O objetivo do protocolo atual é delinear as etapas necessárias para estabelecer e usar um ensaio de preferência social para peixes-zebra adultos e demonstrar que ele pode ser usado para caracterizar defeitos sociais induzidos por etanol.
Artigo de método
Modelagem de distúrbios do espectro alcoólico fetal em peixe-zebra para caracterizar o impacto de um ambiente embrionário adverso no comportamento social adulto
Neste artigo
Resumo
Resumo
Os transtornos do espectro alcoólico fetal (FASD) descrevem todos os defeitos congênitos induzidos pelo álcool. Defeitos congênitos, como deficiências de crescimento, anormalidades craniofaciais, comportamentais e cognitivas, estão associados ao FASD. As dificuldades sociais são anormalidades comportamentais comuns associadas ao FASD e muitas vezes resultam em sérios problemas de saúde. Modelos animais são fundamentais para a compreensão dos mecanismos responsáveis pelos defeitos sociais induzidos pelo etanol. O peixe-zebra é um vertebrado social que produz ovos transparentes fertilizados externamente; essas características fornecem aos pesquisadores um procedimento preciso, porém simples, para criar o fenótipo FASD e um comportamento inato que pode ser aproveitado para modelar os déficits sociais associados ao FASD. Assim, o peixe-zebra é ideal para caracterizar os déficits sociais do FASD. O objetivo do protocolo atual é fornecer ao usuário um ensaio comportamental simples que possa ser usado para caracterizar as consequências de um ambiente negativo no início do desenvolvimento e os efeitos que ele pode ter no comportamento social na idade adulta. O protocolo pode ser usado para caracterizar o efeito que as mutações ou teratógenos têm no comportamento social adulto. O protocolo descrito aqui demonstra como caracterizar o comportamento social de peixes individuais durante um ensaio social de 20 minutos. Além disso, os dados obtidos usando o protocolo atual fornecem evidências de que o protocolo pode ser usado para caracterizar os efeitos de defeitos sociais induzidos por etanol embrionário em peixes-zebra adultos.
Introdução
A exposição pré-natal ao álcool pode levar a uma variedade de defeitos congênitos conhecidos coletivamente como transtornos do espectro alcoólico fetal (FASD)1. Comportamento prejudicado, como dificuldades sociais, são defeitos congênitos comuns associados ao FASD 2,3. Infelizmente, as dificuldades sociais frequentemente resultam em sérios problemas de saúde mental4, o que pode afetar adversamente a qualidade de vida dos indivíduos com TEAF. Assim, entender os mecanismos responsáveis pelos defeitos sociais induzidos pelo etanol é fundamental.
O peixe-zebra tem características biológicas e comportamentais que os tornam adequados para avançar nossa compreensão dos mecanismos responsáveis pelos defeitos sociais induzidos pelo etanol. Por exemplo, o peixe-zebra produz grandes quantidades de ovos transparentes fertilizados externamente; essas características biológicas permitem que os pesquisadores criem facilmente fenótipos FASD precisos e replicáveis5. Para expor os embriões ao etanol 24 h após a fertilização (hpf), basta usar um microscópio de dissecação para examinar o óvulo transparente e estadiar o embrião com base em trabalhos publicados anteriormente, como Kimmel et al.6, e depois colocar o óvulo na concentração desejada de etanol pela duração desejada. Como o córion é uma barreira fraca ao álcool7, o etanol banha prontamente o embrião. Para interromper a exposição, basta remover os ovos da solução de etanol. Além de fornecer aos pesquisadores um método simples, mas preciso, para criar fenótipos de FASD, o peixe-zebra também permite que os pesquisadores façam comparações genéticas com humanos, porque 70% dos genes humanos têm um ortólogo de peixe-zebra, portanto, são uma ferramenta valiosa para entender os genes relacionados a doenças humanas8. Além disso, ao contrário de outros modelos animais, o peixe-zebra forma grupos sociais9 chamados cardumes10. O comportamento de cardume pode ser usado para caracterizar os efeitos que a exposição embrionária ao etanol tem no comportamento social11. Além disso, no peixe-zebra, uma resposta social pode ser provocada usando estímulos sociais controlados por computador12 ou um estímulo social ao vivo13.
