Modelo de isquemia-reperfusão renal bilateral para lesão renal aguda em camundongos

Resumo

O modelo de lesão de isquemia-reperfusão (IRI) pode ser usado em diferentes estágios do desenvolvimento da lesão renal aguda (LRA), especialmente durante a progressão da LRA para a doença renal crônica (DRC). Aqui, descrevemos o procedimento para o desenvolvimento do modelo IRI em camundongos por meio de uma abordagem transabdominal, pinçando pedículos renais por meio de um clipe vascular para induzir lesão isquêmica.

Resumo

A lesão renal aguda (LRA) é definida como um rápido declínio da função renal, no qual a disfunção renal persistente progride gradualmente para doença renal crônica (DRC) devido à perda irreversível de néfrons e seu reparo desadaptativo. Nos últimos anos, a incidência de LRA vem aumentando em diversas etiologias, incluindo depleção de volume, sepse, nefrotoxicidade, lesão muscular e trauma maior, em que a lesão de isquemia-reperfusão (IRI) é responsável pela maioria dos episódios. O desenvolvimento do modelo IRI em camundongos é induzido pelo pinçamento cirúrgico dos pedículos renais, que fornece ferramentas poderosas e controláveis para modelos pré-clínicos de LRA. É importante ressaltar que o modelo IRI é implantado em diferentes estágios do desenvolvimento da LRA, especialmente nos processos de LRA para DRC. Apesar do modelo IRI ser amplamente praticado em muitos laboratórios, uma série de variáveis ainda influencia os resultados desse modelo. Aqui, descrevemos o procedimento de desenvolvimento do modelo IRI para fornecer um método repetível e confiável para os pesquisadores explorarem a patogênese subjacente no desenvolvimento da LRA e a progressão da LRA para DRC.

Introdução

A lesão renal aguda (LRA) é uma síndrome clínica grave com morbidade e mortalidade significativas, definida como um aumento na creatinina sérica de ≥ 0,3 mg/dL (26,5 μM/L) em 48 h ou um aumento na creatinina sérica para ≥ 1,5 vezes a linha de base em 7 dias, ou volume urinário < 0,5 mL/kg/h por 6 h^{1, 2,3}. Apesar de décadas de pesquisa, falta terapia eficaz para LRA para aliviar danos renais ou acelerar a recuperação renal, e uma proporção considerável de pacientes com LRA evolui para doença renal crônica (DRC)^4,5,6. Moléculas e vias complexas estão envolvidas na LRA e sua progressão em parte, portanto, os modelos pré-clínicos fornecem ferramentas poderosas para desvendar essas complexidades para o desenvolvimento de modalidades terapêuticas eficientes.

Clinicamente, a lesão por isquemia-reperfusão (IRI) é a principal causa de LRA em várias condições, incluindo cirurgias cardíacas e hepáticas, choque circulatório, depleção de volume, sepse, oclusão ou obstrução vascular renal, transplante renal e assim por diante⁷. O modelo de camundongo IRI-AKI está em uso desde a década de 1960; Este modelo foi desenvolvido por pinçamento cirúrgico dos pedículos renais com pinças não traumáticas em camundongos levando à isquemia e seguido de reperfusão do fluxo sanguíneo renal pela remoção das pinças. O modelo IRI-AKI é tipicamente caracterizado por morte de células tubulares renais e dano progressivo ao tecido renal. O IRI é um dos modelos mais comuns usados para a patogênese e intervenção terapêutica na LRA por vários motivos: (1) A simplicidade e a segurança do procedimento cirúrgico melhoram a taxa de sobrevida e a taxa de sucesso do modelo IRI-AKI⁸; (2) Como a isquemia é uma etiologia importante na LRA humana, o modelo de IRA-IRA é melhor utilizado para avaliar o evento clínico de LRA⁹; (3) O modelo IRI pode apresentar alterações na lesão renal e histopatológica em diferentes estágios da LRA, o que também é aplicável ao estudo da progressão da LRA para a DRC¹⁰. Dependendo do desenho experimental, os modelos de LRA induzida por IRI incluem IRI bilateral, IRI unilateral com rim contralateral intacto e IRI unilateral com nefrectomia contralateral simultânea. Notavelmente, o modelo IRI bilateral é considerado mais relevante para condições patológicas humanas de LRA porque ambos os rins foram afetados pelo suprimento sanguíneo¹¹. O modelo IRI é aplicável para simular os efeitos da redução do fluxo sanguíneo renal após transplante renal, bypass cardíaco, vascular renal ou cirurgia poupadora de néfrons, bem como no cenário de hipotensão⁹. Aqui, descrevemos o procedimento para um modelo IRI bilateral para fornecer um método consistente e confiável para os pesquisadores explorarem a patogênese subjacente na LRA induzida por isquemia.

