Method Article

Um modelo de rato prematuro para estudos da dor

DOI:

10.3791/65800

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February 9th, 2024

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1Laboratory of Neuroscience, Neuromodulation and Study of Pain (LANNED), UNIFAL-MG, 2SINPAIN Faculty

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Aqui, apresentamos um protocolo conciso para a criação de um modelo de rato prematuro, facilitando a pesquisa sobre o manejo precoce da dor pós-parto. O método envolve a realização de uma cesariana três dias antes do nascimento esperado, a extração de filhotes de ratos prematuros por meio de histerectomia e a integração deles com a prole biológica de uma mãe de aluguel.

Abstract

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Esta pesquisa investiga as consequências da estimulação consistente em descendentes prematuros para determinar suas implicações a longo prazo para a sensibilidade à dor. O objetivo primário deste protocolo foi investigar o impacto dos estímulos de picada de agulha neonatal no limiar de dor nas fases posteriores da vida usando um modelo de rato prematuro. Ao estabelecer esse modelo, pretendemos avançar na pesquisa sobre a compreensão e o manejo da dor pós-natal precoce associada à prematuridade. Os resultados deste estudo indicam que, embora os limiares basais para estímulos mecânicos tenham permanecido inalterados, houve um aumento notável na hipersensibilidade mecânica após a injeção completa de adjuvante de Freund (CFA) em ratos adultos. Curiosamente, em comparação com ratos machos, ratos fêmeas demonstraram hipersensibilidade inflamatória aumentada. Notavelmente, o comportamento materno, o peso das ninhadas e a trajetória de crescimento da prole permaneceram inalterados pela estimulação. A manifestação de respostas nociceptivas alteradas na idade adulta após estímulos dolorosos neonatais pode ser indicativa de alterações no processamento sensorial e no funcionamento dos receptores de glicocorticóides. No entanto, mais pesquisas são necessárias para entender os mecanismos subjacentes envolvidos e desenvolver intervenções para as consequências da prematuridade e da dor neonatal em adultos.

Introduction

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Durante o período neonatal, as vias nociceptivas sofrem maturação estrutural e funcional significativa, e a presença de dano tecidual e dor associada tem profundas implicações para o desenvolvimento do processamento somatossensorial1.

A utilização de modelos animais permite a manipulação experimental controlada de animais não humanos, permitindo uma compreensão mais profunda das consequências da dor neonatal no comportamento mais tarde na vida, ao mesmo tempo em que mitiga potenciais variáveis de confusão 2,3. Um desfecho comumente observado é a influência da dor neonatal no aumento da sensibilidade à dor na idade adulta 2,4,5. Na unidade de terapia intensiva neonatal (UTIN), a dor neonatal é uma fonte de estresse altamente prevalente, com bebês prematuros sendo submetidos a uma mediana de 10 procedimentos invasivos por dia6. Os neonatos prematuros na UTIN encontram uma série de estressores, abrangendo dor, contato materno limitado, estímulos auditivos e iluminação excessiva 7,8,9.

A utilização de modelos animais é essencial para avançar nossa compreensão dos mecanismos subjacentes envolvidos nesses processos e facilitar novos avanços nessa área. Em particular, o emprego de modelos animais prematuros em estudos pode contribuir muito para expandir o corpo de conhecimento sobre bebês prematuros e fornecer informações valiosas sobre intervenções de controle da dor para recém-nascidos prematuros10.

Atualmente, há um número limitado de modelos de roedores que abordam especificamente a prematuridade, com a maioria desses estudos investigando principalmente os efeitos da prematuridade no cérebro11, desenvolvimento pulmonar12, enterocolite necrosante13 ou estudos imunonutricionais14. No entanto, nenhum desses modelos examina a maturação do sistema de dor, que é particularmente vulnerável em casos de prematuridade.

O parto prematuro e suas consequências para o tratamento precoce da dor pós-parto continuam sendo áreas cruciais de estudo. Portanto, o presente trabalho teve como objetivo contribuir com a literatura estabelecendo um modelo de rato prematuro. Este modelo fornece informações sobre o impacto dos estímulos de picada de agulha neonatal nos limiares de dor durante os estágios posteriores da vida, aprimorando nossa compreensão da dor relacionada à prematuridade.

