Artigo de método

Quantificação da Calosa em Tecidos Vegetais por Ensaio Imunossorvente Ligado a Enzimas/Espectrofotometria de Imunofluorescência

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DOI:

10.3791/65833

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22 de maio de 2026

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1Department of Plant Sciences, Microbiology, and Biotechnology, College of Natural Sciences, Makerere University, 2Department of Plant Biology, College of Biological Sciences, University of California, Davis, 3The Genome Center, College of Biological Sciences, University of California, Davis, 4International Potato Center (CIP)

Neste artigo

Resumo

Esse protocolo quantifica a calosa em tecidos vegetais usando o método específico de calose, espectrofotometria de imunofluorescência/ELISA, que se baseia na ligação da calosa nas amostras vegetais a anticorpos específicos da callose, seguida pela quantificação da calosa ligada por meio de anticorpos de detecção marcados por enzimas, medindo a atividade enzimática resultante.

Resumo

Os métodos existentes de quantificação de calosas a partir de tecidos vegetais incluem microscopia de epifluorescência, espectrofotometria de fluorescência, microscopia de imunofluorescência e avaliação indireta das atividades tanto da calosa sintase quanto da β-(1,3)-glucanase. No entanto, alguns desses métodos apresentam limitações significativas, que incluem serem demorados, não específicos para caloses, trabalhosos, subjetivos, alta autofluorescência, baixa sensibilidade, serem mais qualitativos do que quantitativos e exigirem a aquisição de recursos de software e habilidades técnicas. Portanto, há uma necessidade urgente de explorar métodos alternativos para a quantificação da calosa em tecidos vegetais. Foi hipotetizado que a espectrofotometria de imunofluorescência ou o ensaio imunossorvente ligado a enzimas (ELISA), que utiliza anticorpos específicos da calose, poderiam superar algumas das limitações dos métodos atuais de quantificação de calosa. O estresse biótico foi administrado inoculando plantas de bananeira derivadas de cultura de tecido com Xanthomonas vasicola pv. bactérias musacearum (Xvm) que induziam a produção de calosa. Amostras de tecido de cormo de banana foram coletadas 14 dias após a inoculação (dpi) para quantificação da calosa, utilizando o novo método de espectrofotometria de imunofluorescência. A produção de calosas nos cormos dos grupos inoculados com Xvm e controle variou significativamente em ambos os genótipos de banana ( teste t-amostra independente, p < 0,05). O método de espectrofotometria de imunofluorescência descrito aqui poderia ser aplicado para a quantificação da calosa em diferentes tecidos vegetais com alta especificidade para calose, sensibilidade, confiabilidade e reprodutibilidade. Além disso, o uso de uma placa de 96 poços torna esse método adequado para estudos de quantificação de calosa de alto rendimento, com enviesamentos e viés mínimos de amostragem.

Introdução

Callose é um polissacarídeo de β-1,3-glucano, que é um composto naturalmente presente nas paredes celulares de várias plantas superiores. A calosa é sintetizada por calossintases (CalS) e degradada por β-(1,3)-glucanases 1,2,3. Está envolvida em vários processos biológicos, incluindo crescimento e desenvolvimento e resposta a estresses abióticos e bióticos 4,5,6. Durante a infecção por patógenos, o aumento da deposição de calosas nas papilas ajuda a prevenir uma colonização microbiana adicional, atuando como uma barreira de permeabilidade entre as células vegetaisvizinhas 2,4,7,8,9,10,11,12 . Ao desacelerar a invasão de patógenos no tecido atacado, a deposição calosa permite tempo para a indução de respostas de defesaadicionais 13. A quantificação espaço-temporal precisa da calosa nos tecidos vegetais é essencial para entender seu papel nos diversos processos fisiológicos. No entanto, os métodos atuais de quantificação de calosas a partir de tecidos vegetais, que incluem microscopia de epifluorescência, microscopia de imunofluorescência e espectrofotometria de fluorescência, apresentam limitações significativas e desafios de quantificação. Portanto, há uma necessidade urgente de explorar métodos alternativos para quantificação de calosas a fim de superar essas desdesvanecimentos. Foi hipotetizado que a espectrofotometria de imunofluorescência ou o ensaio imunossorvente ligado a enzimas (ELISA) poderiam oferecer um método mais eficiente de quantificação de calosas em amostras de plantas, incluindo alta especificidade, sensibilidade, confiabilidade, reprodutibilidade e um método de alto rendimento.

