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Artigo de método

Geração de itenócitos derivados de células-tronco pluripotentes induzidos via superexpressão combinada de escleraxis e tensão uniaxial 2D

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DOI:

10.3791/65837

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1 de março de 2024

 ,  , 
1Orthopaedic Stem Cell Research Laboratory, Cedars-Sinai Medical Center, 2Board of Governors Regenerative Medicine Institute, Cedars-Sinai Medical Center, 3Department of Biomedical Sciences, Cedars-Sinai Medical Center, 4Department of Orthopedics, Cedars-Sinai Medical Center, 5Department of Surgery, Cedars-Sinai Medical Center

Neste artigo

Resumo

Este artigo descreve um procedimento para produzir iTenócitos gerando células estromais mesenquimais derivadas de iPSC com superexpressão combinada de Scleraxis usando um vetor lentiviral e estiramento uniaxial através de um biorreator 2D.

Resumo

Os desafios atuais no reparo de tendões e ligamentos requerem a identificação de um candidato adequado e eficaz para a terapia baseada em células para promover a regeneração tendínea. Células estromais mesenquimais (CTMs) têm sido exploradas como uma potencial estratégia de engenharia tecidual para reparo tendíneo. Embora sejam multipotentes e tenham potencial regenerativo in vivo, são limitados em sua capacidade de autorrenovação e exibem heterogeneidade fenotípica. As células-tronco pluripotentes induzidas (iPSCs) podem contornar essas limitações devido à sua alta capacidade de autorrenovação e plasticidade de desenvolvimento incomparável. No desenvolvimento de tenócitos, a Scleraxis (Scx) é um regulador molecular direto crucial da diferenciação tendínea. Além disso, a mecanoregulação tem se mostrado um elemento central que orienta o desenvolvimento e a cicatrização do tendão embrionário. Como tal, desenvolvemos um protocolo para encapsular o efeito sinérgico da estimulação biológica e mecânica que pode ser essencial para a geração de tenócitos. As iPSCs foram induzidas a se tornarem células estromais mesenquimais (iMSCs) e foram caracterizadas com marcadores clássicos de células estromais mesenquimais via citometria de fluxo. Em seguida, usando um vetor lentiviral, as iMSCs foram transduzidas para SCX superexpressas estavelmente (iMSCSCX+). Essas célulasiMSC SCX+ podem ser posteriormente amadurecidas em iTenócitos via carga de tração uniaxial usando um biorreator 2D. As células resultantes foram caracterizadas observando-se a suprarregulação dos marcadores tendinosos precoce e tardio, bem como a deposição de colágeno. Este método de geração de iTenócitos pode ser usado para auxiliar os pesquisadores no desenvolvimento de uma fonte alogênica alogênica potencialmente ilimitada para aplicações de terapia celular de tendão.

Introdução

Para resolver as questões contemporâneas no reparo de tendões e ligamentos, há um requisito para um candidato celular pertinente adequado para terapias baseadas em células. Uma via de investigação em engenharia tecidual para reparo tendíneo envolve a exploração de células estromais mesenquimais derivadas da medula óssea (CTMs-MO) e células estromais derivadas do tecido adiposo (CTAs) como estratégias potenciais. Essas células têm capacidade multipotente, grande abundância e potencial regenerativo in vivo. Além disso, demonstraram maior capacidade de cicatrização e melhora dos resultados funcionais em modelos animais1. No entanto, essas células exibem capacidades restritas de auto-renovação, diversidade fenotípica e, notadamente, capacidade limitada de formação de tendões. A tecnologia de células-tronco pluripotentes induzidas (iPSC) oferece uma solução para essas restrições devido à sua notável capacidade de auto-renovação e adaptabilidade de desenvolvimento incomparável. Nossa equipe de pesquisa e outros conseguiram diferenciar com sucesso as iPSCs em entidades mesenquimais estromais semelhantes a células (iMSCs)2,3. Como tal, as iMSCs têm o potencial de ser uma fonte alogênica para aplicações de terapia com células tendíneas.

A escleraxis (SCX) é um fator de transcrição essencial para o desenvolvimento tendíneo e é considerada o marcador detectável mais precoce para tenócitos diferenciados. Além disso, a SCX ativa marcadores de diferenciação tendínea a jusante, incluindo colágeno tipo 1a1 (COL1a1), moicano (MKX) e tenomodulina (TNMD), entre outros 4,5,6. Outros genes expressos durante a maturação tendínea incluem o membro 3 da família de proteínas promotoras da polimerização da tubulina (TPPP3) e o receptor alfa do fator de crescimento derivado de plaquetas (PDGFRa)7. Embora esses genes sejam essenciais para o desenvolvimento e maturação tendínea, infelizmente não são exclusivos do tecido tendíneo e são expressos em outros tecidos musculoesqueléticos, como osso oucartilagem5,7.