Protocol

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Todos os procedimentos experimentais seguiram o Guia para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório adotado pelo Comitê de Ética em Experimentação Animal da Universidade Federal de Alfenas (protocolo 32/2016).

1. Animais

  1. Obter ratos Wistar machos adultos e fêmeas nulíparas (aproximadamente oito semanas de idade) no Biotério Central da Universidade Federal de Alfenas.
  2. Alojar os ratos em condições controladas de temperatura e umidade em um ciclo claro: escuro de 12:12 h e alimentá-los com ração e água ad libitum no biotério da Faculdade de Fisioterapia (Universidade Federal de Alfenas).

2. Verificação da gravidez

  1. Durante 1 mês, todas as manhãs entre 8h00 e 9h00, transportar cada gaiola de animal para a sala experimental. Para realizar uma lavagem vaginal, introduza cuidadosamente uma pipeta de plástico contendo 10 μL de solução de NaCl a 0,9% na vagina do rato. Garanta uma inserção superficial para evitar penetração profunda e, em seguida, retire-se suavemente para coletar as secreções vaginais.
  2. Coloque o fluido vaginal coletado em lâminas de vidro individuais, atribuindo uma lâmina separada a cada gaiola de animais.
    1. Obtenha uma única gota de material não corado de cada rato usando uma ponta de pipeta limpa. Examine o material sob um microscópio óptico usando lentes objetivas de 10x e 40x, sem usar a lente condensadora.
    2. Identificar três tipos celulares distintos com base em suas características: células epiteliais redondas e nucleadas, células cornificadas irregulares sem núcleo e leucócitos pequenos e redondos15.
  3. Expor ratas Wistar fêmeas com queratinização intensa e descamação vaginal, características do ciclo estral e indicando aumento da receptividade dos machos, ao acasalamento. Acasalar os ratos colocando 2 fêmeas e 1 macho por gaiola. Determine o dia 0 da gestação verificando a presença de espermatozoides e células da fase estral nos esfregaços vaginais.

3. Classificação e manejo de mães prenhes e seus descendentes

  1. Descarte três tipos de mães grávidas (2 mães cada) com base em seu estágio gestacional: mães prematuras, a termo e substitutas. Permita que as mães grávidas a termo parem naturalmente no dia 22 de gestação e usem suas ninhadas para o grupo a termo.
  2. No dia 19 de gestação, realize uma cesariana nas mães grávidas prematuras, que é 3 dias antes da data prevista para o parto. Utilize essas ninhadas para o grupo prematuro. Dado que este procedimento não é propício à sobrevivência da mãe, confie os filhotes prematuros a mães de aluguel, que deram à luz naturalmente 2 dias antes da cesariana das mães prematuras.
  3. Mantenha os filhotes da mãe substituta com ela por algumas horas, permitindo que seus cheiros se misturem com as ninhadas prematuras. Após este período, introduzir as ninhadas de prematuros e retirar os filhotes originais da barriga de aluguel, sacrificando-os posteriormente com altas doses de inalação de isoflurano.
    NOTA: Esta etapa é essencial para garantir que as mães de aluguel já tenham estimulado a produção de leite em suas glândulas mamárias, posicionando-as para amamentar efetivamente os filhotes prematuros16.

4. Cirurgia cesariana

  1. Anestesiar parcialmente as mães grávidas prematuras com isoflurano a 2% e sacrificá-las 3 dias antes da data prevista para o parto usando luxação cervical. Após a eutanásia, extraia a prole uma a uma por meio de histerectomia.
  2. Faça um corte de 3 cm na linha média da parte inferior do abdômen, seguido de um corte longitudinal de 2 cm. Faça uma incisão ao longo da borda antimesentérica na porção média de cada tuba uterina a partir desses cortes.
  3. Extraia suavemente filhotes de ratos e placenta por meio de histerectomia 17,18. Extraia a prole uma a uma imediatamente.

