Em segundo lugar, o raspador de células precisa ser incluído em um estudo bem planejado com uma população maior de usuários para que o desempenho desse raspador de células possa ser avaliado de forma mais abrangente.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
CCK-8 Kit	Beyotime Company, China	C0037
sistema de microscópio digital	Olympus	IX81
soro fetal bovino	Gibco, EUA	16000044
HOS	Procell Ciências da Vida & Technology Co., Ltd	CL-0360
Image-Pro Plus	Media Cybernetics	versão 6.0
KeyShot	Luxion	versão 11.0	Software de renderização 3D
leitor de microplacas	BioTek, alemão	ELX808
Minimum Essential Medium	Gibco, EUA	11095080
Sistema de correspondência	Pantone Pantone		correspondência de cores comercial
penicilina-estreptomicina	Beyotime Company, China	ST488
Photoshop	foto e design	da Adobe
Rhinoceros 3D	Robert McNeel & Software	design 3D	versão 7.0
TC20 Contador de Células Automatizado	Bio-Rad	TC20
Tripsina	Cytiva  HyClone, Estados Unidos	SH30042.01