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Superexpressão de tropomodulina 3 como marcador de resistência à platina e infiltração imunológica no câncer de ovário

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DOI:

10.3791/65841

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2 de agosto de 2024

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1Department of Clinic, School of Medicine, Yangzhou Polytechnic College, 2Department of Nuclear Medicine, Huangshi Central Hospital, Affiliated Hospital of Hubei Institute of Technology, 3School of Biology and Engineering, Guizhou Medical University, 4Hemorheology Center, Department of Physiology and Pathophysiology, School of Basic Medical Sciences, Peking University Health Science Center

* These authors contributed equally

Neste artigo

Resumo

A tropomodulina 3 (TMOD3) tem sido cada vez mais estudada em tumores nos últimos anos. Este estudo é o primeiro a relatar que o TMOD3 é altamente expresso no câncer de ovário e está intimamente associado à resistência à platina e infiltração imunológica. Esses resultados podem ajudar a melhorar os resultados terapêuticos para o câncer de ovário.

Resumo

O citoesqueleto desempenha um papel importante na resistência à platina no câncer de ovário. A tropomodulina 3 (TMOD3) é crítica no desenvolvimento de muitos tumores, mas seu papel na resistência aos medicamentos do câncer de ovário permanece inexplorado. Ao analisar dados dos bancos de dados Gene Expression Omnibus (GEO), The Cancer Genome Atlas (TCGA) e Clinical Proteomic Tumor Analysis Consortium (CPTAC), este estudo comparou a expressão de TMOD3 em câncer de ovário e tecidos normais e examinou a expressão de TMOD3 após o tratamento com platina em cânceres de ovário sensíveis e resistentes à platina. O método de Kaplan-Meier foi usado para avaliar o efeito do TMOD3 na sobrevida global (OS) e na sobrevida livre de progressão (PFS) em pacientes com câncer de ovário. microRNAs (miRNAs) direcionados ao TMOD3 foram previstos usando o TargetScan e analisados usando o banco de dados TCGA. O Tumor Immune Estimation Resource (TIMER) e um portal de repositório integrado para interações tumor-sistema imunológico (TISIDB) foram usados para determinar a relação entre a expressão de TMOD3 e a infiltração imunológica. As redes de coexpressão de TMOD3 no câncer de ovário foram exploradas usando LinkedOmics, a ferramenta de pesquisa para a recuperação de genes/proteínas em interação (STRING) e o banco de dados para anotação, visualização e descoberta integrada (DAVID) Bioinformática. Os resultados mostraram que o TMOD3 foi altamente expresso no câncer de ovário e foi associado à classificação, estadiamento e metástase do câncer de ovário. A expressão de TMOD3 foi significativamente reduzida em células de câncer de ovário tratadas com platina e pacientes. No entanto, a expressão de TMOD3 foi maior em células e tecidos de câncer de ovário resistentes à platina em comparação com os sensíveis à platina. A maior expressão de TMOD3 foi significativamente associada a menor SG e PFS em pacientes com câncer de ovário tratadas com quimioterapia à base de platina. A regulação pós-transcricional mediada por miRNA é provavelmente responsável pela alta expressão de TMOD3 em câncer de ovário e tecidos ovarianos resistentes à platina. A expressão do mRNA de TMOD3 foi associada à infiltração imunológica no câncer de ovário. Esses achados indicam que o TMOD3 é altamente expresso no câncer de ovário e está intimamente associado à resistência à platina e infiltração imunológica.

Introdução

O câncer de ovário é o segundo maior na taxa de mortalidade de tumores ginecológicos em todo o mundo1. Pode ser classificado em três tipos com base na histopatologia: tumores de células germinativas, mesenquimais gonadal e epiteliais, dos quais 90% dos pacientes são câncer de ovário epitelial. Os fatores de risco associados ao câncer de ovário incluem ovulação persistente, aumento da exposição à gonadotrofina e citocinas inflamatórias2. Mais de 75% dos casos de câncer de ovário não são detectados até estágios avançados, resultando na falta de tratamento eficaz. Pacientes com câncer de ovário avançado têm um prognóstico desfavorável, com menos de 20% da taxa de sobrevida em 5 anos, apesar de novos esquemas de quimioterapia, como administração intraperitoneal e terapia direcionada. O tratamento padrão para o câncer de ovário consiste principalmente na cirurgia de ressecção do tumor seguida de quimioterapia com medicamentos como platina e paclitaxel. No entanto, a recidiva tumoral ocorre em cerca de 70% dos casos1. A cisplatina exerce seus efeitos terapêuticos interferindo na replicação e transcrição do DNA e atualmente é o agente de primeira linha na quimioterapia do câncer de ovário. No entanto, uma proporção significativa de pacientes com câncer de ovário é resistente à platina3. Múltiplos processos celulares, como efluxo de drogas, desintoxicação celular, reparo de DNA, apoptose e autofagia, são críticos na resistência à platina em células de câncer de ovário 4,5,6.