5. Cuidados pós-operatórios e preparação dos filhotes para adoção

  1. Use o procedimento de adoção para evitar que a mãe operada exiba comportamento inadequado devido ao procedimento cirúrgico e dor potencial, o que pode afetar o comportamento adulto dos filhotes.
  2. Limpe as vias aéreas dos filhotes de ratos usando toalhas de papel após o nascimento. Limpe os filhotes de rato, dando-lhes um banho para evitar o canibalismo por barragens substitutas. Lave os filhotes de rato em água a 28 °C e seque-os.
  3. Remova quaisquer vestígios de sangue e coloque os filhotes em placas de Petri sob iluminação infravermelha aquecida, mantendo uma temperatura de aproximadamente 28 °C até que sua respiração se torne regular.
  4. Corte os cordões umbilicais logo abaixo da placenta e use algodão embebido em H2O2 para estancar qualquer sangramento do cordão umbilical. Por fim, ofereça-os às mães adotivas para adoção.

6. Interação com mães adotivas e adoção de filhos prematuros

  1. Alojar cada mãe adotiva com sua ninhada em gaiolas de plástico separadas. Antes de transferir, marque cada termo filhote da mão adotiva. Essa marcação é crucial para análises subsequentes do comportamento materno. Mantenha a integridade das gaiolas das mães adotivas durante todo o processo de adoção.
  2. Inicialmente, coloque os filhotes prematuros fora do ninho. Essa estratégia permite que a mãe de aluguel reconheça e se familiarize com o cheiro dos novos filhotes em um território neutro. Além disso, selecione um ou dois filhotes da mãe adotiva e coloque-os fora do ninho ao lado dos filhotes prematuros. Essa mistura leva a mãe de aluguel a coletar seus próprios filhotes e os prematuros, promovendo assim a aceitação e integração dos novos filhotes em seu ninho.
  3. Misture a prole adotiva com a prole biológica inicialmente. Confirme a adoção efetiva. Remova os filhotes da mãe adotiva do ninho e sacrifique-os19.
    NOTA: Neste estudo, a viabilidade dos ratos prematuros foi de 100% e eles não foram rejeitados pela mãe de aluguel.

7. Padronização de ninhadas

  1. Mantenha um tamanho de ninhada de 8 filhotes por ninhada em todos os grupos de filhotes criados por barriga de aluguel, com 4 machos e 4 fêmeas. Sacrifique os ratos filhotes restantes após a padronização.

8. Desenho experimental e implementação do protocolo

NOTA: O objetivo deste protocolo foi obter filhotes prematuros viáveis para o desenvolvimento dos seguintes procedimentos experimentais.

  1. Utilize um total de 20 mães grávidas para os procedimentos. Divida-os em dois grupos experimentais, cada um composto por 10 barragens.
    1. Estimule os filhotes do primeiro grupo, o grupo PP, com estímulos de picada de agulha de PND 2 a PND 15.
    2. Designe o segundo grupo como o grupo CC, que serve como controle, com os filhotes deste grupo não recebendo estimulação por picada de agulha.
    3. Monitore o comportamento materno das mães e o peso das ninhadas diligentemente durante todo esse período.

9. Avaliações pós-desmame e testes comportamentais

  1. Desmame a prole no PND 22. Separe-os por sexo e aloje-os em gaiolas com capacidade máxima de 4 animais cada até atingirem aproximadamente 8 semanas de idade.
  2. Em seguida, submeta esses animais a avaliações de sensibilidade a estímulos dolorosos usando o teste eletrônico de von Frey. Concentre-se especificamente na dor induzida por inflamação da CFA.
  3. Para mitigar quaisquer possíveis influências relacionadas à ninhada, selecione 1 rato macho e 1 fêmea de cada ninhada para cada grupo experimental para passar por testes comportamentais durante a idade adulta.
  4. Use cada animal em um único experimento para evitar a interferência do fator hormonal nas respostas nociceptivas de ratos fêmeas. Especificamente, certifique-se de que os testes sejam realizados em mulheres durante a fase de diestro de seu ciclo estral.