Além da expressão de marcadores durante o desenvolvimento tendíneo, a mecanoestimulação é um elemento essencial para o desenvolvimento e cicatrização do tendão embrionário 4,5,6. Os tendões são mecanoresponsivos e seus padrões de crescimento mudam em resposta ao ambiente. Em nível molecular, pistas biomecânicas afetam o desenvolvimento, maturação, manutenção e respostas cicatriciais dos tenócitos8. Vários sistemas de biorreatores têm sido utilizados para modelar cargas fisiológicas e pistas biomecânicas. Alguns desses sistemas modelo incluem carregamento tecidual ex vivo, sistemas de carregamento de células 2D aplicando tensão biaxial ou uniaxial e sistemas 3D usando scaffolds e hidrogéis 9,10. Os sistemas 2D são vantajosos quando se estudam os efeitos da estimulação mecânica sobre genes tendão-específicos ou a morfologia das células no contexto do destino celular, enquanto sistemas 3D podem replicar com mais precisão as interações célula-MEC 9,10.

Em sistemas de carregamento 2D, a deformação entre as células e o substrato de cultura é homogênea, o que significa que a carga aplicada no citoesqueleto das células pode ser totalmente controlada. Em comparação com a carga biaxial, a carga uniaxial é fisiologicamente mais relevante, uma vez que os tenócitos são predominantemente submetidos à carga uniaxial dos feixes de colágeno in vivo9. Verifica-se que, durante as atividades diárias, os tendões são submetidos a cargas uniaxiais de tração de até 6%de deformação11. Especificamente, estudos prévios verificaram que a carga dentro das faixas fisiológicas de 4%-5% demonstrou promover diferenciação tenogênica ao preservar a expressão de marcadores relacionados ao tendão como SCX e TNMD, bem como aumentar a produção de colágeno 9,10. Cepas acima de 10% podem ser traumaticamente relevantes, mas não fisiologicamente relevantes12,13.

Aqui, é apresentado um protocolo que leva em consideração o efeito sinérgico da estimulação mecânica e biológica que pode ser essencial para a geração de tenócitos. Inicialmente, descrevemos um método reprodutível para induzir iPSCs em iMSCs via exposição de curto prazo de corpos embrionários a fatores de crescimento, confirmado por marcadores de superfície de CTM usando citometria de fluxo. Em seguida, detalhamos um método de transdução lentiviral para projetar iMSCs para ter superexpressão estável de SCX (iMSCSCX+). Para maior maturação celular, as iMSCSCX+ são semeadas em placas de silicone revestidas com fibronectina e submetidas a um protocolo de tensão uniaxial otimizado usando o biorreator CellScale MCFX. O potencial tenogênico foi confirmado pela observação da suprarregulação de marcadores tendinosos precoces e tardios, bem como da deposição de colágeno14. Este método de geração de iTenócitos é uma prova de conceito que pode oferecer uma fonte alogênica ilimitada para aplicações de terapia celular de tendão.

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Protocolo

Este protocolo de produção de iTenócitos pode ser realizado em três etapas principais: iPSCs para iMSCs (10 dias), iMSC para iMSCSCX+ (2 semanas), iMSCSCX+ para iTenócitos (mínimo 4 dias). Cada etapa principal do protocolo pode ser pausada e reiniciada posteriormente, dependendo do cronograma experimental. Para os métodos envolvidos com a cultura de células, técnicas estéreis devem ser empregadas. Todas as células deste protocolo devem ser cultivadas a 37 °C, 5% CO2 e 95% de umidade.