Trabalhos anteriores caracterizaram a resposta social do peixe-zebra adulto em grupos14, no entanto, uma limitação dessa abordagem é a incapacidade de correlacionar o comportamento de um peixe individual com uma medida específica, como mudanças nos níveis de neurotransmissores11. O protocolo a seguir dará aos usuários a capacidade de caracterizar o comportamento social de um peixe-zebra adulto individual. Como o comportamento social é adquirido para peixes individuais, os usuários do protocolo agora podem correlacionar o perfil comportamental adquirido de cada peixe com um resultado dependente. Por exemplo, trabalhos anteriores mostraram que a exposição embrionária ao etanol prejudica a resposta dopaminérgica a um estímulo social11. Embora os dados mostrados aqui tenham usado a exposição embrionária ao etanol como variável independente, os usuários do protocolo podem caracterizar os efeitos que outros tratamentos farmacológicos ou mutações genéticas têm no comportamento social. Além disso, os usuários do protocolo não se limitam a examinar como os tratamentos embrionários alteram o comportamento, mas também podem determinar como os tratamentos farmacológicos agudos em peixes-zebra adultos afetam o comportamento social15.
Protocolo
Todos os métodos descritos aqui foram aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais (IACUC) da Universidade de Dakota do Sul.
1. Alojamento, cuidados e exposição ao etanol embrionário do peixe-zebra
- Crie e crie peixes-zebra conforme descrito16.
- Exposição ao etanol
- Escolha o estágio de desenvolvimento apropriado para conduzir a exposição ao etanol. Neste protocolo, os embriões foram expostos ao etanol a 24 hpf.
- Coloque os ovos em 1,0% de etanol volume / volume por 2 h15. Uma proporção de 1 ovo por mL de EM é uma boa prática. Especificamente, coloque os embriões em 50 mL de meio embrionário (EM; consulte Westerfield16 para a receita EM), remova 500 μL de EM e substitua por 500 μL de etanol.
- Após a exposição ao etanol, crie embriões conforme descrito17. Ensaio de comportamento social quando os peixes têm 16 semanas de idade.
2. Randomização e configuração do tanque
- Usando um gerador de sequência aleatória online, randomize todos os ensaios a priori para conduzir os ensaios comportamentais. Certifique-se de que o lado do estímulo e os grupos de tratamento variem aleatoriamente.
- Para evitar fatores de confusão, como hora do dia ou dia do teste, inicie e termine o ensaio comportamental no mesmo horário todos os dias e realize o teste comportamental em dias consecutivos até que todos os peixes experimentais tenham sido testados.
- Para este ensaio (Figura 1), use um tanque de 37 L (50 cm x 25 cm x 30 cm, C x L x A) com tanques de 1,4 L colocados do lado de fora ao longo da largura do tanque, conforme descrito anteriormente17.
- Forre a parte traseira e o fundo do tanque de 37 L com plástico corrugado branco para aumentar o contraste entre os peixes experimentais e o fundo para melhorar o rastreamento de vídeo.
- Coloque o plástico corrugado na parede externa dos tanques de 1,4 L para aumentar o contraste do estímulo social para os peixes experimentais. Por fim, coloque plástico corrugado branco entre os tanques de 1,4 L e os tanques de 37 L; Essa barreira opaca é usada para evitar que os peixes experimentais vejam o estímulo social durante a habituação.
- Coloque a câmera a uma distância suficiente para capturar todo o comprimento do tanque de 37 L mais metade dos tanques de 1,4 L e rastrear com precisão os peixes experimentais adultos.
NOTA: Ver qual lado contém o estímulo garante que os pesquisadores rotularam as zonas de rastreamento corretamente e fornece redundância como backup. - Se nenhum rastreamento infravermelho estiver sendo usado, certifique-se de iluminar o tanque de 37 L. Use qualquer luz de exaustor de aquário disponível comercialmente com uma lâmpada de espectro total T8 de 15 W.
NOTA: Se várias arenas estiverem sendo montadas, use exaustores de aquário idênticos com lâmpadas idênticas.