10. Indução de dor neonatal repetida

  1. Induzir dor neonatal repetida usando uma técnica de picada de agulha semelhante à descrita em um estudo anterior20. Inicie estímulos diários de picada de agulha para os filhotes de ratos a partir do dia 2 pós-natal (PND 2) e continue essa prática até o PND 15.
  2. Insira cuidadosamente uma agulha de 22 G a uma profundidade rasa na área plantar média da pata traseira direita.
    1. Certifique-se de que a penetração seja apenas o suficiente para estimular sem causar ferimentos indevidos. Calibre o medidor para evitar uma penetração mais profunda, considerando o risco de passar inteiramente pela pata nessa idade.
    2. Se ocorrer sangramento, interrompa-o imediatamente usando um cotonete; Normalmente, essa intervenção dura apenas alguns segundos. Administrar estímulos 4 vezes, mantendo um intervalo de 2 min entre cada um, totalizando 8 picadas por dia.
  3. Para minimizar possíveis fatores de confusão relacionados à separação materna e ao manuseio neonatal, separe os filhotes de ratos de suas mães por no máximo 5 minutos. Aplique a mesma duração de separação ao grupo de controle. Após cada conjunto de estímulos, devolva prontamente os filhotes de ratos às suas mães 5,21,22.

11. Avaliação dos comportamentos maternos

  1. Para avaliar o comportamento materno, avaliar o comportamento das mães em ambos os grupos experimentais (n = 10 por grupo) do PND 2 ao PND 15. Realizar a avaliação em duas sessões: uma pela manhã, antes do estímulo de picada de agulha nos filhotes de rato (entre 08:00 e 09:30), e outra à tarde, após o estímulo de picada de agulha nos filhotes de rato (entre 15:00 e 16:30).
  2. Durante essas sessões, observe, registre e pontue diligentemente o comportamento de cada mãe a cada 3 minutos durante essas sessões, levando a 30 observações por período por dia. Isso se acumula para um total de 60 observações por mãe por dia.

12. Registro de comportamentos maternos e não maternos

  1. Registre os parâmetros de comportamento materno que abrangem ações como escovar ou lamber (no corpo ou na região anogenital), amamentar, manter as costas arqueadas em uma postura semelhante a um "cobertor", deitando-se sobre os filhotes, deitando-se passivamente de costas ou de lado enquanto amamenta, envolvendo-se na construção de ninhos e auto-limpeza materna (incluindo estimulação dos seios por meio de autolimpeza).
  2. Documente os parâmetros de comportamento não materno, incluindo ações como alimentação, exploração do alojamento da gaiola, não exploração e ausência de autolimpeza materna.
  3. Apresente os dados como a porcentagem do comportamento materno total e do comportamento não materno. Divida o número de observações registradas do comportamento-alvo pelo número total de observações e multiplique o resultado por 100 5,23,24.

13. Avaliação do peso da cama

  1. Ao longo da fase de estimulação da picada de agulha (PND 2-15), monitore o peso das ninhadas nos grupos PP e CC, cada um compreendendo 8 ninhadas.
  2. Durante a fase de estimulação por picada de agulha (PND 2-15), mantenha uma verificação contínua do peso das ninhadas nos grupos PP e CC, cada um composto por 8 ninhadas.

14. Teste de limiar mecânico

  1. Neste experimento, administre injeções de solução salina ou CFA, cada uma em um volume de 100 μL, a ratos (8 semanas de idade) dos grupos PP e CC. Em seguida, coloque-os individualmente em gaiolas de acrílico (42 cm × 24 cm × 15 cm) com piso de grade de arame 15-30 min antes do teste para avaliar a hiperalgesia mecânica.
  2. No teste, induzir um reflexo de flexão da pata traseira usando um transdutor de força portátil equipado com uma ponta de polipropileno2 de 0,5 mm (Electronic von Frey).
    1. Aplique gradualmente a ponta entre as cinco almofadas distais da pata traseira direita, aumentando a pressão até que uma resposta seja observada.
      NOTA: Quando ocorre a retração da pata, o estímulo cessa automaticamente e sua força é documentada. O teste termina com uma resposta clara de vacilo seguida de retirada da pata. A administração subcutânea de CFA induz inflamação prolongada, com pico em 24 h e persistindo por pelo menos 7 dias25.
  3. Realizar testes nos animais antes e 4 h, 7 h, 10 h e 24 h após a administração de solução salina ou CFA4. Apresente os resultados em termos de limiar de retirada, medido em gramas (g), e calcule-o calculando-o calculando a média de três medições.
  4. Para evitar a interferência de potenciais fatores hormonais nas respostas nociceptivas entre as fêmeas, certifique-se de que os testes sejam realizados exclusivamente durante a fase de diestro de seu ciclo estral.