1. Indução humana de iPSC em células estromais mesenquimais induzidas (iMSCs)

  1. Preparação do experimento
    1. Preparar o meio Iscove's Modified Dulbecco's Medium - Embryoid Bodies (IMDM-EB).
      1. Suplemente 50 mL de meio basal IMDM com 8,5 mL de reposição sérica knock-out, 500 μL de aminoácidos não essenciais Minimal Essential Medium (MEM), 0,385 μL (estoque de 110 mM) de beta-mercaptoetanol e 500 μL de solução antibiótico-antimicótica (AAS) (concentrações finais: 17%, 1%, 110 μM, 1%, respectivamente) (ver Tabela de Materiais).
    2. Preparar meios de células estromais mesenquimais (CTM).
      1. Suplemento 440 mL de meio Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) com 50 mL de soro fetal bovino (FBS), 5 mL de solução antibiótico-antimicótica (AAS) e 5 mL de L-glutamina (concentrações finais: 10%, 1%, 2 mM, respectivamente).
    3. Preparar placas revestidas de poli(2-hidroxietil metacrilato) (poli-HEMA).
      1. Adicione 10 g do poli-HEMA (ver Tabela de Materiais) a um frasco estéril.
      2. Adicione um agitador magnético ao frasco e, enquanto agita, adicione lentamente 500 mL de EtOH 95%.
      3. Uma vez que todo o EtOH tenha sido adicionado, ligue o modo de agitação a 1200 rpm com calor baixo adicional por pelo menos 6 h. A solução de poli-HEMA pode ser armazenada à temperatura ambiente por até um ano.
      4. Em condições estéreis, adicionar 2,5 μg/cm2 em 9 mL a um balão T75. Ajustar o volume de acordo com o tamanho do recipiente de cultura.
      5. Mantendo a esterilidade, deixe os recipientes secarem ao ar para que o EtOH evapore completamente antes do uso. Isso geralmente leva 24-72 h.
    4. Preparar frascos revestidos com gelatina.
      1. Lave um frasco de vidro com NaOH e dedique-o à preparação da gelatina. Não use detergente.
      2. Preparar solução de gelatina a 1% (5 g de gelatina e 500 ml de água isenta de endotoxinas). Autoclave o frasco de vidro com a solução de gelatina por 30 min.
      3. Deixe a solução de gelatina esfriar e ela pode ser armazenada à temperatura ambiente.
      4. Cobrir um frasco T75 com 5 mL de solução de gelatina por frasco e incubar por pelo menos 1 h antes da semeadura das células. Frascos revestidos com gelatina podem ser preparados com 1 dia de antecedência.
    5. Prepare o tampão de classificação de células ativadas por fluorescência (FACS).
      1. Misturar PBS com albumina de soro bovino a 2% e azida sódica a 0,1%. Conservar a 4 °C.
  2. Geração de corpos embrionários (EBs)
    NOTA: As iPSCs devem ser cultivadas em uma placa de 6 poços e devem atingir 70%-80% de confluência antes do uso.
    1. No dia 0, levar uma placa de PCR de fundo transparente 384 no capuz de cultura de tecidos e UV por 15 minutos sem tampa.
    2. Retire o meio de crescimento das iPSCs (consulte Tabela de Materiais) e lave os poços com PBS.
    3. Adicionar 0,5 ml de reagente de dissociação celular suave pré-aquecido (ver Tabela de Materiais) a cada poço e incubar durante 5 minutos a 37 °C. Observe as células a cada 5 min até que as iPSCs se tornem células únicas ou pequenos agregados levantados em suspensão.
    4. Ressuspendeu a suspensão celular com uma pipeta de 1 mL para garantir uma suspensão de célula única.
    5. Centrifugar as células a 300 x g durante 5 minutos à temperatura ambiente.
    6. Remover o sobrenadante, ressuspender em meio IMDM-EB (passo 1.1.1) e contar as células viáveis usando um hemocitômetro ou um contador de células.
    7. Calcular o volume apropriado de suspensão celular necessário para atingir 5.000-25.000 células por poço da placa de 384 poços com 25 μL de suspensão celular por poço.
      NOTA: Geralmente, 2-3 poços confluentes (70%-80%) de uma placa de 6 poços podem fazer EBs em uma placa de 384 poços. O tamanho das células por EB será determinado empiricamente. Para uma placa inteira de 384 poços, devem ser usados 9,6 mL de suspensão celular, 25 μL por poço.