3. Realização do ensaio social
- Comece enchendo o tanque de 37 L usado para o ensaio comportamental com água idêntica à água usada no rack do alojamento. Certifique-se de que a temperatura da água esteja dentro de 2 °C do rack da caixa.
- No final do dia, esvazie o tanque de 37 L. Comece cada dia de teste com água fresca. Certifique-se de que o nível de água no tanque de 37 L e o nível de água nos tanques de 1.4 L sejam idênticos. Se a temperatura da sala não mantiver a água no tanque de 37 L a 28.5 °C 2 °C, substitua a água por água morna a 28.5 °C.
- Em seguida, configure as zonas de interesse. Consulte o software de rastreamento manual do usuário de sua escolha para criar zonas. Neste protocolo, ao longo do comprimento do tanque de 37 L na parte superior e inferior, foi utilizada uma fita métrica para marcar incrementos de 5 cm. Dado que o tanque de teste é de 50 cm, incrementos de 5 cm levam a 10 zonas de 5 cm cada.
- Usando as marcas feitas no tanque de 37 L como referência, use o software para construir as zonas conectando o ponto de 5 cm na parte superior ao ponto correspondente de 5 cm na parte inferior. Além disso, crie uma zona ao longo da parte inferior e ao longo do estímulo. Personalize zonas de interesse.
- Use o software de rastreamento neste protocolo para medir a distância de uma zona e a duração gasta na zona. Neste protocolo, foram utilizadas 12 zonas.
- Quantifique o tempo gasto nas zonas 1 a 10 e a distância do estímulo e do fundo como a Zona 1, como a zona mais próxima do estímulo, enquanto a Zona 10 é a mais distante do estímulo.
- Em seguida, selecione os dois machos e duas fêmeas que serão usados para o estímulo social. A melhor prática seria usar machos e fêmeas da mesma coorte que os peixes experimentais. Se isso não for possível, tente encontrar peixes que correspondam à linhagem, idade e tamanho dos peixes experimentais.
- Transferir o peixe experimental do tanque de alojamento para a arena de teste (tanque de 37 L). Use uma rede para pegar os peixes no tanque de alojamento. Coloque a rede com o peixe em um recipiente com água de peixe.
NOTA: O uso desta abordagem reduzirá o estresse nos peixes experimentais enquanto se movem entre os tanques. - Coloque os peixes experimentais no centro da arena de teste.
- Assim que as configurações de detecção forem satisfatórias com base no software escolhido pelo usuário (consulte o manual do usuário), inicie o teste de 20 minutos. Durante os primeiros 10 minutos, deixe a barreira opaca entre o tanque de 37 L e os tanques de 1,4 L no lugar. Isso impedirá que os peixes experimentais vejam o estímulo social, composto por dois peixes-zebra machos e duas fêmeas, e permitirá que os peixes se aclimatem à arena de testes13,17.
- Após 10 min, remova cuidadosamente as barreiras opacas, puxando-as por trás do tanque; Isso permitirá que os peixes experimentais vejam o estímulo social.
- Use o software de rastreamento para rastrear e quantificar o comportamento dos peixes experimentais 11, 12, 17 com base nas preferências do usuário e no manual do software. No protocolo atual, quantifique a distância do estímulo social e do fundo do tanque, bem como o tempo gasto em todas as zonas.
- Analise dados usando ferramentas tradicionais de análise de dados.
Resultados
A Figura 2 foi modificada de Fernandes et al.17 e mostra que a exposição embrionária ao etanol embota a resposta de cardume examinando a distância do estímulo. Os dados da Figura 2 representam a distância do estímulo social durante o teste de 20 minutos. O eixo Y mostra a distância em centímetros, enquanto o eixo X mostra o teste de 20 minutos dividido em intervalos de 1 minuto. A barra preta ao longo do eixo X representa o momento em que as barreiras opacas foram removidas e o estímulo social é visível para o peixe de teste. Em todos os grupos, inicialmente, há uma rápida diminuição em direção ao estímulo social, uma vez que ele se torna visível, o que pode ser determinado pela diminuição acentuada da distância entre os minutos 9 e 10, no entanto, enquanto os peixes de controle permanecem muito próximos do estímulo social, o álcool tratado não é; Isso sugere que a exposição embrionária ao etanol afeta o comportamento social adulto12,18.
