Este protocolo descreve um dispositivo simples que imita o método de rolo de Ding, estabelece um modelo de lesão muscular esquelética em ratos e usa coloração de hematoxilina-eosina para observar a patologia do tecido danificado e ensaio imunoenzimático para detectar alterações nos marcadores de dano sérico.
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Artigo de método
Mimetizando o Método do Rolo de Ding na Lesão Muscular Induzida por Notexina em Ratos
Neste artigo
Resumo
Resumo
O método de rolo de Ding é uma das manipulações mais usadas em clínicas de massagem tradicional chinesa (Tuina) e uma das manipulações contemporâneas de Tuina mais influentes na China. Ele é baseado no método de rolamento tradicional comumente usado no gênero Zen de um dedo e chamado de método de rolo de Ding. Devido aos seus efeitos anti-inflamatórios e promotores da circulação sanguínea, o método de rolamento de Ding tem efeitos terapêuticos sólidos na miopatia. Devido à grande área de força aplicada à pele humana, o método de rolagem de Ding é desafiador de executar em animais experimentais com pequenas áreas de pele, como ratos e coelhos. Além disso, a força de Tuina aplicada ao corpo humano difere daquela aplicada aos animais de experimentação, por isso pode acontecer que a força seja muito alta ou muito baixa para alcançar o efeito terapêutico de Tuina durante o experimento. Este experimento visa criar um massageador simples adequado para ratos com base nos parâmetros de manipulação de rolamento de Ding (força, frequência, duração de Tuina). O dispositivo pode padronizar a manipulação em experimentos com animais e reduzir a variação na força de Tuina aplicada a diferentes animais devido a fatores subjetivos. Um modelo de lesão muscular esquelética induzida por anotoxina em ratos foi estabelecido, e os marcadores de lesão plasmática creatina quinase (CK) e proteína ligadora de ácidos graxos 3 (FABP3) foram usados para avaliar o efeito terapêutico de Tuina na lesão muscular esquelética. Os resultados mostraram que este massageador Tuina pode reduzir os níveis de expressão de CK e FABP3 e diminuir o grau de lesão muscular esquelética. Portanto, o massageador Tuina aqui descrito, mimetizando o método do rolo de Ding, contribui para padronizar a manipulação de Tuina em pesquisas experimentais e é de grande ajuda para pesquisas subsequentes sobre o mecanismo molecular de Tuina para miopatia.
Introdução
As lesões musculares são lesões traumáticas comuns na vida clínica e diária, causadas por golpes externos (contusões) ou sobretensão crônica das fibras musculares (estiramentos), etc., resultando em disfunção muscular e dor, afetando até seriamente a qualidade de vida dopaciente1. Iniciar a reabilitação o mais precocemente possível após uma lesão por esforço agudo é a chave para reduzir o tempo de retorno ao esporte2 e reduzir a dor 3,4. Na medicina ocidental moderna, os primeiros socorros clínicos para lesões musculares seguem os princípios de repouso, gelo, compressão e elevação (RICE) para parar o sangramento lesivo no tecido muscular5 e anti-inflamatórios não hormonais para aliviar a dor6. A descoberta de novas terapias, como os exossomos7 ea engenharia tecidual8, tornou-se potencial estratégia de tratamento das doenças musculares esqueléticas, compensando as deficiências dos tratamentos farmacológicos anteriores. No entanto, também pode aumentar o custo do tratamento para os pacientes, colocando-os sob enorme pressão financeira9. Portanto, terapias alternativas e complementares são recomendadas para o tratamento de problemas musculoesqueléticos10. Tuina é amplamente utilizado clinicamente na China como um método médico tradicional e é popular entre os pacientes por sua eficácia e menos efeitos colaterais. A terapia com Tuina para distúrbios musculoesqueléticos pode aliviar a dor e melhorar a função11,12,13. O Sr. Ding Jifeng, um famoso praticante de Tuina de Xangai, fundou o método de rolo14 de Ding. É uma técnica única de rolamento e esmagamento com uma grande área de força, força uniforme e suave, e penetração intensa.