A alteração no citoesqueleto é um mecanismo importante que afeta a resistência à platina no câncer de ovário. Recentemente, foi relatado que os genes relacionados ao citoesqueleto são geralmente expressos de forma aberrante, e o citoesqueleto de actina é significativamente modificado na presença de apoptose desencadeada pela cisplatina7. Muitos estudos mostraram que a cisplatina modula a nanomecânica das células do câncer de ovário. A rigidez celular das células sensíveis aumenta com a dose de platina de forma dependente, principalmente contribuída pela interrupção da polimerização da actina. Em contraste, as células resistentes à cisplatina não mostraram mudança significativa na rigidez celular após o tratamento com cisplatina8. Além disso, os módulos de Young de células de câncer de ovário sensíveis à cisplatina foram menores, conforme revelado pela microscopia de força atômica. Em contraste, as células de câncer de ovário resistentes à cisplatina exibem um citoesqueleto caracterizado por longas fibras de estresse de actina. A inibição da Rho GTPase diminui a rigidez e aumenta a sensibilidade à cisplatina nessas células resistentes. Por outro lado, a ativação da Rho GTPase em células sensíveis à cisplatina aumenta a rigidez celular e reduz sua sensibilidade à cisplatina9. A proteína de ligação ao RNA com splicing múltiplo (RBPMS), um gene supressor de tumor, reduz a resistência à cisplatina em células de câncer de ovário, regulando a expressão proteica da rede citoesquelética e mantendo a integridade celular10. As fibras de estresse de actina são mais pronunciadas nas células A2780 / CP em comparação com as células A2780. O desenvolvimento de resistência a drogas em células de câncer de ovário induz extensa reorganização do citoesqueleto de actina, afetando assim as propriedades mecânicas celulares, motilidade e transporte intracelular de drogas11.

TMOD3 é uma proteína reguladora do citoesqueleto que impede a despolimerização da actina tampando as extremidades de crescimento lento (pontiagudas) dos filamentos de actina12. O TMOD3 desempenha diferentes papéis em diferentes tipos de células, regulando a dinâmica da actina e participando de vários processos, como promover a forma celular, a migração celular e a contração muscular. Foi demonstrado que a deleção de TMOD3 em camundongos leva à morte embrionária em E14.5-E18.5, sugerindo que TMOD3 pode ser um fator crítico no desenvolvimento embrionário13. Com base em suas funções biológicas em células-tronco e progenitoras, o TMOD3 pode desempenhar um papel essencial na progressão do tumor. No carcinoma hepatocelular, o TMOD3 promove o crescimento, invasão e migração de células de carcinoma hepatocelular ativando a via de sinalização MAPK/ERK14 e promove metástase à distância ativando a via PI3K-AKT por meio da interação com o receptor do fator de crescimento epidérmico15. O MiRNA-490-3p inibe a proliferação e invasão de células de carcinoma hepatocelular, visando TMOD316. O MiR-145 melhora a radiossensibilidade do câncer de pulmão de células não pequenas resistente à radiação, inibindo o TMOD317. Experimentos in vitro revelaram que o TMOD3 mediou a invasão de células cancerígenas do esôfago, regulando o citoesqueleto por meio da interação com o homólogo 2 da lisil oxidase (LOXL2)18. Além disso, a análise proteômica revelou que a alta expressão de TMOD3 poderia potencialmente mediar a quimiorresistência ao etoposídeo no câncer de pulmão por meio da via apoptótica19. Embora o TMOD3 tenha sido cada vez mais estudado em tumores nos últimos anos, ainda não há relatos sobre o papel do TMOD3 no câncer de ovário e na quimioterapia.