A Figura 3 foi modificada de Fernandes et al.17 e usa dados coletados da medição da distância até o estímulo para mostrar ainda mais o efeito que a exposição embrionária ao etanol tem na resposta de cardume. Os dados da Figura 3 representam a redução da distância em direção ao estímulo social, uma vez que ele é visível. Calcular a redução média da distância ao estímulo; A distância média até o estímulo durante o período de estímulo (quando o estímulo é visível) foi subtraída da distância média até o estímulo durante a habituação (quando o estímulo social não é visível), portanto, um valor negativo maior representa uma resposta social mais forte.
A Figura 4 mostra o tempo gasto nas zonas versus a distância até o estímulo. A Figura 4 foi modificada de Fernandes et al.17. A Figura 4A mostra a quantidade de tempo (eixo Y) que os peixes passam em cada zona (eixo X) enquanto o estímulo é visível. Enquanto os peixes de todos os grupos parecem mostrar uma preferência pela zona mais próxima do estímulo social, os peixes de controle passam quase o dobro do tempo na zona 1 em comparação com os peixes tratados com álcool (Figura 4B). A Figura 4C mostra que a exposição embrionária ao etanol não prejudicou a mobilidade, uma vez que não houve diferença entre os grupos entre as zonas. Finalmente, a Figura 4D mostra que, na ausência de um estímulo social, os peixes não passam tempo na zona mais próxima do estímulo social. Assim, os resultados mostram que os peixes controle se aproximam e ficam muito próximos do estímulo social quando visíveis, enquanto os peixes tratados com etanol não. Além disso, os dados mostrados na Figura 2 e na Figura 4C sugerem que a exposição embrionária ao etanol não prejudica a capacidade dos peixes de ver o estímulo social (Figura 2) ou se mover (Figura 4C), fornecendo, portanto, fortes evidências de que a exposição embrionária ao etanol prejudica o comportamento social em peixes-zebra adultos.
Figura 1: Esquema do aparelho comportamental. Um tanque de 37 L foi utilizado para testar o comportamento social de peixes-zebra adultos (denominados ZT140) com e sem exposição embrionária ao etanol. Essa figura foi modificada a partir de Fernandes et al.17. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: A exposição embrionária ao etanol embota o comportamento social em peixes-zebra adultos. Distância média entre o peixe experimental adulto e o cardume vivo plotado para intervalos de 1 min da sessão comportamental de 20 min. Média ± SEM são mostrados. Controle (n = 12); etanol a 1% (EtOH; n = 11). A barra horizontal acima do eixo X, de 10 a 20 min, mostra uma linha do tempo durante a qual o cardume ao vivo é visível para os sujeitos experimentais. A concentração de álcool é mostrada acima dos gráficos. Essa figura foi modificada a partir de Fernandes et al.17. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Os peixes tratados com álcool estão significativamente mais longe do cardume vivo. As barras representam a diferença entre a distância dos peixes do cardume vivo antes e depois que o cardume vivo é visível. Valores negativos maiores sugerem uma resposta mais forte aos coespecíficos. Média ± SEM são mostrados. Média ± SEM são mostrados. Controle (n = 12); etanol a 1% (EtOH; n = 11). Essa figura foi modificada a partir de Fernandes et al.17. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: A exposição embrionária ao etanol altera a duração do tempo gasto na zona 1 apenas quando o cardume vivo é visível. (A) As barras representam o tempo gasto em todas as 10 zonas durante a apresentação do estímulo. (B) As barras representam o tempo gasto na zona 1 durante a apresentação do estímulo. A zona 1 é a zona mais próxima do cardume ativo, enquanto a zona 10 é a mais distante do cardume vivo. Observe a diferença significativa na quantidade de tempo que os peixes de controle de peixes passam na zona. (C) As barras representam a porcentagem média de tempo gasto em todas as zonas durante a habituação, os primeiros 10 min. (D) As barras representam o tempo gasto na zona 1 durante a habituação. Média ± SEM são mostrados. Os tamanhos das amostras são os seguintes: Controle (n = 12); etanol (EtOH; n = 11). Essa figura foi modificada a partir de Fernandes et al.17. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Discussão
O peixe-zebra possui uma série de características biológicas e comportamentais, tornando-o um organismo altamente atraente para pesquisas envolvendo genes, meio ambiente e comportamento 5,19. Este protocolo fornece ao usuário final um guia relativamente simples para testar o comportamento social, várias maneiras de quantificar o comportamento social e tem o potencial de vincular as respostas comportamentais de peixes individuais a tratamentos como exposição embrionária ao etanol, mutações genéticas ou outras substâncias farmacológicas.