15. Análise dos dados

  1. Processe os dados usando um software de análise estatística e apresente-os como média ± erro padrão da média (SEM). Para identificar diferenças estatisticamente significativas entre os grupos, aplique uma análise de variância (ANOVA) de duas vias com medidas repetidas, considerando fatores como a avaliação de parâmetros maternos versus não maternos e avaliação do peso da leitegada.
  2. Especificamente, analise o PND e os estímulos de picada de agulha para parâmetros maternos e von Frey: CFA e estímulos de picada de agulha para avaliação do peso da ninhada. Realize análises post hoc usando o teste de Bonferroni quando necessário.

Results

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Neste estudo, não houve diferenças no comportamento materno ou não materno entre as mães, independentemente de seus filhos terem sido submetidos à experimentação de picada de agulha durante o período neonatal ou serem prematuros ou a termo (Figura 1). Em relação ao comportamento materno de mães adotivas de filhos prematuros, a ANOVA de duas vias mostrou que houve efeito do DPN (dia pós-parto), mas nenhum efeito dos estímulos de picada de agulha ou qualquer interação entre os dois fatores na avaliação do comportamento materno observado às 8 horas. [Fator de DPN: F(13, 140) = 6,31, p < 0,001; fator de estímulo de picada de agulha: F(1, 140) = 1,04, p = 0,30; estímulo de picada de agulha x interação PND: F(13, 140) = 0,55, p = 0,88; Figura 1A]; ou às 15h [fator de picada de agulha: F(13, 140) = 16,97, p < 0,001; fator de estímulo de picada de agulha: F(1, 140) = 3,27, p = 0,07; estímulo de picada de agulha x interação de DPN: F(13, 140) = 1,82, p = 0,04; Figura 1C]. Em termos de comportamento não materno, houve um efeito perceptível devido ao DPN, mas não houve influência significativa dos estímulos de picada de agulha ou interação entre esses dois fatores às 8 da manhã. [Fator de DPN: F (13, 140) = 6,31, p < 0,001; fator de estímulo de picada de agulha: F (1, 140) = 1,04, p = 0,30; interação entre o estímulo de picada de agulha e DPN: F(13, 140) = 0,55, p = 0,88; ver Figura 1B]. Da mesma forma, enquanto o efeito PND persistiu, a influência dos estímulos de picada de agulha e sua interação com o PND não foram estatisticamente significativas às 15h. [Fator PND: F (13, 140) = 16,97, p < 0,001; fator de estímulo de picada de agulha: F (1, 140) = 3,27, p = 0,07. A ANOVA de duas vias revelou um efeito notável do DPN e, mais importante, uma interação significativa entre estímulos de picada de agulha e DPN às 15:00 (fator de DPN: F (13, 182) = 13,82, p < 0,001; fator de estímulo de picada de agulha: F (1, 182) = 3,78, p = 0,05; Interação PND x estímulos de picada de agulha: F(13, 182) = 1,82, p = 0,04; consulte a Figura 1D]. Essa interação ressalta um impacto distinto dos estímulos de picada de agulha no comportamento não materno, particularmente evidente na avaliação da tarde.