Este estudo descobriu que o TMOD3 é regulado positivamente no câncer de ovário. Notavelmente, a regulação positiva do TMOD3 foi associada à resistência à platina. Este estudo também avaliou o valor prognóstico do TMOD3 no câncer de ovário e sua correlação com a infiltração imune tumoral. Este estudo sugere que a superexpressão de TMOD3 no câncer de ovário está associada à resistência à platina.

Protocolo

1. Omnibus de Expressão Gênica (GEO)

NOTA: A expressão de TMOD3 no câncer de ovário, no câncer de ovário tratado com medicamentos de platina e no câncer de ovário resistente a medicamentos foi derivada dos conjuntos de dados GEO. O tipo de estudo de todos os conjuntos de dados foi o perfil de expressão por array, e os organismos foram Homo sapiens.

  1. Vá para o banco de dados GEO (consulte a Tabela de Materiais) e insira palavras-chave como TMOD3, câncer de ovário e resistente a medicamentos ou acesso a dados na caixa de pesquisa (consulte a Figura Suplementar 1A).
  2. Divida os dados em grupos diferentes na caixa de grupo Definir . No menu de opções , escolha Benjamini e Hochberg (Taxa de descoberta falsa) na caixa Aplicar ajuste aos valores P e clique em analisado no menu GEO2R . Clique em baixar tabela completa para obter os resultados.
  3. Investigue e plote os dados baixados com software de gráficos e estatísticas (consulte a Figura 1B suplementar).
  4. Use o teste t não pareado para a comparação entre dois grupos.

2. TNM enredo

NOTA: O TNMplot utiliza dados de RNA-seq dos repositórios The Cancer Genome Atlas (TCGA), Therapeutic Research to Generate Effective Treatments (TARGET) e Genotype-Tissue Expression (GTEx)20. A expressão de TMOD3 em tecidos ovarianos normais e câncer de ovário foi analisada usando TNMplot.

  1. Vá para a ferramenta da web TNMplot (consulte Tabela de Materiais) e clique em Comparar Tumor e Normal.
  2. Insira TMOD3 em Escolha uma caixa de genes e escolha Cistoadenocarcinoma seroso ovariano em Escolha a caixa de tecido .
  3. Clique em iniciar análise para obter os resultados (consulte a Figura 1C suplementar).

3. UALCAN

NOTA: O Portal de Análise de Dados CANcer da Universidade de Alabama em Birmingham (UALCAN) é um recurso on-line fácil de usar para analisar dados de câncer disponíveis publicamente21. A expressão do nível proteico de TMOD3 em tecido normal e câncer de ovário em dados de CPTAC foi analisada usando UALCAN.

  1. Vá para UALCAN (consulte Tabela de Materiais) e clique no menu Proteômica .
  2. Insira TMOD3 na caixa Inserir nomes de genes e escolha câncer de ovário na caixa Conjunto de dados CPTAC .
  3. Clique em Explorar para obter os resultados (consulte a Figura 1D suplementar).

4. Análise prognóstica KM-plotter

NOTA: O valor prognóstico do TMOD3 no câncer de ovário foi analisado usando o plotter de Kaplan Meier (KM-plotter), incluindo sobrevida global (OS) e sobrevida livre de progressão (PFS)22.

  1. Vá para KM-plotter (consulte Tabela de Materiais) e clique em Iniciar KM-plotter para câncer de ovário.
  2. Insira TMOD3 na caixa Affy id/Gene symbol .
  3. Escolha Selecionar automaticamente o melhor ponto de corte em Dividir pacientes por caixa.
  4. Escolha contém platina na opção de quimioterapia ao realizar a análise de prognóstico para pacientes de quimioterapia à base de platina.
  5. Escolha TCGA em Usar os seguintes conjuntos de dados para a caixa de análise .
  6. Clique em Desenhar gráfico de Kaplan-Meier para obter os resultados (consulte a Figura Suplementar 2).

5. Plotador ROC

NOTA: O Receiver Operating Characteristic Curve (ROC) Plotter foi utilizado para analisar a expressão de TMOD3 em pacientes resistentes ou sensíveis à quimioterapia à base de platina e permite a validação do gene interessado como marcador preditivo por curvas ROC. Os conjuntos de dados do plotter ROC no nível do transcriptoma são principalmente dos bancos de dados TCGA e GEO e contêm dados de tratamento e resposta de 1816 pacientes com câncer de ovário23.