Diferentes modelos animais são baseados em diferentes etiologias. Apresentam vantagens e desvantagens, e a seleção de modelos animais corretos e apropriados é de grande importância para experimentos básicos, o que ajuda a entender as vias de sinalização celular e molecular de regeneração e reparo após lesão muscular esquelética para o desenvolvimento de novas terapias para o tratamento de doenças musculares esqueléticas. Modelos quimicamente induzidos de lesão muscular são amplamente utilizados, com injeções de músculo esquelético causando necrose de miofibras e produzindo áreas regeneradas que podem efetivamente se regenerar dentro de 2 semanas15. Tanto a notexina quanto a bupivacaína podem causar danos musculares. No entanto, a notexina pode causar dano miotóxico mais grave ao músculo esquelético do que a bupivacaína, e a recuperação funcional natural é relativamente mais lenta16. A moldagem por injeção intramuscular de drogas não só leva menos tempo, mas também tem efeitos controlados e extensão do dano muscular esquelético. Esse controle quantificável dificulta menos a moldagem com sucesso15,17.
A resposta inflamatória é uma resposta biológica essencial que tem sido extensivamente estudada no contexto damiopatia18,19. Nos estágios iniciais da lesão muscular esquelética, a necrose das miofibras interrompe a homeostase muscular local, e muitas células inflamatórias infiltram o local da lesão, secretando muitas citocinas pró-inflamatórias19. A creatina quinase (CK) é um biomarcador sérico tradicional para avaliação da lesão muscular esquelética. No entanto, carece de especificidade tecidual20 e sensibilidade21, o que limita sua capacidade de avaliar a extensão do dano muscular induzido por drogas e relatar indiretamente a extensão da recuperação muscular após a lesão. Novos biomarcadores, incluindo a proteína ligadora de ácidos graxos 3 (FABP3), têm mostrado recentemente especificidade e sensibilidade teciduais relativamente altas em modelos de lesão muscular esquelética em roedores. FABP3 é uma família de proteínas de ligação expressas principalmente em células musculares cardíacas e esqueléticas e implicadas no metabolismo, transporte e sinalização de ácidos graxos22. Portanto, escolhemos uma combinação de dois biomarcadores, CK e FABP3, para avaliar a extensão do dano muscular esquelético induzido pela notoxina e a recuperação após o tratamento.
Em roedores, os músculos são superficiais, e a área da pele é pequena, o que também determina que os vários parâmetros de massagem em roedores não serão os mesmos que em humanos, como na terapia animal, o massagista deve tratá-los com menos força usando o método de rolo de Ding, e pode não ser propício para a operação desta técnica devido ao pequeno tamanho da área lesionada, o que pode, em última análise, levar a uma redução na eficácia da massagem. Portanto, o experimento utilizou o massageador de rolamento fabricado internamente, que está de acordo com as características do método do rolo de Ding, para intervir e avaliar o efeito terapêutico do modelo de lesão muscular esquelética induzida por notoxina em ratos, o que ajuda a padronizar os parâmetros de Tuina em estudos experimentais em animais, a fim de investigar profundamente o mecanismo molecular de ação de Tuina, um método de tratamento da medicina tradicional chinesa, sobre doenças musculoesqueléticas.
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Protocolo
Os procedimentos envolvendo animais foram aprovados pelo Comitê de Cuidados e Uso Institucional da Universidade de Medicina Chinesa de Hunan.
1. Montagem do massageador rolante
- Selecione um massageador que consista em um rolo de borracha, suporte de garfo, mola, defletor limite, tala de ajuste, parafuso e alça de acrílico (Figura 1). Certifique-se de que o rolo de borracha mede 3 cm de comprimento e 1,6 cm de diâmetro, a mola mede 3 cm de comprimento e 0,9 cm de diâmetro, o defletor limite tem 3 cm de comprimento e 2 cm de largura, e o cabo mede 12 cm de comprimento e 0,9 cm de diâmetro.
- Controle de força: De acordo com os resultados daliteratura23, a pressão descendente do método do rolo de Ding foi encontrada em cerca de 10% do peso corporal, de modo que a pressão aplicada durante o projeto de rolamento para frente é de cerca de 10% do peso corporal do rato (0,2-0,3 N). Teste a pressão máxima do massageador no controlador de pesagem para cerca de 0,3 N ajustando o ângulo do defletor limite. Este requisito de pressão atende às necessidades do rato.
