Em Planta Expressão Gênica e Edição Gênica em Folhas de Bambu Moso

Resumo

Neste estudo, um novo método de expressão gênica e edição gênica mediado por Agrobacterium foi desenvolvido em bambu. Este método melhorou muito a eficiência da validação da função gênica em bambu, o que tem implicações significativas para acelerar o processo de criação de bambu.

Resumo

Um novo método de transformação gênica em plantas foi desenvolvido para o bambu, o que evita a necessidade de processos demorados e trabalhosos de indução e regeneração de calos. Este método envolve a expressão gênica mediada por Agrobacterium via ferimento e vácuo para mudas de bambu. Demonstrou com sucesso a expressão de genes exógenos, como o RUBY reporter e o gene Cas9 , em folhas de bambu. A maior eficiência de transformação para o acúmulo de betalaína em mudas de RUBI foi obtida com o uso da linhagem GV3101, com percentual de 85,2% após a infecção. Embora o DNA estranho não tenha se integrado ao genoma do bambu, o método foi eficiente na expressão dos genes exógenos. Além disso, um sistema de edição genética também foi desenvolvido com um repórter nativo usando esse método, a partir do qual um mutante in situ gerado pelo gene editado da violaxantina desepoxidase de bambu (PeVDE) em folhas de bambu, com uma taxa de mutação de 17,33%. A mutação do PeVDE resultou na diminuição dos valores de têmpera não fotoquímica (NPQ) sob luz alta, que pode ser detectada com precisão por um fluorômetro. Isso torna o PeVDE editado um potencial repórter nativo para genes exógenos e endógenos em bambu. Com o repórter do PeVDE, um gene da cinamoil-CoA redutase foi editado com sucesso com uma taxa de mutação de 8,3%. Esta operação evita o processo de cultura de tecidos ou indução de calos, que é rápido e eficiente para expressar genes exógenos e edição de genes endógenos em bambu. Este método pode melhorar a eficiência da verificação da função gênica e ajudará a revelar os mecanismos moleculares das principais vias metabólicas no bambu.

Introdução

A investigação da função gênica no bambu é uma grande promessa para a compreensão avançada do bambu e para o desvendamento de seu potencial de modificação genética. Uma maneira eficaz disso pode ser alcançada através do processo de infecção mediada por Agrobacterium em folhas de bambu, pelo qual o fragmento de T-DNA contendo genes exógenos é introduzido nas células, levando posteriormente à expressão dos genes dentro das células foliares.

O bambu é um recurso valioso e renovável com uma ampla gama de aplicações na fabricação, arte e pesquisa. O bambu possui excelentes propriedades da madeira, como alta resistência mecânica, tenacid....

Protocolo

1. Preparo de mudas de bambu

1. Preparar mudas de bambu moso (Phyllostachys edulis) usando sementes colhidas em Guilin, Guangxi, China. Comece mergulhando as sementes em água por 2-3 dias, certificando-se de trocar a água diariamente. Em seguida, crie um substrato misturando solo e vermiculita em uma proporção de 3:1.
2. Semear as sementes embebidas no substrato para germinação. Manter as mudas em condições de laboratório, mantendo a temperatura entre 18-25 °C. Garanta um fotoperíodo claro/8 h escuro de 16 h com uma intensidade de luz de 250-350 μmol/m²/s durante a fase de luz.
3. Manter uma umidade relativa d....

Resultados

Expressão gênica mediada por agrobactérias em plantas em folhas de bambu
O gene repórter RUBY demonstrou ser eficaz na visualização da expressão gênica transitória devido à sua capacidade de produzir betalaína vermelha vívida a partir da tirosina¹⁰. Neste estudo, a transformação mediada por Agrobacterium foi utilizada para expressar transitoriamente o gene exógeno RUBI em folhas de bambu (Figura 1). No 3.......

Discussão

Este método reduz significativamente o tempo necessário em comparação com os métodos tradicionais de transformação genética, que normalmente levam 1-2 anos, e alcança a expressão transitória de genes exógenos e edição gênica de genes endógenos dentro de 5 dias. No entanto, este método tem limitações, pois só pode transformar uma pequena proporção de células, e as folhas editadas por genes são quiméricas e não têm a capacidade de se regenerar em plantas completas. No entanto, esta tecnologia de expressão gênica e edição d.......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
35S::RUBY	Addgene, Estados Unidos	160908	Plamid construct
Agrobacterium competent células de GV3101, EHA105,LBA4404 e AGL1	Biomed, China	BC304-01, BC303-01, BC301-01 e BC302-01	Para infecção por Agrobacterium
CTAB	Sigma-Aldrich, Estados Unidos	57-09-0 Extração de	DNA
Imaging-PAM fluorômetro	Walz, Effeltrich, Alemanha		Detectar fluorescência de clorofila de folhas de bambu
ImagingWin	Walz, Effeltrich, Alemanha		Software para fluorômetro Imaging-PAM
Paq CI ou Aar I	NEB, Estados Unidos	R0745S	Incorpore a sequência alvo no vetor CRISPR/Cas9.
PrimeSTAR Max DNA polimerase	Takara, Japão	R045Q	Para clonagem de genes
T4 DNA ligase	NEB, Estados Unidos	M0202V	Incorpore a sequência alvo no vetor CRISPR/Cas9.