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Figura 1: Efeitos da picada de agulha durante o período neonatal (PND 2-15) no comportamento materno de mães adotivas de filhos prematuros. (A) Número de comportamentos maternos registrados avaliados às 8h00 (B) Número de comportamentos não maternos registrados avaliados às 8h00 (C) Número de comportamentos maternos registrados avaliados às 15h00 (D) Número de comportamentos não maternos registrados avaliados às 15h00. Cada ponto representa a média ± SEM. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

A Figura 2 mostra o ganho de peso da ninhada pré-termo durante o período em que o estímulo da picada de agulha foi aplicado (DPN 2-15). Não foram observadas alterações no peso da ninhada entre o grupo CC (controle) e o grupo PP (picada de alfinete). A ANOVA de duas vias revelou um efeito significativo do DPN, mas nenhum efeito significativo do estímulo da picada de agulha ou da interação entre os dois fatores no peso da ninhada [fator DPN: F (13, 140) = 247,5, p < 0,001; fator de estímulo de picada de agulha: F (1, 140) = 0,89, p = 0,34; estímulo de picada de agulha × interação PND: F (13, 140) = 0,05, p = 1,00].

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Figura 2 - Efeitos da picada de agulha durante o período neonatal (PND 2-15) sobre o peso da ninhada pré-termo em gramas. Cada ponto representa a média ± EPM de 8 animais. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Foram observados efeitos principais significativos dos estímulos de picada de agulha e CFA no limiar de retirada da pata, com uma diminuição substancial (p < 0,001) evidente em filhotes machos dos grupos CC / CFA e PP / CFA em todos os momentos em comparação com os grupos CC / Sal e PP / Sal (Figura 3A). Isso ressalta o impacto robusto dos estímulos de picada de agulha e CFA nas respostas nociceptivas em filhotes machos. Notavelmente, 4 h após a injeção de CFA, uma redução significativa no PWT (p < 0,001) foi observada no grupo PP / CFA em comparação com o grupo CC / CFA [fator CFA: F (4,112) = 13,12, p < 0,001; fator de estímulo de picada de agulha: F (3,112) = 14,45, p < 0,05; CFA x interação estímulo de picada de agulha: F (12,112) = 5,14, p < 0,05]. Em relação às fêmeas (Figura 3B), observou-se uma diminuição no limiar de abstinência (p < 0,001) nos grupos CC/CFA e PP/CFA em todos os momentos em comparação com os grupos CC/Sal e PP/Sal. Especificamente, 4 h após a injeção de CFA, foi observada uma redução significativa no limiar de abstinência (p < 0,05) no grupo PP/CFA em comparação com o grupo CC/CFA [fator CFA: F(4,112) = 31,16, p < 0,001; fator de estímulo de picada de agulha: F(3,112) = 18,22, p < 0,01; CFA x interação estímulo de picada de agulha: F(12,112) = 58,13, p < 0,01]. Tanto os adultos do sexo masculino quanto o feminino apresentaram um limiar reduzido de retirada da pata entre o grupo PP / CFA e o grupo CC / CFA em todos os pontos de tempo a partir da marca de 4 h.

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Figura 3 - Efeitos da picada de agulha durante o período neonatal (DPP 2-15) em leitegadas pré-termo sobre a nocicepção de acordo com o teste de von Frey antes e após a injeção de CFA intraplantar ou solução salina. Limiar de retirada da pata, em gramas, em (A) ratos machos ou (B) ratos fêmeas. Cada ponto representa a média ± EPM de 8 animais. * p < 0,05 e *** p < 0,001 em comparação com os grupos Controle e PP/Solução salina em relação aos grupos Controle e PP/CFA; # p < 0,01 comparando o grupo Controle CFA com o grupo PP/CFA. BASAL representa o limiar nociceptivo medido antes da injeção intraplantar de CFA ou solução salina. A seta indica o tempo de injeção intraplantar de CFA ou solução salina. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Discussion