O método padrão ouro para quantificação de calosas envolve a imagem de partículas de calosa coloridas com azul de anilina por microscopiade epifluorescência 14,15,16,17. A calosa tingida de azul com anilina, quando exposta à excitação de luz azul ou UV, aparece como partículas fluorescentes amarelas, que podem ser contadas manualmente para o número de partículas de calosafluorescentes 14,15 ou contadas por software automatizado de contagem de calosa. A contagem manual de partículas calosas é trabalhosa, demorada e subjetiva para opesquisador 18, enquanto a contagem automatizada exige aquisição de recursos de software e consideráveis habilidades técnicas. Alguns dos softwares usados para contagem automática de calosas incluem ImageJ 19,20,21,22, photoshop 23, CalloseMeasurer24, Icy18,25 e Ilastik26. A calosa colorida de azul de anilina também pode ser quantificada usando espectrofotometria defluorescência 17,19,27,28,29. No entanto, a alta autofluorescência de fundo/autofluorescência associada à microscopia de epifluorescência e à espectrofotometria de fluorescência torna esses métodos difíceis e pouco confiáveis devido à baixa relaçãosinal-ruído de 26. Além disso, o azul de anilina pode corar outros β-1,3-glucanos além dacalosa 30, tornando tanto a microscopia de epifluorescência quanto os métodos de espectrofotometria de fluorescência para detecção e quantificação de calosa parcialmente inespecíficos e pouco confiáveis. Um método de microscopia de imunofluorescência para quantificação de calosa, baseado em anticorpos específicos de calose, também foi utilizado em váriosestudos 31,32,33. Embora esse método compartilhe algumas desvantagens com a microscopia de epifluorescência de calos tingidos com azul de anilina, ele tem a vantagem de ser específico para calose devido aos anticorpos usados aqui. A quantificação de calosas também foi realizada usando métodos baseados em atividade enzimática. Métodos baseados em atividade enzimática para quantificação de calosa incluem a avaliação das atividades da calosa sintase (CalS)20,33 e β-(1,3)-glucanase 34,35. Os métodos baseados em atividade enzimática apresentam várias desvantagens em comparação com a microscopia de epifluorescência, a microscopia de imunofluorescência e a espectrofotometria de fluorescência. Esses incluem a estimativa indireta da calose, a dificuldade de extração enzimática e os ensaios de atividade enzimática, e a falta de distribuição uniforme da calosa nos tecidos vegetais.

Devido às desvantagens dos métodos atuais de quantificação de calosa, que incluem microscopia de epifluorescência, microscopia de imunofluorescência, espectrofotometria de fluorescência, ensaios CalS e β-(1,3)-glucanase, foi necessário desenvolver um novo método de quantificação de calosas que oferecesse várias vantagens, incluindo: 1) alta especificidade, sensibilidade, confiabilidade e reprodutibilidade, e 2) quantificação de calosas mais fácil com alta capacidade de rendimento. O uso da espectrofotometria de imunofluorescência para quantificação de calosas ainda não foi explorado. Aqui, é apresentado um novo método de quantificação de calosas baseado em espectrofotometria de imunofluorescência, mais especificamente o Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA). O método pode ser otimizado para a quantificação de calosas em diferentes plantas ou seus tecidos, com um bom grau de especificidade em calosidade, precisão, reprodutibilidade e capacidade experimental de alto rendimento. Esse método também pode ser modificado para quantificar qualquer analito de origem vegetal, caso o anticorpo esteja disponível. Para garantir uma distribuição espaço-temporal precisa, eficiente e confiável da calosa nos tecidos vegetais, recomenda-se que diferentes métodos de quantificação da calosa sejam usados simultaneamente, incluindo microscopia, espectrofotometria e métodos baseados em atividade enzimática. Consequentemente, isso permitirá compreender de forma precisa e eficiente o papel da calosa em várias respostas fisiológicas e de estresse.

Protocolo

1. Inoculação de plantas experimentais

  1. Isolar, preparar e confirmar o inóculo Xvm usando procedimentospadrão 36,37. Selecione aleatoriamente 10 plantas de Musa balbisiana e Mbwazirume derivadas de cultura tecidual de 2 meses e inocule o lado dorsal do pecíolo folhárico mais jovem e totalmente aberto com 200 μL (1 x 108 células) do inoculo Xvm confirmado por PCR (Figura 1)38.
  2. Da mesma forma, selecione aleatoriamente 10 plantas de bananeira Musa balbisiana e Mbwazirume e inocule-as com 200 μL de água destilada estéril (SDW).
  3. Mantenha as bananeiras inoculadas com Xvm e controle as bananeiras em condições semelhantes na casa de revisão, com um fotoperíodo de 12 horas de luz e 12 horas de escuridade a 25 °C, regando-as a cada 3 dias.
    NOTA: Consulte a Tabela de Materiais e a Tabela 1 para a lista de materiais e equipamentos e a receita dos tampões, respectivamente.