- Certifique-se de que a pressão mínima seja de cerca de 0,08 N ao reverter (Figura 2). Certifique-se de que a pressão esteja precisamente em conformidade com o requisito do método de rolagem de Ding, de que a relação das forças para frente e para trás seja de 3:1.
- Antes do tratamento, peça ao operador que trabalhe com o software do metrônomo para controlar a frequência de rolamento para 140 rolos/min e pratique isso mais de 3x no pré-experimento para garantir que a operação seja padronizada.
2. Estabelecimento de um modelo de lesão muscular esquelética em ratos
- Divida aleatoriamente 24 ratos machos da raça Sprague-Dawley (pesando 200-250 g) em três grupos de oito ratos cada, incluindo controle (C), notexina (NTX) e notexina com Tuina (NTX + Tuina), e alimente-se com uma dieta padrão. Manter em um ciclo de 12 h claro/12 h escuro, casa a 20-25 °C e 50%-70% de umidade.
- Anestesiar com pentobarbital sódico a 1% (40 mg/kg) por injeção intraperitoneal e, em seguida, remover os pelos do membro inferior direito com creme depilatório. Depois de remover o pelo, limpe o creme residual usando soro fisiológico. Confirme a anestesia adequada pela resposta de pinça dos dedos. Aplique pomada oftálmica para hidratar os olhos enquanto o animal estiver sob anestesia. Fornecer suporte térmico durante todo o procedimento.
- Desinfecção de pele alternada para o membro inferior direito com solução desinfetante de iodóforo e álcool a 75% antes da injeção. Toque um cotonete embebido em solução desinfetante iodóforo no centro da pele da extremidade inferior e aplique em um movimento circular para fora. Repita com um cotonete embebido em etanol.
- Estabelecer modelos de lesão muscular esquelética de acordo com o método dereferência24. Injete notexina em apenas uma perna (para evitar a injeção dupla de notexina). Extrair 200 μL de solução de notexina (10 μg/ml de solução de notexina preparada adicionando 100 μg de notexina a 10 ml de solução salina normal num tubo de centrífuga de 15 ml) numa seringa de 1 ml com uma agulha de 30G e injectar a solução de notexina por via intramuscular no músculo gastrocnêmio para produzir lesão muscular.
- Injete a notexina lentamente e aguarde 3 s antes de retirar a agulha (a ser totalmente injetada).
CUIDADO: Notexin é um produto químico tóxico que requer lavagem imediata com muita água em contato com uma ferida aberta e atenção médica imediata, se necessário. - Injetar nos ratos do grupo controle 200 μL de solução salina. Mova ratos anestesiados para gaiolas vazias com roupa de cama limpa. Tome cuidado para remover o acolchoamento ao redor do nariz e da boca dos ratos para manter sua respiração clara. Observe visualmente a cor do tecido e a frequência respiratória no final da injeção até que os ratos recuperem a consciência suficiente.
- Retorne os ratos para a gaiola doméstica e normalmente crie-os por 24 horas.
3. Terapia Tuina
- Colocar um rato SD em decúbito ventral com a cabeça coberta com um pano preto sobre a plataforma experimental desinfetada com álcool a 75% para expor o músculo gastrocnêmio. Não cubra com muita força.
- Usando o massageador Tuina para o grupo NTX+Tuina: Segure o massageador e coloque o rolo no músculo gastrocnêmio do rato e role para frente até que a mola entre em contato com o defletor limite. Em seguida, retrair a força e retornar à sua posição original, retribuindo assim o movimento (Figura 3).
- Enrole o massageador a uma velocidade de 140 rolos por minuto e execute cada operação por 3 min. Realizar as massagens uma vez pela manhã e uma vez à tarde por 3 dias consecutivos.
- Retornar os ratos à gaiola domiciliar após cada tratamento e permanecer em jejum por 8 h após o último tratamento.
4. Coleta de sangue e tecidos de ratos após o experimento
- De acordo com os requisitos do comitê de ética em experimentação animal relevante, anestesiar ratos por injeção intraperitoneal de pentobarbital sódico a 1% (40 mg/kg, injeção intraperitoneal). Confirme a anestesia adequada pela resposta de pinça dos dedos. Eutanásia de ratos por sangria da aorta abdominal após coleta de sangue.