    8. Centrifugar as células novamente a 300 x g durante 5 minutos à temperatura ambiente.
    9. Remover o sobrenadante e ressuspender as células num volume adequado de meio IMDM-EB e 10 μM de dicloridrato de Y-27632 (stock: 10 mM, 1000x, ver Tabela de Materiais) num tubo cónico pré-refrigerado de 15 ml.
    10. Adicione a matriz da membrana basal solubilizada a frio (1 mg por placa de 384 poços de EBs) ao cônico (ver Tabela de Materiais).
    11. Distribuir 25 μL da suspensão celular para cada poço. Coloque uma tampa estéril sobre a placa e gire a 450 x g a 4 °C durante 7 min. Incubar a 37 °C durante 48 h.
    12. No dia 2, transferir as células para uma placa de 100 mm com 3 mL de meio IMDM-EB pré-aquecido.
    13. Transferir os EBs para frascos T75 revestidos com poli-HEMA com 10 mL de IMDM-EB. Ajustar o volume de acordo com o tamanho do recipiente de cultura. Deixe os EBs crescerem por 3 dias.
    14. No 5º dia, transferir os EBs para frascos T75 preparados revestidos com gelatina com 10 mL de meio IMDM-EB. Ajustar o volume de acordo com o tamanho do recipiente de cultura. Crescer os EBs por mais 3 dias em suspensão.
    15. No dia 8, certifique-se de que dois tipos de EBs sejam observados: EBs que estão aderidos ao frasco e EBs não aderidos. Lave os EBs não conectados do frasco com PBS.
    16. Aos EBs anexados, adicione o meio IMDM-EB suplementado com TGFβ-1 (10 ng/mL) (ver Tabela de Materiais) e deixe-os crescer por 2 dias.
    17. No dia 10, troque o meio para o meio MSC. As células devem ser alimentadas duas vezes por semana. Uma vez 70% confluentes, prossiga para o "Protocolo de células de elevação padrão" para replacar células. Replaquear as células em placas revestidas com gelatina.
  3. Protocolo padrão de células de elevação
    1. Uma vez que as células aderentes tenham atingido 70% de confluência, aspirar o meio de crescimento das placas e lavar com PBS.
    2. Levantar as células adicionando 5 mL de tripsina 0,25% pré-aquecida a cada placa de 150 mm e incubar por 5 min a 37 °C. Ajustar o volume de tripsina de acordo com o tamanho do vaso de cultura.
    3. Sob um microscópio, verifique se a maioria das células foi retirada de cada placa. Se ainda houver células conectadas, toque suavemente nas laterais das placas para desalojar as células.
    4. Coletar as células em um tubo cônico adicionando o dobro do volume do meio de crescimento pré-aquecido.
    5. Centrifugar as células à temperatura ambiente durante 5 min a 300 x g. Remova o sobrenadante e prossiga para as próximas etapas.
  4. Avaliação por citometria de fluxo para expressão de marcadores de CTM
    NOTA: CTMs humanas, como CTMs de medula óssea, devem ser usadas como controle positivo.
    1. Execute o "Protocolo de células de elevação padrão" (etapa 1.3).
    2. Ressuspender o sobrenadante com 3 mL de tampão FACS e transferir todo o volume para tubos FACS.
    3. Centrifugar à temperatura ambiente durante 5 min a 300 x g. Repita a etapa de lavagem com o tampão FACS mais duas vezes.
    4. Para os tubos corados, adicione 2 μL de CD90-FITC anti-humano de ratinho, CD44-APC anti-humano de ratinho e CD105-PE anti-humano (ver Tabela de Materiais) e incube durante 45 minutos a 4 °C.
    5. Aos tubos de controle do isotipo, adicionar 20 μL de IgG2a-FITC de camundongo, IgG1-PB de camundongo e IgG1-PE de camundongo (ver Tabela de Materiais).
    6. Incubar no escuro a 4 °C durante 15 minutos. Lavar todos os tubos adicionando 3 mL de tampão FACS e centrifugando por 5 min a 300 x g (à temperatura ambiente). Ressuspender as células em 250 μL de tampão FACS para cada tubo.
    7. Analisar a expressão dos marcadores de superfície das CTMs por meio da citometria de fluxo14. Os comprimentos de onda de excitação e emissão devem ser: CD90-FITC, pico de excitação em 495 nm e pico de emissão em 519 nm; CD44-APC, pico de excitação em 640 e pico de emissão em 660 nm; CD105-PE, pico de excitação a 561 nm e pico de emissão a 574 nm.