2. Amostragem de tecidos de cormos e preparação da amostra

  1. Realizar amostragens destrutivas para obter amostras de cormos das plantas experimentais (Figura 1).
  2. Retire rapidamente aproximadamente 2 g das amostras de cormo usando lâminas cirúrgicas estéreis aos 14 dias após a inoculação (dpi) e coloque-as individualmente em tubos rotulados de 50 mL. Faça isso para todas as 10 amostras coletadas das plantas inoculadas com Xvm e das plantas controle.
  3. Imediatamente imerga os tubos de 50 mL contendo as amostras em nitrogênio líquido.
  4. Transporte as amostras para o laboratório e armazene-as a -80 °C até estar pronto para prosseguir. Armazene as amostras a −80 °C por até 1 ano ou mais, com ciclos mínimos de congelamento e descongelamento.
  5. Secar as amostras por liofilização por 72 horas usando um liofilizador (Figura 1).
  6. Coloque exatamente 30 mg das amostras liofilizadas em tubos de 2 mL contendo 2 esferas de aço para bicicleta e pulverize-as até virar pó fino, com a velocidade ajustada a 5 por 1 minuto (Figura 1).
  7. Armazene as amostras pulverizadas em um ambiente fresco e seco em temperatura ambiente, bem vedadas até que estejam prontas para continuar. Armazene as amostras pulverizadas em temperatura ambiente por até 4 meses ou a −80 °C por até 1 ano, com ciclos mínimos decongelamento-descongelamento de 39,40.

3. Extração de calosa e preparação de padrões de laminarina e blank

  1. Para extrair calcosa dos 30 mg da amostra pulverizada do cormo, adicione 800 μL de 1 M de NaOH e incube por 30 minutos a 80 °C em banho-maria, com vórtices ocasionais a cada 10minutos 27,41 (Figura 1, Passo 6).
  2. Deixe as amostras esfriarem até a temperatura ambiente (aproximadamente 5 min) e depois centrifuge a 15.294 x g por 5 min.
  3. Transfira o sobrenadante (extrato de calosa) para um tubo estéril de 2 mL e dilua com o tampão bloqueador (Tabela 1) na proporção de 1:2.
    NOTA: Escolha o fator de diluição com base em experimentação preliminar e otimização. A diluição do extrato de calosa pode ou não ser necessária. Quando necessário, a diluição deve ser realizada no buffer de bloqueio e a razão de diluição deve ser otimizada para que diferentes tipos de amostra se enquadrem na faixa da curva padrão.
  4. Armazene os extratos de calosa a -20 °C até estar pronto para prosseguir. Armazene o extrato de calosa por até 6 meses com ciclos mínimos de congelamento e descongelamento.
  5. Prepare um estoque concentrado de laminarina padrão a 100 mg/mL em 1 M NaOH 6,42,43,44,45.
    NOTA: A laminarina é um polímero 1-3-β-glucano e pode ser usada como padrão para equivalentes calosos em espectrofotometria de imunofluorescência.
  6. Incube a suspensão resultante do padrão a 80 °C em banho-maria, agitando-a suavemente em intervalos, até que toda a laminarina esteja completamente dissolvida (aproximadamente 20-40 minutos).
  7. Resfrie o padrão dissolvido até temperatura ambiente (aproximadamente 10 minutos).
  8. Prepare padrões de laminarina em concentrações de 80 mg/mL, 60 mg/mL, 40 mg/mL, 20 mg/mL, 10 mg/mL, 1 mg/mL, 0,5 mg/mL, 0,1 mg/mL e 0,01 mg/mL usando o tampão bloqueador, partindo do estoque concentrado de 100 mg/mL.
  9. Prepare os blanks misturando 1 M NaOH e o buffer de bloqueio em uma proporção de 1:2. Se for necessária diluição, use a mesma razão de diluição usada para preparar o extrato de calosa.
  10. Armazene os padrões de laminarina e os blanks a −20 °C. Armazene os padrões e blanks por até 6 meses com ciclos mínimos de congelação-descongelação.