- Desinfeção alternada da pele com solução desinfetante de iodóforo e álcool a 75% antes da injeção. Toque um cotonete embebido em iodopovidona no centro da pele abdominal e aplique em um movimento circular para fora. Repita com um cotonete embebido em etanol. Repita a desinfecção 3x.
- Peça ao assistente para usar dois hemostáticos para levantar a pele no meio do abdômen. Como operador, use um bisturi para cortar a pele abdominal e os músculos da rafe até a sínfise púbica.
- Após a abertura da cavidade abdominal, separe o intestino com bolas de algodão estéreis para expor a aorta abdominal na parede abdominal posterior.
- Localize a aorta abdominal, pegue 5 mL de sangue de rato em tubos de coleta de sangue e obtenha o plasma em 1,5 microtubos centrifugando a 3000 x g por 10 min após o sangue em pé por 1 h. Conservar plasma a -80 °C.
- Cortar a pele com tesoura cirúrgica ao longo da abertura abdominal inferior em direção à face lateral do membro inferior direito, expondo os músculos do membro inferior, e após separar cuidadosamente a fáscia com pinças, cortar o bisturi para remover o músculo gastrocnêmio intacto.
- Lave o músculo gastrocnêmio em soro fisiológico estéril para remover pelos e sangue aderentes.
- Colocar o músculo gastrocnêmio removido em um tubo centrífugo de 15 mL contendo paraformaldeído a 4%.
5. Detecção dos níveis plasmáticos de CK e FABP 3 por ELISA
- Calcular e determinar o número de placas pré-embaladas necessárias para um experimento. Remova as placas necessárias, coloque-as na estrutura de 96 poços, coloque as microplacas restantes de volta no saco de folha de alumínio para vedação e armazene-as a 4 °C.
- Equilibrar os kits e as amostras à temperatura ambiente (25-28 °C) durante 120 min, equilibrar-se totalmente à temperatura ambiente.
NOTA: O equilíbrio do kit e da amostra é crítico e deve ser equilibrado em tempo suficiente. - Defina poços padrão, de amostra e em branco. Adicionar 50 μL do padrão CK ou FABP3 em diferentes concentrações (100, 50, 25, 12,5, 6,25, 0 ng/mL) aos poços padrão. Repita cada padrão uma vez, ocupando um total de 12 poços.
- Encher os poços de amostra com 40 μL de diluente da amostra (0,8 g NaCl, 0,02 g KH 2 PO 4, 0,29 g Na 2HPO 4 12H2O, 0,02 g KCl, 0,01 g NaN3em 100 mL de água bidestilada, pH7,4), seguido de 10 μL da amostra a ser testada. Repita cada amostra uma vez, ocupando 48 poços no total.
- Com exceção dos poços em branco localizados dois poços atrás do último poço de amostra, adicione 100 μL de anticorpo anti-humano CK ou FABP3 marcado com HRP (anticorpo marcado com enzima) a cada padrão e poço de amostra.
- Selar os poços com filme de vedação e incubar em banho-maria ou termostato a 37 °C por 60 min.
- Descarte o líquido, seque em papel absorvente, encha cada poço com líquido de lavagem, deixe por 20 s, sacuda o líquido de lavagem, seque em papel mata-borrão e repita lavando o prato 5x (ou use uma lavadora de placas).
- Adicionar 50 μL de solução cromógena A (20 mg de tetrametilbenzidina, 10 mL de etanol em 100 mL de água bidestilada) e 50 μL de solução cromógena B (0,1 M/L de ácido cítrico, 0,2 M/L de tampão dihidrogenofosfato de sódio, pH 5,0-5,4) a cada poço. Manter longe da luz durante 15 minutos a 37 °C.
- Para poços padrão, poços de amostra e poços em branco, adicione 50 μL de solução de terminação a cada poço e meça o valor de densidade óptica de cada poço a 450 nm dentro de 15 min.
6. Análise histológica da lesão do músculo gastrocnêmio induzida pela anotoxina em ratos
- Preparar cortes de parafina de 5 μm de espessura corados com hematoxilina e eosina para exame microscópico de luz, conforme descrito em25.