2. Passagem e expansão do iMSC

  1. Preparação de reagentes
    1. Prepare a mídia de congelamento MSC.
      1. Combinar 30 mL de DMEM de baixa glicose, 5 mL de DMSO e 15 mL de FBS (concentrações finais: 60%, 10%, 30%, respectivamente.)
      2. Filtrar a solução utilizando um filtro estéril de 0,45 μm. Conservar a 4 °C.
  2. Passagem
    NOTA: Após a indução, as iMSCs devem ser cultivadas em placas revestidas com gelatina por mais 2 passagens antes de serem desmamadas para crescer em placas de cultura de tecidos plásticos. Além disso, as células devem ser passadas com uma razão de divisão de 1:3 quando 70% confluentes.
    1. Execute o "Protocolo de células de elevação padrão" (etapa 1.3).
    2. Ressuspender as células em meio MSC e distribuir igualmente as células em três novas placas de 150 mm de frascos T175 com 20 mL de meio por frasco. Retorne as células a 37 °C.
    3. Alimente as células duas vezes por semana, substituindo o meio de crescimento por meio MSC pré-aquecido.
  3. Congelação
    1. Execute o "Protocolo de células de elevação padrão".
    2. Ressuspender as células em 1 mL de meio de congelamento MSC. Adicionar o 1 ml de suspensão celular a um criovial e conservar num recipiente de congelação durante 24 h a -80 °C antes de transferir para azoto líquido para armazenamento a longo prazo.
  4. Descongelar
    1. Preparar 10 mL de meio MSC pré-aquecido em um tubo cônico de 15 mL.
    2. Recupere o criovial, mergulhe-o em banho-maria a 37 °C e gire até que uma bola de gelo do tamanho de uma ervilha permaneça (aproximadamente 1-2 min).
    3. Na capa de cultura celular, adicione lentamente 1 mL do meio pré-aquecido ao criovial e pipete para cima e para baixo para misturar.
    4. Transferir a suspensão celular do criovial para o tubo cônico preparado de 15 mL com meio pré-aquecido e centrifugar por 5 min a 300 x g (à temperatura ambiente).
    5. Retire o sobrenadante e ressuspenda com meio fresco. Adicionar a suspensão celular a uma placa de 150 mm com um volume total de 20 ml. Ajustar o volume de acordo com o tamanho do frasco de cultura.
    6. Incubar as células a 37 °C até estarem prontas para se dividirem.