4. Quantificação da calosa pela espectrofotometria de imunofluorescência

  1. Adicione 100 μL do anticorpo primário (IgG de camundongo dirigido a 1-3-β-glucano) preparado usando o tampão de revestimento (Tabela 1) em cada um dos 96 poços das placas ELISA de poliestireno (Figura 2).
  2. Sele a placa firmemente com filme de parafina e incube-a durante a noite a 4 °C na geladeira.
  3. No dia seguinte, coloque o prato na bancada e deixe ele atingir a temperatura ambiente (aproximadamente 10 minutos).
  4. Lave a placa usando os procedimentos padrão de secagem elavagem 46. Resumidamente, adicione 200 μL do buffer de lavagem (Tabela 1) aos poços, faça vórtice a 500 rpm por 30 s usando um shaker digital e manche papel de seda. Repita esse processo de lavagem 2 vezes (Figura 2). Certifique-se de que os poços não sequem completamente e use uma ponta de micropipeta estéril para remover quaisquer bolhas dos poços sem tocar na base e nas paredes dos poços.
  5. Adicione 200 μL do buffer de bloqueio a cada um dos poços (Figura 2) e sele a placa firmemente com filme de parafina. Incube por 4 horas a 37 °C. Lave o prato conforme mencionado acima (Figura 2).
  6. Adicione 100 μL do extrato de calosa das 10 plantas inoculadas com Xvm e 10 de controle nos poços designados. Adicione 100 μL dos padrões laminarinos a outros poços. Adicione 100 μL do blank a outros poços (Figura 2).
  7. Fele a placa firmemente com filme de parafina e incube durante a noite a 4 °C na geladeira. Lave o prato novamente, como mencionado acima (Figura 2).
  8. Adicione 100 μL do anticorpo primário (IgG de camundongo dirigido a 1-3-β-glucano) preparado usando o tampão bloqueante em cada um dos poços (Figura 2).
  9. Sele a placa firmemente com filme de parafina e incube por 4 horas a 37 °C, depois lave a placa conforme indicado acima (Figura 2).
  10. Adicione 100 μL de anticorpo secundário anti-IgG-fosfatase alcalina anti-mouse em cadapoço 46,47 (Figura 2).
  11. Sele a placa firmemente com filme de parafina e incube durante a noite a 4 °C na geladeira. Depois, lave a placa conforme indicado acima (Figura 2).
  12. Adicione 100 μL de solução de para-nitrofenil fosfato (pNPP) recém-preparada a uma concentração de 1 mg/mL (Tabela 1) aos poços (Figura 2)
  13. Incube a placa na bancada em temperatura ambiente por 30 min48.
    NOTA: O tempo de incubação pode variar dependendo das amostras de plantas e do padrão utilizado. Neste estudo, a laminarina teve a melhor leitura em 30 minutos.
  14. Termine a reação adicionando 100 μL de solução de parada recém-preparada (0,5 M NaOH) a cada um dospoços 48 (Figura 2).
  15. Transfira a placa para um leitor de microplacas (equilibrado a 37 °C), agite-a em velocidade média por 1 minuto e leia as absorvâncias a 405 nm48 (Figura 1, Figura 2).

5. Análise de dados

  1. Realize uma regressão linear simples da absorvância da laminarina a 405 nm em relação à concentração de laminarina (μg/mL) para obter a curva padrão. A equação da curva padrão é
    Y = β1X + β0
    onde Y representa a absorção da laminarina em 405 nm, β1 é a inclinação da linha de regressão (coeficiente de correlação de Pearson), X é Log10 (concentração de laminarina em μg/mL) e β0 é a interseção y.
  2. Calcule as concentrações de calosas nas amostras de cormos subtraindo a absorvância do blank da absorvância das amostras. Depois, use a curva padrão para estimar a concentração de calosa em μg/mL como equivalente à laminarina (LE).
  3. Examine todos os dados quanto à normalidade da distribuição usando o teste de Shapiro-Wilk e verifique homoscedasticidade das variâncias usando o teste de Levene (α > 0,05).
  4. Utilize o teste t da amostra independente para comparar a produção de calosas entre os grupos inoculado com Xvm e controle (p≤ 0,05).

