Explante de membrana de janela redonda de cobaia para estudos ex vivo

Resumo

Este protocolo descreve um método para o explante da membrana da janela redonda de ossos temporais de cobaias, fornecendo um recurso valioso para estudos ex vivo .

Resumo

A liberação eficiente e minimamente invasiva de fármacos na orelha interna é um grande desafio. A membrana da janela redonda (MRP), sendo um dos poucos pontos de entrada para a orelha interna, tornou-se um foco vital de investigação. No entanto, devido às complexidades do isolamento do RWM, nossa compreensão de sua farmacocinética permanece limitada. O RWM compreende três camadas distintas: o epitélio externo, a camada média de tecido conjuntivo e a camada epitelial interna, cada uma potencialmente possuindo propriedades de liberação únicas.

Os modelos atuais para investigar o transporte através do RWM utilizam modelos animais in vivo ou modelos RWM ex vivo que dependem de culturas de células ou fragmentos de membrana. As cobaias servem como um modelo pré-clínico validado para a investigação da farmacocinética de drogas na orelha interna e são um modelo animal importante para o desenvolvimento translacional de veículos de entrega para a cóclea. Neste estudo, descrevemos uma abordagem para explante de uma cobaia RWM com osso coclear circundante para experimentos de liberação de fármacos em bancada. Este método permite a preservação da arquitetura RWM nativa e pode fornecer uma representação mais realista das barreiras ao transporte do que os modelos atuais de bancada.

Introdução

Novas classes de terapêuticas têm surgido para o tratamento da perda auditiva neurossensorial. A tradução dessas terapêuticas para populações clínicas é limitada por vias seguras e eficazes de transporte para a orelha interna. Os métodos atuais de liberação in vivo em estudos com animais baseiam-se tanto na fenestração para a orelha interna quanto na difusão através da membrana da janela redonda (MRP), uma barreira não óssea que separa o espaço da orelha média da cóclea1.

A fenestração cirúrgica e a microinjeção na orelha interna são invasivas e podem representar riscos à função residual da orelha interna². Portanto, a RWM é uma importante via para liberação local de fármacos, e as cobaias são o principal modelo animal pré-clínico utilizado para estudar a farmacocinética local de fármacos em toda a RWM e na orelha interna para o desenvolvimento farmacêutico ^3,4. Embora mais fina que a RWM humana, a cobaia RWM compartilha uma estrutura idêntica de três camadas. Tem aproximadamente 1 mm de diâmetro, 15-25 μm de espessura e é composto por duas camadas de células epiteliais que formam uma camada de tecido conjuntivo⁵. A camada epitelial voltada para a orelha média é densamente compactada e conectada através de tight junctions, enquanto a camada voltada para a orelha interna e escala timpânica tem arquitetura mais frouxa e não tem aderências intercelulares significativas.

Os estudos pré-clínicos atuais que investigam a permeabilidade de drogas na cobaia RWM baseiam-se em injeções in vivo na orelha média seguidas da amostragem do fluido da perilinfa dentro da orelha interna, o que não permite o estudo específico do transporte da RMP ^6,7. Fragmentos de explantes RWM têm sido usados em estudos pré-clínicos, mas devido à sua fragilidade e pequeno tamanho, eles não são adequados para investigações microfluídicas sistemáticas de transporte de drogas e veículos que requerem uma vedação estanque em todo o RWM². Outros grupos empregaram modelos in vitro com cultura de células epiteliais humanas para aproximar o RWM ^8,9,10. No entanto, a maioria desses construtos focaliza apenas a camada epitelial externa e não captura a complexidade da arquitetura do tecido nativo. Para uma compreensão mais detalhada dos mecanismos de transporte através do RWM, são necessários estudos ex vivo direcionados.

Neste estudo, demonstramos o explante de uma cobaia RWM com suporte ósseo circundante para preservar a integridade da membrana e ilustramos seu uso em um paradigma experimental desenhado para o estudo específico do transporte RWM de veículos de entrega de drogas.

Protocolo

Todos os procedimentos com animais foram aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais (GP18M226). Cobaias albinas Hartley (machos e fêmeas, pesando 500-700 g) foram utilizadas no presente estudo.

1. Configuração e preparação do procedimento

1. Esterilizar todos os instrumentos com óxido de etileno antes de iniciar o experimento.
2. Eutanásia dos animais seguindo protocolo aprovado institucionalmente.
   NOTA: No presente estudo, uma câmara sem pré-carga foi empregada para liberar 100% de dióxido de carbono (CO₂) de um cilindro comercial. Um restritor em linha foi utilizado para regular o fluxo de gás, mantendo-o dentro da faixa de 30% a 70% do volume da câmara por minuto, de acordo com as Diretrizes AVMA 2020¹¹.
3. Coloque o animal na câmara e distribua dióxido de carbono por 5 min. O fluxo de CO₂ é mantido por 1 min após a parada respiratória.
4. Realizar a decapitação após a parada respiratória para garantir a eutanásia.