3. Engenharia genética de iMSCs para superexpressar SCX usando transdução lentiviral

Observação : esta seção do protocolo leva duas semanas para ser concluída.

  1. Preparação de meios e reagentes
    1. Preparar mídia celular HEK293T/17.
      1. Suplemento de 445 mL de Meio Essencial Mínimo de Eagle (EMEM) com 50 mL de FBS e 5 mL de EAA (concentrações finais: 10%, 1%, respectivamente).
    2. Preparar mídia de embalagem de lenti MSC.
      1. Preparar o soro inativado pelo calor aquecendo 50 mL de FBS à temperatura ambiente em banho-maria de 60 °C por 30 min.
      2. Combinar 445 mL de DMEM de baixa glicose com o FBS inativado pelo calor e 5 mL de L-glutamina (concentrações finais: 10%, 2 mM, respectivamente.)
    3. Preparar complexo de transfecção.
      1. Permitir que componentes complexos de transfecção (ver Tabela de Materiais) descongelem no gelo: plasmídeos de embalagem VSV-G e Delta, plasmídeo SCX e BioT15,16.
      2. Vórtice suavemente e gire para baixo os plasmídeos. Medir as concentrações de DNA.
      3. Com base nas concentrações de DNA e no número de frascos destinados à transfecção, calcular o volume de cada componente necessário: para um frasco T75, o complexo de transfecção consistirá de 750 μL de meio livre de soro (como DMEM ou PBS sem soro), 7,5 μg de plasmídeo SCX, 0,75 μg de plasmídeo VSV-G, 6,75 μg de plasmídeo Delta e 22,5 μL de BioT. Considere extra para erro de pipetagem.
      4. Misture pipetando suavemente para cima e para baixo. Gire brevemente em uma centrífuga. Incubar à temperatura ambiente durante 15 minutos e utilizar imediatamente.
  2. Transfecção e produção de lentivirais
    ATENÇÃO: A partir do dia 3, o protocolo envolve o trabalho com lentivírus e, portanto, o trabalho deve ser realizado usando procedimentos operacionais de nível de contenção 2+. Os trabalhadores devem usar equipamentos de proteção individual, incluindo duas camadas de luvas, coberturas de pulso, óculos de segurança, máscara e calças compridas e sapatos fechados. Todos os resíduos e materiais, incluindo pontas de pipetas, frascos e meio líquido, devem ser descontaminados com água sanitária (hipoclorito de sódio final a 1%) por pelo menos 20 min. Não use o vácuo.
    1. Sementes HEK293T/17 células.
      1. Aproximadamente 18-24 h antes da transfecção (dia 0), levantar e plaquear as células 293T em frascos T75. Os volumes seguintes assumem T75 como o vaso de cultura. Ajustar o volume de acordo com o vaso de cultura celular utilizado.
      2. Retire o meio de cultura dos frascos e lave com 5 mL de PBS.
        NOTA: As células levantam-se facilmente da superfície do frasco. Adicionar PBS ao lado do balão e evitar a adição directa de solução às células.
      3. Adicionar 3 mL de tripsina 0,25% pré-aquecida a cada frasco e incubar a 37 °C por 5 min. Recolher as células num tubo cónico e centrifugar à temperatura ambiente durante 5 minutos a 300 x g.
      4. Remova o sobrenadante, ressuspenda em meio 293T e conte as células viáveis usando um hemocitômetro ou um contador de células.
      5. Plaquear as células a 5,3 x 104 células/cm2 e incubar a 37 °C durante a noite.
      6. No dia seguinte (dia 1), prepare o complexo de transfecção. Substitua o meio de crescimento das células por 5 ml de meio de embalagem de lenti MSC pré-aquecido (passo 3.1.2).
      7. Adicione o complexo de transfecção gota a gota às células. Incline suavemente o prato para garantir a exposição uniforme do complexo de transfecção às células. Retornar as células à incubadora por 48 h.
        NOTA: A toxicidade deve ser observada após 24 h (dia 2).
      8. Após 48 h (dia 3), coletar cuidadosamente o meio contendo vírus em um tubo cônico separado usando uma pipeta e centrifugar por 5 min a 300 x g (à temperatura ambiente).
      9. Adicionar 5 mL de meio de embalagem de lente MSC pré-aquecido ao frasco T75 de células 293T e retornar à incubadora durante a noite.
      10. Após a centrifugação, filtrar o sobrenadante com um filtro estéril de 0,45 μm pipetando diretamente o sobrenadante através do filtro. Conservar o meio contendo vírus a 4 °C durante a noite.
      11. Após mais 24 h (dia 4), mais uma vez coletar cuidadosamente o meio contendo vírus em um tubo cônico separado usando uma pipeta e centrifugar por 5 min a 300 x g (à temperatura ambiente).
      12. Combine o vírus com o vírus do dia de coleta anterior e misture para garantir uma solução homogênea. Neste ponto, o protocolo pode ser pausado e reiniciado posteriormente, dependendo do cronograma experimental. O lentivírus pode ser aliquotado e congelado a -80 °C, ou o lentivírus pode ser armazenado no gelo enquanto se procede com a "Transdução de iMSCs com SCX" (passo 3.3).
        NOTA: Uma vez que as alíquotas de lentivírus são congeladas e descongeladas, não congele novamente.
  3. Transdução de iMSCs com SCX
    1. Realizar transdução da placa de titulação.
      1. No dia 0, realize o "Protocolo padrão de células de elevação".
      2. Ressuspender as células em meio MSC e contar as células viáveis usando um hemocitômetro ou um contador de células.
      3. Em uma placa de 6 poços, adicione 4 x 103 células/cm2. Replaquear o restante em uma placa extra de 150 mm com 20 mL de meio MSC (esta será a placa controle). Incubar as células durante 24 h a 37 °C.
      4. No dia seguinte (dia 1), as células devem estar ~40% confluentes. Pré-aquecer o meio de crescimento da embalagem de lente e descongelar o polibreno e aproximadamente 3 mL de lentivírus no gelo (ou, se feito no mesmo dia da coleta do vírus, armazenar no gelo até o uso).
      5. Adicionar meio de crescimento de lenti e lentivírus aos poços com base nos títulos desejados (ou seja, 12,5%, 25%, 50%, 75%, 100%). Adicionar 0,5 μL de polibreno para atingir uma concentração final de 5 μg/ml (concentração de reserva: 10 mg/ml, ver Tabela de Materiais).
      6. Gire a placa ao redor para garantir uma exposição uniforme a todas as células. Retornar a placa à incubadora a 37 °C por 48 h.
    2. Avaliar a eficiência do título de lentivírus SCX com citometria de fluxo.
      1. Após 48 h, realizar o "Protocolo de células de elevação padrão".
      2. Ressuspender as células em PBS e contar as células viáveis usando um hemocitômetro ou contador de células. Centrifugar as células à temperatura ambiente durante 5 min a 300 x g.
      3. Retire o sobrenadante e ressuspenda-o em 3 mL de tampão FACS para lavar. Transfira a suspensão celular para tubos de citometria de fluxo e centrifuga por 5 min a 300 x g.
      4. Repetir a lavagem do tampão FACS mais duas vezes e ressuspender os pellets de célula final em 300 μL de tampão FACS. Avaliar a expressão de GFP para cada título usando uma máquina de citometria de fluxo.
      5. Com base nos títulos e contagens de viabilidade celular, determinar o título de lentivírus apropriado para prosseguir com a transdução. Neste ponto, o protocolo pode ser pausado e reiniciado posteriormente, dependendo do cronograma experimental.
    3. Realizar transdução SCX em larga escala.
      NOTA: Os volumes listados são por placa de 1x 150 mm ou 1x frasco T175. Isso pode ser ajustado de acordo com o tamanho desejado do vaso e a escala de transdução.
      1. No dia 0, realize o "Protocolo padrão de células de elevação".
      2. Ressuspender as células em meio MSC e contar as células viáveis usando um hemocitômetro ou um contador de células. Semeando as células a 4 x 103 células/cm2. Incubar as células durante 24 h a 37 °C.
      3. No dia seguinte (dia 1), as células devem estar ~40% confluentes. Pré-aqueça o meio de crescimento da embalagem de lente e descongele o polibreno e a quantidade pré-calculada de lentivírus no gelo.
      4. Com base no título decidido, adicione a quantidade desejada de meio de crescimento de lenti e lentivírus aos poços. Adicionar 5 μg/mL de polibreno (concentração estoque: 10 mg/mL).
      5. No dia 3, observar as células em microscópio fluorescente. O iMSCSCX+ recém-produzido deve fluorescer GFP. Substitua o meio contendo vírus por mídia MSC pré-aquecida. Neste ponto, o protocolo pode ser pausado e reiniciado posteriormente, dependendo do cronograma experimental.