Resultados

As concentrações conhecidas dos padrões de laminarina foram analisadas por espectrofotometria e seus valores correspondentes de absorção foram registrados. Usando esses dados, foi construído um gráfico de Beer-Lambert ao plotar as concentrações dos padrões de laminarina no eixo x e a absorvância no eixo y. A equação da linha de regressão foi y = 0,5079x − 0,04534 (Figura 3)49. O gráfico de Beer-Lambert forneceu um alto coeficiente de correlação (r) de 0,9988 e um coeficiente de determinação (r2) de 0,9975, indicando uma forte relação linear entre concentração e absorvanzância e, até 0,9975 da variância na variável dependente (absorvância) foi explicada pela variável independente (concentração; Figura 3; p<0,0001). Portanto, esse modelo foi um bom ajuste, preciso e confiável para prever a concentração de laminarina e calose. A concentração de calosa nas amostras de cormos de banana foi determinada medindo a absorvância das amostras por meio de espectrofotometria e usando os valores de absorvância para calcular as concentrações de calosa usando a equação.

O ensaio de espectrofotometria de imunofluorescência mostrou aumento significativo na calosa induzida em plantas inoculadas com Xvm em comparação ao grupo controle em ambos os genótipos de banana (teste t de amostra independente, p < 0,05; Figura 4). A produção de calosa nas plantas de controle a 14 dpi foi de 1474,34 mg/mL e 1037,11 mg/mL para Mbwazirume e M. balbisiana, respectivamente (Figura 4). A inoculação das plantas com Xvm resultou em 4190,78 mg/mL e 1996,07 mg/mL de calosa nos cormos das plantas Mbwazirume e M. balbisiana inoculadas com Xvm a 14 dpi, respectivamente (Figura 4). A inoculação com Xvm causou uma produção de calosas de 1,9 a 2,8 vezes maior em comparação com as plantas controle (teste t de amostra independente, p < 0,001; Figura 4).

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Figura 1: Ilustração esquemática dos principais passos envolvidos na quantificação da calosa pelo novo método de espectrofotometria de imunofluorescência. Esta figura demonstra os principais passos envolvidos na quantificação da calosa a partir de tecidos de banana, que incluem a elevação das plantas derivadas da cultura tecidual, inoculação com Xvm, amostragem destrutiva dos tecidos cormáticos, liofilização das amostras, extração da calosa e quantificação da calosa pelo novo método de espectrofotometria de imunofluorescência. Esse número foireimpresso em 50. Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

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Figura 2: Ilustração esquemática detalhada do método de espectrofotometria de imunofluorescência para quantificação de calosa. Esta figura apresenta uma demonstração detalhada do método de espectrofotometria de imunofluorescência para quantificação de calosa, mostrando como a placa ELISA é carregada com os vários componentes e como a calosa é finalmente quantificada por espectrofotometria. Esse número foireimpresso em 50. Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

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Figura 3: Quantificação de proteínas. O gráfico de Beer-Lambert baseado em padrões de laminarina de concentrações conhecidas e leituras de absorção (em 405 nm) foi usado para calcular concentrações de calosa (como equivalentes de laminarina, LE) a partir de leituras de absorção das amostras de corm. Esse número foireimpresso em 49. Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

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Figura 4: Comparação da concentração de calosa. Comparação das concentrações médias de calosa (média ± SEM, n = 9) nos cormos das plantas de banana M. balbisiana e Mbwazirume inoculadas com Xvm , conforme determinado pelo novo método de espectrofotometria de imunofluorescência (teste t da amostra independente, α ≤ 0,05). Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