2. Abordagem cirúrgica e explante

1. Extrair o osso temporal do crânio da cobaia da maneira^habitual12. Retire o excesso de tecido mole com um rongeur. Identificar o meato acústico externo, a bolha temporal e o canal^facial13 (Figura 1).
2. Perfurar os aspectos ventrais da bolha temporal com uma broca de diamante de 6 mm (ver Tabela de Materiais), expondo o espaço da orelha média e o conduto auditivo externo circunferencialmente.
3. Com o uso de rongeurs, remova suavemente o conduto auditivo externo e o anel timpânico, separando simultaneamente a articulação incudomaleolar. Identificar bigorna, articulação incudostapedial, cóclea, canal semicircular horizontal e canal^facial13 (Figura 2A).
4. Separe a articulação incudostapedial e remova a bigorna usando pinças. Identifique o nicho ósseo da janela redonda.
5. Use uma broca de diamante de 6 mm para perfurar a lâmina óssea conectando a cóclea com a parede medial da cavidade timpânica em direção ao tensor do canal do tímpano. Descomprimir cuidadosamente o canal ósseo do tensor do tímpano e remover o músculo tensor do tímpano com uma agulha de 28 G.
   NOTA: A parede medial da fossa do tensor do tímpano conecta-se diretamente com o osso coclear ao redor do MMR, e toma-se cuidado para não causar fraturas que possam se estender até a janela redonda.
6. Perfurar a lâmina óssea conectando a cóclea à parede inferior da cavidade timpânica até que reste 1 mm de borda óssea encostando a cóclea (Figura 2B).
7. Usando um pedaço de diamante de 2 mm (ver Tabela de Materiais), faça uma cocleostomia no giro basal da cóclea, deixando aproximadamente 2 mm de osso para a janela redonda. Continuar a cocleostomia inferiormente em um plano paralelo à membrana da janela redonda para separar a base do ápice da cóclea.
8. Estender a cocleostomia cortando a base do crânio, que é muito mais densa, resultando em uma visão transversal do giro basal da cóclea.
   OBS: O direcionamento da broca em direção ao meato acústico interno resulta em uma trajetória que maximiza a remoção óssea, evitando atravessar muito próximo da janela redonda.
9. Examinar o espécime do lado da base do crânio e, se ainda não tiver sido feito, identificar o conduto auditivo interno e perfurar a abertura coclear. Remova o nervo coclear com uma agulha 28G.
10. Examinar o espécime do lado intracoclear. Identificar e remover a lâmina espiral óssea na espira basal e o modíolo remanescente com pinça ou agulha 28G.
11. Irrigar copiosamente a cavidade unificada da escala timpânica-escala vestibular para remover detritos. A janela redonda deve ser claramente visível a partir da cochectomia, sem debris sobrejacentes (Figura 2C).
12. Em seguida, examine o espécime do lado da orelha média. Perfurar o canal semicircular lateral e o canal facial até o nível da janela oval. Remova suavemente o estribo com pinças, expondo o nicho da janela oval. Vale ressaltar que há uma ponte óssea entre as cruras do estribo conhecida como crista stapedis.
13. Com uma broca diamantada de 1 mm (ver Tabela de Materiais), abra ainda mais o vestíbulo estendendo a janela oval ao longo da face da janela redonda, tomando o cuidado de manter 1-2 mm de osso coclear encostado ao nicho da janela redonda (Figura 2D).
14. Completar os cortes do osso temporal conectando os cortes da janela oval com os cortes de cochlectomia de cada lado da janela redonda.
    OBS: Devido à fragilidade do osso coclear, preservar a fossa do tensor do tímpano no espécime e evitar cortes através dele ajudará a prevenir fraturas do osso coclear que se estendem até o MRP e comprometem sua integridade.
15. Faça as fixações finais no osso denso da base do crânio adjacente ao conduto auditivo interno e raspe suavemente para baixo até resultar em um espécime RWM excisado (Figura 3A).

Resultados

Como demonstrado na Figura 3A, este método permite o explante da membrana da janela redonda intacta da cobaia com um anel de osso rígido circundante. A RMP deve estar totalmente conectada circunferencialmente ao anel ósseo. Nenhuma fratura do osso coclear deve ser apreciada. Em comparação com espécimes humanos de janela redonda, a cobaia RWM não tem uma pseudomembrana sobrejacente. Além disso, ao contrário dos seres humanos, existe uma ponte óssea entre as cruras do estribo da cobaia, que re...

Discussão

Na administração local da droga para a orelha, a RWM é a principal via de passagem para a terapêutica chegar à orelha interna. Um modelo de bancada preciso e confiável é necessário para entender melhor os mecanismos de transporte e a permeabilidade em novos veículos de entrega e para o desenvolvimento de medicamentos. Neste estudo, demonstramos que o explante de RMP em cobaias é um procedimento viável e confiável para permitir investigações sistemáticas de interações fármaco-membrana. e Kelso et al., utilizando um modelo...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Broca de Bola de Diamante de 1 mm	Anspach	1SD-G1
Broca de Bola de Diamante de 2 mm	Anspach	2SD-G1
Broca de Bola de Diamante de 6 mm	Anspach	6D-G1
ANSPACH EMAX 2 Plus System	Anspach	EMAX2PLUS	Qualquer sistema de perfuração de corte ósseo funcionará
Agulha BD Eclipse 27 G x 1/2 pol. com seringa BD Luer-Lok destacável de 1 mL	Becton, Dickinson e Co.	382903057894	Qualquer agulha de 27-28 G
Gorilla Epoxy	Gorilla	4200101
Kwik-CAST	World Precision Instruments	KWIK-CAST