Para testar cuidadosamente o comportamento social em peixes-zebra adultos, siga cuidadosamente este protocolo em conjunto com o manual do usuário do software de rastreamento de sua escolha. Para construir a arena de testes, basta um tanque de 37 L com tampa e plástico corrugado leve, dois tanques menores para o estímulo social e uma câmera; A maioria desses itens pode ser comprada em lojas de animais e em qualquer grande varejista. Quando um único peixe-zebra é apresentado a um grupo de peixes-zebra, o comportamento natural do único peixe-zebra é reduzir a distância até o grupo enquanto aumenta o tempo gasto nas proximidades do grupo19, esse comportamento é chamado de resposta de cardume19. A resposta de cardume é um comportamento social que pode ser caracterizado de duas maneiras: primeiro, quando o estímulo social é visível, meça a distância entre o estímulo social e o único peixe12 e, segundo, meça o tempo gasto na zona mais próxima do estímulo social quando ele é visível. Ter a capacidade de quantificar o tempo que o peixe-zebra passa em uma zona de 5 cm quando o estímulo social é visível fornece fortes evidências da resposta social, uma vez que esses peixes têm, em média, aproximadamente 4 cm de comprimento.
Dividir o tanque de 50 cm em áreas de 10,5 cm auxilia na análise estatística porque a probabilidade de o peixe de teste estar em qualquer zona é a mesma. À primeira vista, ter duas medidas para o mesmo resultado parece ser redundante. No entanto, a redundância pode fornecer validação. Além disso, as medidas de distância e duração durante a habituação podem ser usadas para determinar se um tratamento afeta a visão ou o movimento. Este protocolo utilizou software de rastreamento automatizado disponível comercialmente13,18 mas é passível de outros sistemas de rastreamento ou mesmo de rastreamento manual por um observador treinado.
Independentemente do software de rastreamento usado, existem etapas críticas a serem seguidas para otimizar o rastreamento. Primeiro, selecione um plano de fundo que forneça um contraste significativo em comparação com os peixes que estão sendo gravados. O peixe-zebra do tipo selvagem tem listras horizontais douradas e azuis20; Eles também têm mosaicos de xantóforos amarelos, iridóforos prateados ou azuis e melanóforos pretos20. Assim, ao caracterizar o comportamento de peixes selvagens AB usar um fundo branco 12,13,17, por outro lado, ao caracterizar o comportamento social de um peixe-zebra casper que não possui pigmento usar um fundo preto17. Em segundo lugar, certifique-se de que haja iluminação suficiente para rastrear os peixes experimentais. Se houver várias arenas de rastreamento, certifique-se de que a iluminação seja idêntica entre as arenas. Outro passo crítico é garantir que o nível da água no tanque de 37 L corresponda ao nível da água nos tanques de 1,4 L, para garantir que os peixes de teste não possam nadar em áreas que não tenham o estímulo social. Além disso, certifique-se de que o tanque de 1.4 L esteja no quadro, ao gravar os vídeos; Isso fornecerá um backup caso seja necessária a codificação manual dos dados ou a verificação do lado do estímulo.