BufferComposiçãoArmazenamento
Buffer de bloqueio10 g de albumina sérica bovina (BSA; 1% w/v), dissolvida em 1 L de PBS.-20 °C por até 6 meses
Amortecedor de revestimento1,59 g de carbonato de sódio (Na2CO3), 2,93 g de bicarbonato de sódio (NaHCO3), 0,2 g de azida de sódio (NaN 3), dissolvem-se em 1 L de H2O deionizado, pH 9,6.-20 °C por até 12 meses
Buffer conjugado2 g de PVP (2% em v/v), dissolvido em 1 L de tampão bloqueador.-20 °C por até 6 meses
Solução de fosfato de para-nitrofenil (pNPP)Dissolva o fosfato de para-nitrofenil (pNPP) em um tampão do substrato até uma concentração de trabalho de 1 mg/mL-20 °C por até 12 meses
Solução salina tamponada com fosfato (PBS)8,0 g de cloreto de sódio (NaCl), 0,2 g de fosfato de potássio monobásico (KH2PO4), 1,15 g de fosfato de sódio dibásico (Na2HPO4), 0,2 g de cloreto de potássio (KCl), 0,2 g de azida de sódio (NaN 3), dissolvidos em 1 L deH2Odesionizado, pH 7,4.-20 °C por até 12 meses
Anticorpo primário no tampão bloqueadorReconstitua o anticorpo primário liofilizado conforme a instrução do fabricante para obter o estoque concentrado. Diluir o estoque primário de anticorpos reconstituído obtido em buffer bloqueador para uma concentração de trabalho de 2 μg/mL.-20 °C por até 6 meses
Anticorpo primário no tampão de revestimentoReconstitua o anticorpo primário liofilizado conforme a instrução do fabricante para obter o estoque concentrado. Diluir o estoque primário de anticorpos reconstituído obtido no tampão de revestimento a uma concentração de trabalho de 2 μg/mL.-20 °C por até 6 meses
Anticorpo secundário1:1000 do concentrado secundário de anticorpos: tampão conjugado-20 °C por até 6 meses
Buffer de substrato97 mL de dietanolamina, 0,2 g de azida de sódio (NaN 3), dissolvidos em 1 L de H2O desionizado, pH 9,8-20 °C por até 12 meses
Buffer de lavagem0,5 mL de Tween 20 (0,05% v/v), dissolvido em 1 L de PBS, pH 7,5-20 °C por até 12 meses

Tabela 1: Receita para tampões.

Discussão

O método de espectrofotometria de imunofluorescência foi aplicado pela primeira vez na quantificação de calosa em cormos de banana. Ele é baseado no imunoensaio enzimático (EIA), usado para quantificar a calosa no extrato bruto de NaOH 1 M da banana, utilizando anticorpos específicos da calose 47,51,52. Resumidamente, esse novo ensaio de quantificação específico para calose baseado em espectrofotometria de imunofluorescência envolveu o revestimento da microplaca com anticorpo específico para calose, que então se liga à calosa no extrato da planta, seguido por um anticorpo secundário também específico para a calose. A detecção de um anticorpo ligado a uma enzima (fosfatase alcalina) é então adicionada e forma um complexo com o anticorpo secundário. Um substrato, o para-nitrofenil fosfato (pNPP), é então adicionado. A quantificação da calosa na amostra depende da capacidade da fosfatase alcalina de clivar os grupos fosfato das moléculas de pNPP, resultando na formação de um composto de cor amarela (p-nitrofenol). A detecção da intensidade da cor amarela foi feita usando um espectrofotômetro a 405 nm e a absorvância foi então correlacionada à atividade da fosfatase alcalina, que era diretamente proporcional à concentração de calosas presentes na amostra. A reação foi interrompida pelo aumento do pH por meio da adição de 0,5 M de NaOH, que impediu uma atividade adicional da fosfatase alcalina.

Em contraste, o método padrão do ouro para localização e quantificação da calosa é o método da microscopia de epifluorescência, um método bem estabelecido baseado na coloração da calosa com azul de anilinafluorocromo 53. Resumidamente, esse método baseia-se na ligação específica do corante azul de anilina aos beta-1,3-glucanos (calose), formando um complexo. O azul de anilina nesse complexo é então excitado usando a luz ultravioleta (comprimento de onda de 365-375 nm). Quando o corante azul anilina é excitado, ele emite fluorescência azul que é capturada para permitir a visualização específica da calosa nos tecidosvegetais 53. A quantificação da calosa tingida com azul de anilina segue uma série de técnicas de imagem que quantificam a quantidade de fluorescência proveniente dos tecidos vegetais. A fluorescência é proporcional à quantidade de calosa disponível nos tecidos vegetais. A microscopia de epifluorescência tem sido usada na visualização e quantificação de calosa em estresse biótico54.

Em um estudo separado, a deposição de calosa foi determinada usando microscopia de epifluorescência e espectrofotometria de imunofluorescência49. Embora algumas diferenças tenham sido observadas nos dados, a análise estatística mostrou em grande parte congruência entre a microscopia de epifluorescência e a espectrofotometria de imunofluorescência, indicando consistência nos dois métodos de detecção de calos. Embora os resultados dos dois métodos tenham sido em grande parte congruentes, é recomendável que tanto a microscopia de epifluorescência quanto a espectrofotometria de imunofluorescência se complementem para uma avaliação mais confiável. Embora o método baseado em ELISA seja específico para caloses, sensível e confiável, ele inicialmente consome tempo durante a otimização do protocolo e a obtenção de uma curva padrão de melhor ajuste que atenda a todas as concentrações e absorvances.