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Nesta investigação, observamos que os comportamentos maternos e não maternos das mães não foram afetados pela experimentação neonatal de picada de agulha. Essa tendência também se estendeu ao comportamento não materno. Além disso, o ganho de peso das ninhadas prematuras durante o período de estímulo da picada de agulha não foi significativamente diferente entre os grupos controle e picada de agulha. As análises do limiar de retirada das patas revelaram uma redução notável em filhotes machos e fêmeas dos grupos picada de agulha e CFA em comparação com os dos grupos controle. Particularmente impressionante foi a observação de uma redução adicional no limiar de retirada da pata 4 h após a injeção de CFA no grupo picada de agulha / CFA em comparação com o grupo controle / CFA. Esses resultados diferenciados ressaltam os efeitos multifacetados da estimulação neonatal sobre o comportamento materno, o ganho de peso da ninhada e as respostas nociceptivas na prole, enfatizando a importância de considerar as condições pré-termo e a termo ao interpretar os resultados.

Nossa exploração das respostas nociceptivas se alinha e amplia os achados de Carvalho et al.26, que relataram alterações nas respostas nociceptivas e hipersensibilidade inflamatória na idade adulta resultantes da estimulação repetitiva de picada de agulha na prole prematura. Essa convergência de resultados ressalta o impacto duradouro das experiências neonatais nas vias nociceptivas, enfatizando a robustez desses resultados em todos os estudos. O aumento observado da sensibilidade a estímulos nocivos em filhotes machos e fêmeas submetidos à estimulação neonatal sugeriu uma tendência consistente na modulação das respostas nociceptivas, contribuindo ainda mais para nossa compreensão das consequências a longo prazo dos estressores no início da vida.

Os achados deste estudo também se alinham com o trabalho de Gieré et al.27, que exploraram a hipersensibilidade nociceptiva em ratos adultos após a separação materna neonatal. Seu estudo sugeriu uma origem central da hipersensibilidade nociceptiva, reforçando a noção de que os estressores no início da vida podem induzir mudanças duradouras nos mecanismos de processamento da dor. A convergência dos resultados enfatiza a complexa interação entre eventos no início da vida e respostas nociceptivas, ressaltando ainda mais a necessidade de uma compreensão abrangente dos mecanismos centrais que contribuem para alterações de longo prazo na sensibilidade à dor.

O impacto das experiências no início da vida nas vias nociceptivas é ainda apoiado pelos achados de Chang et al.28, que investigaram alterações na conectividade funcional da dor no córtex somatossensorial e pré-frontal medial de ratos após experiências de dor no início da vida. Seu trabalho destacou mudanças de longo prazo nos mecanismos de processamento da dor induzidos por estressores no início da vida, enfatizando a importância de entender os correlatos neurais das respostas nociceptivas. A integração desses resultados com as observações de sensibilidade aumentada a estímulos nocivos em filhos prematuros submetidos à estimulação neonatal contribui para uma compreensão mais abrangente das consequências duradouras das experiências de dor no início da vida nos circuitos de dor do adulto.

Além disso, van den Hoogen et al.29 demonstraram que a estimulação repetida do toque e da picada de agulha durante o período neonatal aumentou a sensibilidade mecânica basal e a hipersensibilidade pós-lesão em neurônios sensoriais espinhais adultos. As descobertas atuais, alinhadas com pesquisas anteriores, ressaltam as consequências duradouras das experiências de dor neonatal nas vias nociceptivas. Juntos, esses estudos enfatizam a importância de reconhecer o impacto de longo prazo das experiências no início da vida na sensibilidade à dor do adulto, contribuindo para uma compreensão abrangente da complexa interação entre estímulos neonatais e respostas nociceptivas.

Ao combinar o parto prematuro com a exposição a estímulos dolorosos durante o período neonatal, desenvolvemos um modelo que imita de perto as experiências iniciais de vida de bebês prematuros humanos, levando em conta a necessidade imperativa de cuidados intensivos exigidos pela prematuridade. No entanto, a relevância translacional desse modelo, particularmente em relação às experiências de bebês prematuros na UTIN, requer maior elucidação. Notavelmente, não foram identificados estudos que empregassem um modelo de prematuridade semelhante ao utilizado no presente estudo. No entanto, ao considerar os primeiros dias de vida (1-2) como uma representação da prematuridade, pesquisas anteriores demonstraram que os homens apresentam maior vulnerabilidade aos estímulos nociceptivos do que as mulheres durante esse período crítico. Essa vulnerabilidade foi confirmada por meio de testes nociceptivos aplicados na idade adulta, fornecendo justificativa parcial para os resultados observados neste estudo30.