4. Passagem e expansão do iMSCSCX+

  1. Execute a passagem, expansão, congelamento e descongelamento do iMSCSCX+ seguindo o mesmo que para iMSCs, conforme descrito na etapa 2 do protocolo.

5. Carregamento mecânico

NOTA: Esta seção leva um mínimo de 4 dias, mas pode ser mais longa, dependendo se a contração celular é observada.

  1. Preparação do experimento
    1. Prepare as placas de silicone.
      1. Autoclave 2 placas de silicone (ver Tabela de Materiais). Depois, em condições estéreis, retirar as placas de silicone do saco de autoclave e colocá-las em placas de 150 mm.
      2. Combinar 130 μL de fibronectina (100x, ver Tabela de Materiais) com 13 mL de PBS estéril em um tubo cônico de 15 mL. Inverta o tubo várias vezes para misturar.
      3. Adicionar 400 μL de solução de fibronectina a cada poço das placas de silicone. Incubar as placas a 37 °C durante um mínimo de 2 h ou durante a noite.
      4. Antes do uso, aspirar a solução de fibronectina e deixar as placas secarem ao ar na capela de cultura celular por pelo menos 30 minutos para deixar a solução de fibronectina evaporar completamente.
        NOTA: A solução de fibronectina pode ser removida dos poços antes do tempo, e as placas agora revestidas podem ficar a 37 °C por até algumas semanas até o uso.
    2. Prepare a mídia de alongamento do MSC.
      1. Preparar o meio de alongamento MSC adicionando 140 μL de ácido ascórbico (estoque: 100x, concentração final: 50 μg/mL) a 14 mL de meio MSC pré-aquecido em um tubo cônico de 15 mL.
        NOTA: O ácido ascórbico deve ser adicionado fresco à mídia MSC antes de cada alteração de mídia.
  2. Semeadura de iMSCSCX+ em placas de silicone
    1. Execute o "Protocolo de células de elevação padrão" (etapa 1.3).
    2. Ressuspender as células em meio MSC e contar as células viáveis usando um hemocitômetro ou um contador de células.
    3. Calcular o volume de suspensão celular necessário para obter 1,25 x 104 células/cm2.
    4. Remova esse volume de meio elástico MSC do tubo cônico de 15 mL. Adicione as células de destino. Inverter para homogênea a nova suspensão celular.
    5. Adicione 400 μL da nova suspensão celular a cada poço de ambas as placas de silicone.
    6. Recolocar a tampa nas placas de 150 mm e devolvê-las à incubadora a 37 °C por 24 h.
  3. Tensão uniaxial
    1. No dia seguinte, enxaguar o aparelho de alongamento (ver Tabela de Materiais) com ddH2O seguido de etanol 70%. Limpe o aparelho, coloque-o na capa de cultura celular e UV por 15 minutos.
    2. Recupere as placas semeadas e verifique se os poços estão bem aderidos às células.
    3. Deixe uma placa na incubadora (controle estático) e coloque a placa de silicone de segunda semente no aparelho de alongamento, alinhando os parafusos com os orifícios na placa de silicone. Substitua a tampa do aparelho para garantir a esterilidade.
    4. Fixar o aparelho com a placa de silicone semeada à fonte electrónica (ver Tabela de Materiais) e colocá-lo na incubadora a 37 °C.
    5. No programa, definir o protocolo de alongamento cíclico para 4% de tensão senoidal, 0,5 Hz, 2 h por dia. Comece o alongamento pressionando o botão Iniciar uma vez. O alongamento deve começar imediatamente.
    6. Estique as células por um mínimo de 3 dias. Monitore as células diariamente e pare o protocolo de alongamento se a contração celular puder ser observada. Mude a mídia para uma nova mídia de alongamento do MSC a cada dois dias.