Alguns dos métodos para quantificação de calosas são laboriosos 17,32,55, demorados 26,56, não específicos para caloses, já que o azul de anilina pode corar outros β-1,3-glucanos além dacalosa 30, requerem softwares caros e sofisticados de contagemde calosa 23,24,26 , exigem uma quantidade considerável de habilidades técnicas e a alta infraestrutura/autofluorescência associada à espectrofotometria de fluorescência torna a quantificação de calosa difícil e poucoconfiável 26. Métodos de quantificação calosa baseados em fluxo de trabalho automatizado de análise de imagens, como o software ImageJ, exigem treinamento adequado do plug-in de análise de imagem, como o Trainable Weka Segmentation (TWS) para ImageJ, e esteé um 57 muito trabalhoso.

Ensaios baseados em espectrofotometria por imunofluorescência são altamente preferidos devido à sua especificidade, sensibilidade, facilidade de uso e reprodutibilidade. No entanto, é importante notar que o sistema de detecção e sua sensibilidade podem variar dependendo do protocolo específico de ensaio e do equipamento utilizado.

Aqui, é descrito um novo método de quantificação de calosas baseado na espectrofotometria de imunofluorescência. O método descrito aqui pode ser aplicado para a quantificação de calosa em diferentes tecidos e espécies vegetais com nível satisfatório de especificidade para calosidade, alta precisão e reprodutibilidade. Esse método é uma adição aos diversos métodos de quantificação de calosas e pode ser usado para monitorar mudanças nos níveis de calosa durante o crescimento e desenvolvimento em plantas e em resposta a diversos estímulos ou tratamentos. Além disso, o uso de placas de 96 poços reduz a amostragem subjetiva e a análise, tornando o método adequado para quantificação de calosa de alta produtividade. É importante notar que, embora a calosa possa ser facilmente extraída de tecidos vegetais recém-colhidos17, 27, 55, a etapa de preparação da amostra envolvendo liofilização incluída neste novo protocolo oferece uma vantagem para manter as amostras por muito tempo (até 1 ano) e permite o armazenamento e envio de amostras biológicas perecíveis entre laboratórios distantes em temperaturas ambientes. Isso permite extrações repetidas de calosa sem a necessidade de preparar repetidamente todo o experimento para coleta de amostras frescas.

A espectrofotometria de imunofluorescência é recomendada para experimentos de quantificação de calosa de alto rendimento, enquanto a microscopia de epifluorescência e a microcópia de imunofluorescência podem ser usadas tanto para quantificação quanto para histolocalização de calosa em tecidos vegetais. Para garantir uma distribuição espaço-temporal precisa, eficiente e confiável da calosa nos tecidos vegetais, recomenda-se que diferentes métodos de quantificação da calosa sejam usados simultaneamente, incluindo microscopia, espectrofotometria e métodos baseados em atividade enzimática. Consequentemente, isso permitirá compreender de forma precisa e eficiente o papel da calosa em várias respostas fisiológicas e de estresse. Pesquisas futuras poderão avaliar de forma abrangente e simultânea vários métodos para quantificação de calos, que incluem microscopia de epifluorescência, microscopia de imunofluorescência, espectrofotometria de fluorescência, espectrofotometria de imunofluorescência e os métodos baseados em atividade enzimática.

Divulgações

Os autores declaram não haver conflito de interesses.