Protocolo

Camundongos machos C57BL/6J com 8 semanas de idade e peso de 25 g foram utilizados para estabelecer o modelo de LRA por isquemia-reperfusão bilateral. De acordo com estudos anteriores, mantemos a temperatura corporal em torno de 36,5 °C-37 °C, e a duração da isquemia renal é de 30 min na cirurgia de IRI^12,13. Um total de 6 camundongos foram necessários para cada grupo, e camundongos operados simuladamente serviram como controles. Os experimentos com animais neste estudo foram aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais (IACUC) da Universidade de Zhejiang para proteger o bem-estar dos animais. Todos os procedimentos de pesquisa com animais foram realizados seguindo as diretrizes e princípios éticos da Universidade de Zhejiang.

1. Preparo pré-operatório

1. Esterilize todos os instrumentos cirúrgicos de alta pressão.
2. Prepare a solução anestésica adicionando 2 mL de cetamina e 0,4 mL de xilazina em 7,6 mL de solução salina estéril. Anestesiar o camundongo com uma mistura de cetamina (80 mg/kg) e xilazina (16 mg/kg) por injeção intraperitoneal. Avalie a profundidade do anestésico usando o reflexo de pinça do dedo do pé.
3. Coloque o camundongo anestesiado no cobertor homeotérmico para garantir que suas vias aéreas permaneçam desobstruídas. Mantenha a temperatura corporal na faixa de 36,5-37 °C.
4. Cubra os olhos do camundongo com pomada ocular de cloridrato de tetraciclina a 1% para evitar o ressecamento durante a anestesia.
5. Raspe o cabelo do abdômen com uma máquina de cortar cabelo e limpe a pele da área cirúrgica com uma solução de iodopovidona por 3x.

2. Cirurgia

1. Faça uma incisão mediana abdominal de aproximadamente 1-1,5 cm com uma tesoura cirúrgica através da pele e da camada muscular e abra a cavidade abdominal com um espalhador.
2. Exponha o rim movendo a gordura retroperitoneal e empurrando os intestinos e outros órgãos para o lado de fora com um cotonete. O rim está localizado no espaço retroperitoneal, cerca de 0,5 cm lateral à coluna vertebral e abaixo da^13ª costela.
3. Disseque o pedículo renal com uma pinça pontiaguda para separar e remover a fáscia e o tecido adiposo e expor os pedículos renais esquerdos.
4. Prenda os pedículos renais com um clipe vascular usando uma pinça de retenção e certifique-se de que o dano vascular seja o menor possível. Evite clampear a gordura redundante do seio renal, o que pode levar à isquemia renal incompleta.
5. Defina a duração da isquemia renal, começando com o pinçamento por 30 min. A característica da isquemia bem-sucedida é que o rim muda gradualmente de vermelho para roxo profundo em poucos minutos.
6. Mova o rim para o espaço retroperitoneal. Repita o procedimento no lado contralateral para expor e pinçar os pedículos renais direitos.
7. Registre o tempo de isquemia em cada lado separadamente para garantir que ambos os rins recebam a duração exata da isquemia. Reabra a incisão e solte o clipe vascular no final da duração da isquemia.
8. Recoloque o rim no espaço retroperitoneal e, em seguida, suture o músculo e a pele camada por camada com a sutura Vicryl 4-0.
   NOTA: Os procedimentos cirúrgicos devem ser realizados em condições estéreis. Limpe a mesa cirúrgica e os instrumentos com etanol a 75% durante a operação, quando necessário.