O presente estudo foi pioneiro no uso de animais prematuros nascidos por cesariana aos 19 dias de gestação para avaliar o limiar nociceptivo na idade adulta. Este novo modelo para estudar a dor em neonatos prematuros fornece uma perspectiva única sobre essa população. Esse modelo levanta novas questões em relação aos testes nociceptivos, como o teste de von Frey, em animais adultos de ambos os sexos, bem como todos os aspectos envolvidos nos limiares nociceptivos desses animais, seja no período neonatal ou na idade adulta.

Embora o presente estudo tenha se concentrado principalmente no impacto dos estímulos de picada de agulha neonatal nos limiares de dor em estágios posteriores da vida, há um caminho promissor para estender esta pesquisa a intervenções e estratégias analgésicas pós-natais. Estudos futuros podem avaliar a eficácia de várias intervenções de controle da dor em um modelo de rato prematuro, explorando caminhos potenciais para mitigar os efeitos a longo prazo da dor neonatal. Isso pode incluir a investigação de novas abordagens analgésicas, a avaliação da duração e intensidade das intervenções necessárias e a exploração dos mecanismos subjacentes que influenciam a eficácia dessas intervenções.

Em conclusão, a investigação abrangente realizada neste estudo teve como objetivo dissecar a intrincada interação da estimulação neonatal por picada de agulha, comportamento materno e condições de parto prematuro nas respostas nociceptivas na prole. A análise meticulosa do comportamento materno, juntamente com a exclusão de potenciais fatores de confusão, como parto prematuro e cuidados adotivos, reafirmou a resiliência do comportamento materno ao estímulo nociceptivo administrado. O ganho de peso das ninhadas prematuras permaneceu inalterado, indicando que as alterações observadas nas respostas nociceptivas durante a idade adulta foram mais provavelmente atribuídas à estimulação da picada de agulha no início da vida do que aos cuidados maternos ou ao desenvolvimento da prole. Os achados deste estudo estão alinhados com a literatura sobre as consequências duradouras das experiências de dor neonatal, enfatizando a maior sensibilidade a estímulos nocivos na idade adulta. Além disso, a exploração de potenciais teorias mecanicistas, incluindo alterações no processamento neural e na função do receptor de glicocorticóides, fornece informações valiosas sobre as vias subjacentes que contribuem para as alterações nociceptivas. Juntos, os resultados aqui apresentados e os de estudos anteriores ressaltam a complexidade das experiências no início da vida nas vias nociceptivas, lançando luz sobre as consequências duradouras dos estímulos neonatais nos circuitos de dor do adulto. Embora mais pesquisas sejam necessárias para elucidar os mecanismos subjacentes diferenciados envolvidos, este estudo contribui para o crescente corpo de conhecimento destinado a revelar o impacto de longo prazo dos eventos no início da vida nas respostas nociceptivas em descendentes adultos.

Disclosures

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Não temos nada a divulgar.

Acknowledgements

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Este trabalho foi apoiado pela Universidade Federal de Alfenas - UNIFAL-MG e pela Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - Brasil (Bolsista CAPES, Laura Pereira Generoso; Natalie Lange Candido e Maria Gabriela Maziero Capello) - Código de Finanças 001.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Solução de NaCl a 0,9%Concare, Brasil
Gaiolas de acrílico (42 cm & 24 cm > 15 cm) com piso de grade de arameInsight Equipamentos, Brasil
Adjuvante de Freund Completo (CFA) Sigma Aldrich, Brasil
Eletrônica von Frey,InsightEquipamentos, Brasil
H2O2 (peróxido de hidrogênio)ACS Cientifica, Brasil
Iluminação infravermelhaCarci, Brasil
Isoflurano (2%)Cristá lia, Brasil
Microscópio verticalNikon, BrasilECLIPSE EiMicroscópio com lentes objetivas de 10x e 40x

References

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