Agradecimentos

Esta pesquisa foi financiada pela Fundação Bill & Melinda Gates, bolsa número INV 009894/OPP1134098. Os financiadores não tiveram papel no desenho do estudo; na coleta, análise ou interpretação de dados; na redação do manuscrito; ou na decisão de publicar os resultados.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Papel alumínio  Kim-Fay EA Limited, Nairóbi, Quênia
Balanço analítico  Mettler-Toledo AG, Greifensee, SuíçaML204/01
Beadbeater 96BioSpec Products Inc., Bartlesville, OK, EUA1001EUR
Papel secante  Kim-Fay EA Limited, Nairóbi, Quênia
Albumina Sérica Bovina (BSA) Thermo Fisher Scientific, Massachusetts, EUAB14
Centrífuga, 5425REppendorf, Hamburgo, Alemanha5406000240
Geladeira-freezer combinado (4 e graus; C e & menos; 20 & deg; C) Haier Medical and laboratory Co. Ltd., Qingda, ChinaHYCD-282
Dietanolamina & nbsp;PanReac AppliChem Reagentes ITW, Quí mica SLU, Barcelona, Espanha191287
Shaker Digital, MixMateEppendorf, Hamburgo, Alemanha5353000529
Fosfato de hidrogênio de sódio (Na2HPO4)PanReac AppliChem Reagentes ITW, Quí mica SLU, Barcelona, Espanha141679
Placas ELISA, 96 poços, base plana, transparente, poliestireno, alta ligaçãoSarstedt AG & Companhia KG, Nü mbrecht, Alemanha82.1581.200
Filtro para o leitor de microplacas iMark, iMark 680, 405 nmLasec International Pty. Ltd., Cidade do Cabo, África do SulBRD1681011
Secador liofilizador, VirTis— BenchTop " K” série; Modelo: 4KBTXLLabWrench, Canadá, EUA448053
Ácido clorídrico (HCl) PanReac AppliChem Reagentes ITW, Quí mica SLU, Barcelona, Espanha141020
Incubador de Convecção Forçada por Isotermia, IFA-54-8Grupo Esco Lifesciences, Singapura2100002
Laminarina & nbsp;Alfa Aesar, Massachusetts, EUAJ66193
Tubos microcentrífugas 1,5 mL Eppendorf, Hamburgo, Alemanha022363204
Tubos de microcentrífuga 2 mL Genesee Scientific Corp., Califórnia, EUA24– 283
Micropipeta (30– 300 & mu; L), 12 canais, série 2100 & nbsp;Eppendorf, Hamburgo, AlemanhaEP-12-300R
Pontas de micropipeta epT.I.P.S.  SinglesEppendorf, Hamburgo, Alemanha022363204
Micropipetas (0,5&ntraço; 1000 & mu; L), Pesquisa  Além dissoEppendorf, Hamburgo, Alemanha3123000900
Leitor de absorção de microplacas, iMarkBio-Rad Laboratories, Inc., Califórnia, EUA1681135EDU
Microplate Manager 6 Versão 6 software & nbsp;Bio-Rad Laboratories, Inc., Califórnia, EUA1689520
ParafilmPaul Marienfeld GmbH & Companhia KG, Lauda-Kö Nigshofen, Alemanha740751
Para-nitrofenil fosfato (pNPP)Merck KGaA, Darmstadt, Alemanha20-106
Medidor de pH, HI9126Hanna Instruments, Woonsocket, RI, EUA02310048991
Polivinilpirrolidona (PVP) PanReac AppliChem Reagentes ITW, Quí mica SLU, Barcelona, EspanhaA2260
Cloreto de potássio (KCl)PanReac AppliChem Reagentes ITW, Quí mica SLU, Barcelona, EspanhaA2939
Di-hidrogênio fosfato de potássio (KH2PO4) PanReac AppliChem Reagentes ITW, Quí mica SLU, Barcelona, Espanha141509
Banho-maria de precisão, GP10Thermo Fisher Scientific Inc., Newinton, CT, EUATSGP10
Anticorpo primário (1-3-β-glucan-direcionado IgG de camundongo)  Bio supplies Australia Pty Ltd., Melbourne, Australia400-2
Reservatórios de reagentes  Thermo Fisher Scientific Inc., Massachusetts, EUA15075
Anticorpo secundário conjugado à fosfatase alcalina (anti-IgG-fosfatase alcalina do camundongo) Sigma Life Sciences, Nova Jersey, EUAA5153
Azida de sódio (NaN3) PanReac AppliChem Reagentes ITW, Quí mica SLU, Barcelona, EspanhaA1430
Carbonato de sódio (Na2CO3) PanReac AppliChem Reagentes ITW, Quí mica SLU, Barcelona, Espanha141648
Cloreto de sódio (NaCl) PanReac AppliChem Reagentes ITW, Quí mica SLU, Barcelona, EspanhaA2942
Carbonato de hidrogênio de sódio (NaHCO3) PanReac AppliChem Reagentes ITW, Quí mica SLU, Barcelona, Espanha141638
Hidróxido de sódio (NaOH)PanReac AppliChem Reagentes ITW, Quí mica SLU, Barcelona, Espanha141687.1210
Pré-adolescente-20Biomatik Corporation, Ontário, CanadáA4031
Água destilada ultrapuraThermo Fisher Scientific, Massachusetts, EUA10-977-015

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