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Resultados

Diferenciação de iPSCs humanas para iMSCs
Como descrito anteriormente, o protocolo atual para diferenciar iPSCs em iMSCs envolve a formação de corpos embrionários2. Esse processo leva aproximadamente dez dias para induzir iMSCs a partir de iPSCs (Figura 1A). No entanto, é altamente recomendável passar pelos iMSCs recém-gerados pelo menos duas vezes. Isso não só ajuda a eliminar a necessidade de placas revestidas com gelatina, mas também estabelece ...

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Discussão

Neste protocolo, os iTenócitos são gerados através de três etapas principais: (1) indução de iPSCs para iMSCs, (2) superexpressão de SCX usando um vetor lentiviral e (3) maturação das células através de tensão uniaxial 2D.

O protocolo apresentado para diferenciar iPSCs em iMSCs foi previamente descrito por nosso grupo2. Desde essa publicação, vários protocolos foram desenvolvidos, incluindo um protocolo estabelecido para o uso de iMSCs em ensaios clínicos 21,22,23, bem ...

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Divulgações

Todos os autores não têm conflitos de interesse a declarar.

Agradecimentos

Este estudo foi parcialmente apoiado pelo NIH/NIAMS K01AR071512 e CIRM DISC0-14350 para Dmitriy Sheyn. Os dois plasmídeos de embalagem de lentivírus foram um presente do laboratório Simon Knott (Departamento de Ciências Biomédicas, Cedars-Sinai Medical Center).

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
2-mercaptoetanol Sigma AldrichM3148
AccutaseStemCell Technologies7920reagente de dissociação celular
Solução antibiótica-antimicóticaThermofisher15240096
Anti-CD105Ancell326-050
APC camundongo anti-humano CD44BD Biosciences559942
APC mouse IgG2 K isotipo controleBD Biosciences555745
BenchMark soro fetal bovinoGeminiBio100-106
BiglycanThermofisherHs00959143_m1
Albumina de soro bovinoMillipore SigmaA3733
Colágeno tipo I alfa 1 cadeia humana Taqman primerThermofisherHs00164004_m1
Colágeno tipo III alfa 1 cadeia humana Taqman primerThermofisherHs00943809_m1
DimetilsulfóxidoMillipore SigmaD8418
DMEM, baixa glicose, piruvato, sem glutamina, sem fenol vermelhoThermofisher11054020
meio essencial mínimo de águia (EMEM)ATCC30-2003
Plasma bovino de fibronectinaSigma AldrichF1141
FITC camundongo anti-humano CD90BD Biosciences555595
Gelatina de pele suínaSigma AldrichG1890
Cabra anti camundongo IgG1-PEBio-RadSTAR117
HEK 293T / 17ATCCCRL-11268
IMDM, sem vermelho de fenolThermofisher21056023
iPSCs: 83i-cntr-33n1Cedars-Sinai iPSC Core FacilityN/Ahttps://biomanufacturing.cedars-sinai.org/product/cs83ictr-33nxx/
Anticorpo de controle de isotipo, camundongo IgG2a-FITCMiltenyi Biotec130-113-271
KnockOut substituição de soroThermofisher10828010
ácido L-ascórbicoSigma AldrichA4544
L-glutaminaThermofisher2503081
MatrigelCorning354230matriz de membrana basal
MechanoCulture FXCellScaleN/Aaparelho de alongamento
MEM solução de aminoácidos não essenciaisThermofisher11140050
Mohawk primer humano TaqmanThermofisherHs00543190_m1
mTeSR PlusStemCell Technologies100-0276
PBSThermofisher10010023
Receptor de fator de crescimento derivado de plaquetas Um primer Taqman humanoThermofisherHs00998018_m1
Poli(2-hidroxietil metacrilato)Sigma Aldrich192066
Reagentes de infecção/transfecção PolybreneMillipore SigmaTR-1003
Humano recombinante  TGF-beta 1 proteína humana Taqman primerRnD Systems240-B
Scleraxis humano Taqman primerThermofisherHs03054634_g1
SCXA (SCX) (NM_00108050514) humano marcado ORF cloneOriGeneRC224305L4
Placas de siliconeCellScaleN / A
Azida de sódioMillipore SigmaS2002
Tenascina C primer Taqman humanoThermofisherHs00370384_m1
Tenomodulin primer Taqman humanoThermofisherHs00223332_m1
Trombospondina 4 primer Taqman humanoThermofisherHs00170261_m1
Reagente de transfecção, BioTBioland Scientific LLCB01-01
Tripsina-EDTA (0,25%)Thermofisher25200072
Membro da família de proteínas promotoras de polimerização de tubulina 3ThermofisherHs03043892_m1
dicloridrato Y-27632Biogems1293823

Referências

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