Problemas típicos dentro do protocolo são o assunto não ser rastreado corretamente, um período de habituação insuficiente e um breve intervalo de tempo ao puxar as barreiras opacas quando várias arenas são montadas. Para evitar que o assunto não seja rastreado corretamente, certifique-se de que haja contraste suficiente entre o peixe e o fundo, conforme mencionado anteriormente, e que as diretrizes do software sejam seguidas. Além disso, se o software do usuário permitir o rastreamento infravermelho, isso pode aliviar os problemas associados ao contraste. Embora 10 minutos possam parecer muito tempo para um período de habituação, nosso trabalho não publicado sugere que reduzir o tempo de habituação afeta negativamente o protocolo. Finalmente, se a barreira opaca entre os tanques de 37 L e 1,4 L for puxada manualmente e se várias arenas forem montadas, todas as barreiras não poderão ser puxadas exatamente ao mesmo tempo, a menos que várias pessoas estejam puxando as barreiras. Alternativamente, se apenas uma pessoa estiver conduzindo o ensaio, então o contrapeso de quais barreiras de arena são puxadas primeiro deve ser implementado.
Embora o protocolo seja direto, o custo do software de rastreamento e o tempo extra necessário para caracterizar os peixes individualmente são armadilhas potenciais. Este protocolo usou software disponível comercialmente para rastrear o comportamento de peixes experimentais, o que evita o viés do observador e aumenta o rendimento ao configurar várias arenas e, assim, registrar vários peixes. Embora o software comercial tenha sido usado neste protocolo, outro software de rastreamento está disponível, incluindo software livre. O uso deste protocolo com o rastreamento de escolha do usuário final reproduzirá o ensaio social. Neste protocolo foi caracterizado o comportamento de um peixe individual; Outros se concentraram em examinar grupos de peixe-zebra14 , que é uma maneira de abordar a armadilha potencial de caracterizar um peixe de cada vez. Como alternativa, como mencionado anteriormente, o uso de várias arenas de teste ao mesmo tempo pode aumentar o rendimento, mantendo a capacidade de atribuir um perfil comportamental a um peixe individual. Manter a capacidade de correlacionar um perfil comportamental de um peixe individual é importante porque dá ao pesquisador a oportunidade de procurar variabilidade dentro de um grupo de tratamento. Embora a exposição embrionária ao etanol tenha sido usada como variável independente nos dados representativos, as aplicações futuras da técnica descrita no protocolo atual não se limitam a simplesmente caracterizar os efeitos da exposição embrionária ao etanol no comportamento social. Por exemplo, pode-se determinar o efeito que as mutações genéticas21 ou outros tratamentos farmacológicos22 têm no comportamento social. Além disso, além da exposição embrionária ao etanol, trabalhos futuros podem caracterizar o efeito que outros teratógenos têm no comportamento social. Assim, o protocolo atual é útil para qualquer pesquisador interessado em entender como os genes e/ou o ambiente afetam o comportamento social.
Divulgações
Os autores não têm nada a divulgar.
Agradecimentos
O financiamento para apoiar esta pesquisa foi fornecido pelos Institutos Nacionais de Saúde (NIH) / Instituto Nacional de Abuso de Álcool (NIAAA) [R00AA027567] para YF
Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Tanques de Aquaneering ZT140 de 1.4-l Aquaneering | ZT140 | Tanques para estímulo social | |
| Luz de aquário fluorescente Deluxe Full Hood Aqueon 20" | https://www.petco.com/shop/en/petcostore/product/aqueon-aquarium-black-24-fluorescent-deluxe-full-hood-215740 | Luz para o tanque de 37-I | |
| Tanque de aquário de vidro aberto padrão Aqueon, tanque de 10 galões | https://www.petco.com/shop/en/petcostore/product/aga-10g-20x10x12bk-tank-170917 | tanque de 37-l para o ensaio social | |
| Etanol | Fisher Scienticfic | ||
| Sistema de rastreamento Ethovision XT | https://www.noldus.com/ethovision-xt | ||
| Câmera GigE Color Basler R-Capable | https://www.noldus.com/ethovision-xt | ||
| Plástico corrugado branco | Plástico para forrar a parte de trás e o fundo do tanque 37-I e a parte de trás dos tanques usados para o estímulo social |
Referências
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Reimpressões e permissões