3. Cuidados pós-operatórios

1. Administre 0,5-1 mL de solução salina morna e estéril por injeção intraperitoneal para compensar a perda de fluido.
2. Mantenha a decúbito esternal com atenção até que o camundongo recupere a consciência suficiente. Coloque o rato no cobertor homeotérmico até que ele ganhe plena consciência e, em seguida, retorne à sua gaiola. Não devolva o rato à companhia de outros animais até que esteja totalmente recuperado.
3. Dê buprenorfina 0,05-0,10 mg/kg a cada 12 h durante os primeiros 3 dias para aliviar a dor pós-cirúrgica. Monitore os ratos cirúrgicos todos os dias.

4. Avaliação do modelo

1. Coloração de hematoxilina-eosina (HE)
   1. Eutanásia de animais usando pentobarbital sódico por injeção intraperitoneal nos dias 1, 3, 7 ou 14 após o IRI.
   2. Fixe os tecidos renais frescos com paraformaldeído (PFA) a 4% durante a noite e armazene em etanol a 75% a 4 ° C.
   3. Após a desidratação e incorporação, corte as amostras obtidas em 8 μm de espessura para coloração.
   4. Desparafine as seções de tecido em xileno e, em seguida, reidrateie com concentrações decrescentes de etanol.
   5. Manchar as seções de tecido com hematoxilina e eosina.
   6. Desidratar as seções de tecido aumentando as concentrações de etanol e xileno.
2. Ensaio de função renal
   1. Colete amostras de sangue usando o método de coleta de sangue do globo ocular após a anestesia.
   2. Centrifugue amostras de sangue a 12000 x g por 10 min para separar o soro.
   3. Determine a creatinina sérica e o nitrogênio ureico no sangue (BUN) pelo analisador automático de química seca para monitorar a função renal.
3. PCR em tempo real (RT-PCR)
   1. Extraia o RNA total dos tecidos renais usando um kit rápido de extração de RNA e, em seguida, sintetize o cDNA com um kit de mistura de transcriptase reversa. Execute RT-PCR com o SYBR Green Premix Kit e execute no instrumento RT-PCR. As sequências de primers usadas aqui foram relatadas antes de¹⁴: KIM1 forward, 5'-GCTGCTACTGCTCCTTGTGA-3'; reverso 5'-GGAAGGCAACCACGCTTAGA-3'; NGAL para a frente, 5'-GGCCAGTTCACTCTGGGAAA-3; reverso 5'- TGGCGAACTGGTTGTAGTCC-3'; GAPDH para a frente, 5'-GGTGAAGGTCGGTGTGAACG-3'; reverso 5'-CTCGCTCCTGGAAGATGGTG-3'.

Resultados

Estado do rim durante a cirurgia

A característica da isquemia bem-sucedida é que o rim muda gradualmente de vermelho para roxo profundo em 1-2 min, e a reperfusão bem-sucedida é caracterizada pela mudança gradual do rim de roxo profundo para vermelho em 1-2 min.

Histologia do rim após a cirurgia

A coloração HE e Periodic Acid Schiff (PAS) são as formas diretas de verificar a lesão renal aguda. No modelo d...

Discussão

Neste artigo, fornecemos um procedimento detalhado sobre o modelo renal IRI, destacando posteriormente que é um modelo robusto para a progressão de LRA e LRA para DRC. Além disso, demonstramos o impacto dos dois principais critérios de lesão renal, incluindo histologia e função renal.

Vários pontos-chave em procedimentos cirúrgicos precisam ser enfatizados para um modelo repetível e confiável. Para cirurgia abdominal, recomenda-se uma incisão na linha média pa...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Máquina de cortar pêlos de animais	FEIYUBIO	19-7002
Seringas de 1 ml	Longreen	SR60061
Etanol	Macklin	E885996
Gaze	FEIYUBIO	19-5022
Sistema de monitor homeotérmico	Warmmate	40 x 50
Porta-agulha	DKBT	CZQ-00160
Espalhador	RWD	R22029-03
Solução salina estéril	Biosharp	BL158A
Tesoura de tecido	DKBT	DC-YKJ1002
Pinça de tecido	DKBT	DK079904
Clipe vascular	Ferramentas de Ciência Fina	18055-02
Sutura Vicryl	Shanghai Jinhuan	4 -0