7. Processamento de imagens e análise de dados
- Leia e analise as imagens capturadas pelo sistema de imagem com um software de análise. Mova o campo de visão da imagem selecionada para o centro da tela com o mouse, clique em 40x e, em seguida, clique em Tirar Instantâneo.
- Registrar os valores de DO do ELISA em uma planilha eletrônica e calcular os níveis de CK e FABP3 do rato nas amostras usando a curva padrão.
- Utilizar software de análise estatística para as análises estatísticas. Expresse as medidas como média ± desvio padrão (
), e analise as comparações entre os grupos por ANOVA one-way, com o teste LSD quando a variância foi uniforme e o método Tamhane T2 quando a variância não foi uniforme. A diferença foi considerada estatisticamente significativa quando um valor de p menor que 0,05.
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Resultados
A fim de observar as propriedades morfológicas do músculo esquelético de ratos após a lesão, o músculo gastrocnêmio foi corado com hematoxilina e eosina, e as imagens coradas foram lidas com um software de análise conforme descrito no protocolo para 8 ratos por grupo. Em ratos com lesão do músculo gastrocnêmio induzida por notexina (grupo NTX), muitas células musculares estavam rompidas, atróficas, necróticas e dispostas irregularmente. Havia também alta infiltração de neutrófilos e linfócitos ao redor da área afetada (<...
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Discussão
Aqui, descrevemos um protocolo para Tuina no tratamento da lesão muscular esquelética em ratos e, em seguida, analisamos o grau de lesão muscular esquelética após o tratamento para verificar a eficácia do método. Notadamente, modelos de lesão muscular esquelética de ratos, incluindo, mas não se limitando a, indução de drogas (notaxina, bupivacaína)16, contusão contusa 26, esmagamento 27 e isquemia-reperfusão28, podem ser intervencionados com Tuina.
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Divulgações
Os autores não têm nada a revelar.
Agradecimentos
Esta pesquisa foi apoiada por subsídios da Fundação Nacional de Ciências Naturais da China (Grant Nos.82174521), Projeto de Inovação para Estudantes de Pós-Graduação da Universidade de Medicina Chinesa de Hunan(2022CX109)
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Seringa de 1 mL | JIANGXI FENGLIN | 20220521 | |
| 1,5 microtubos | Servicebio | EP-150X-J | |
| Tubo de centrífuga de 15 mL | Servicebio | EP-1501-J | |
| Agulha 30G | CONPUVON | 220318 | |
| Tubo de coleta de sangue de 5 mL | Servicebio | QX0023 | |
| Cabo de acrílico | Guangdong Guangxingwang Plastic Materials Co., Ltd | 65643645 | |
| Tala de ajuste | CREROMEM | ||
| Cotonete | INOHV | 22080215 | |
| Instrumento Marcado com Enzima | Rayto | RT-6100 | |
| Etanol | INOHV | 211106 | |
| Suporte de garfo | Yongkang Kangzhe Health Technology Co., Ltd | JL001 | |
| Creme de depilação | Veet, França | LOTC190922002 | |
| Conjunto de solução de tingimento de hematoxilina | Wuhan Google Biotech | G1005 | |
| Sistema de imagem | Nikon, Japão | Nikon DS-U3 | |
| IODOPHOR solução de coloração | Hale& Microscópio | de luz 20221205 | |
| Nikon, Japão | Nikon Eclipse E100 | ||
| Defletor de limite | CREROMEM | 20220724 | |
| Notexin | Latoxan S.A.S. | L8104-100UG | |
| Pentobarbital sódico | Merck KGaA | P3761 | |
| Kit ELISA de creatina de rato (CK) | LunChangShuoBiotech | YD-35237 | |
| Proteína de ligação a ácidos graxos de rato 3 (FABP3) Kit ELISA | LunChangShuoBiotech | YD-35730 | |
| Rolo de borracha | Hebei Mgkui Chemical Technology Co., Ltd | 202207 | |
| Parafuso | Weiyan Hardware | B05Z122 | |
| Sprague Dawley ratos | Hunan Slake Kingda Laboratory Animal Co. | SYXK2019-0009 | |
| Mola | Bingzhang Hardware | TH001 | |
| Lâmina Cirúrgica | Covetrus | #23 | |
| Pesar controlador | Iyoys | HY-XSQ |
Referências
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Reimpressões e permissões