  1. Vá para o ROC Plotter (consulte a Tabela de Materiais) e clique em ROC plotter para câncer de ovário.
  2. Insira TMOD3 na caixa Símbolo do gene .
  3. Escolha Sobrevida livre de recidiva em 6 meses na caixa Responde e escolha Platin na caixa Tratamento .
  4. Clique em Calcular para obter os resultados (consulte a Figura 3 suplementar).

6. Análise de mRNA-miRNA

NOTA: Os miRNAs direcionados ao TMOD3 foram previstos pelo TargetScan24 e, em seguida, a correlação do TMOD3 com esses miRNAs no conjunto de dados de câncer de ovário TCGA foi analisada pelo cBioportal25. Em seguida, o resultado acima foi visualizado pelo Cytoscape26. A expressão de miRNA em pacientes com câncer de ovário sensível à cisplatina e resistente a medicamentos foi analisada por LinkedOmics27.

  1. Vá para TargetScan (consulte Tabela de Materiais) e insira TMOD3 na caixa Insira um símbolo de gene humano (consulte a Figura Suplementar 4A).
  2. Acesse o cBioportal (consulte a Tabela de Materiais).
  3. Escolha o conjunto de dados Ovarian Serous Cystadenocarcinoma (TCGA, Nature 2011) e insira os símbolos TMOD3 e miRNA na caixa Enter Genes .
  4. Clique em Submit Query para obter os dados de correlação de TMOD3 com miRNAs no conjunto de dados de câncer de ovário TCGA (ver Figura Suplementar 4B) e, em seguida, visualize o resultado pelo Cytoscape (ver Tabela de Materiais) (ver Figura Suplementar 4C).
  5. Vá para LinkedOmics (consulte Tabela de materiais) e selecione TCGA_OV coorte de amostra .
  6. Escolha clínico na caixa Selecionar conjunto de dados de pesquisa e selecione o status platinum na caixa Selecionar atributo do conjunto de dados de pesquisa .
  7. Escolha miRNASeq na caixa Selecionar conjunto de dados de destino e escolha teste t em Selecionar método estatístico.
  8. Clique em Submit Query para obter os resultados (veja a Figura 4D suplementar).

7. Análise de imunoinfiltração

NOTA: O banco de dados do Atlas de Proteínas Humanas (HPA) foi usado para analisar a distribuição de TMOD3 em várias células imunes. O TIMER é um banco de dados on-line conveniente que analisa a infiltração imunológica associada a vários tipos de câncer28. Este estudo usou o TIMER para analisar a relação entre a expressão de mRNA de TMOD3 e a pureza do câncer de ovário e a infiltração de células imunes. O TISIDB é um portal online para interações tumor-sistema imunológico29. Este estudo usou o TISIDB para determinar a correlação entre o TMOD3 e os imunomoduladores no câncer de ovário.

  1. Vá para HPA (consulte Tabela de materiais) e insira TMOD3 na caixa Pesquisar e obtenha o resultado.
  2. Escolha Imune para mostrar a distribuição de TMOD3 em várias células imunes (consulte a Figura 5A suplementar).
  3. Vá para TIMER (consulte Tabela de Materiais) e insira TMOD3 na caixa Símbolo do Gene .
  4. Escolha OV na caixa de tipos de câncer e clique em Enviar para obter o resultado (consulte a Figura 5B suplementar).
  5. Vá para TISIDB (consulte Tabela de Materiais) e insira TMOD3 na caixa Símbolo do gene .
  6. Clique em Submit para obter o resultado (consulte a Figura 5C suplementar).

8. Redes de coexpressão de TMOD3 no câncer de ovário

NOTA: Os genes co-expressos com TMOD3 foram analisados por LinkedOmics, e os genes TOP50 foram exibidos por mapas de calor. Os genes que interagem com TMOD3 foram preditos pelo STRING30. Em seguida, os genes sobrepostos foram exibidos pelo diagrama de Venn. Os genes sobrepostos foram funcionalmente anotados por DAVID31para as vias Gene Ontology Biological Process (GO-BP), Gene Ontology Cellular Component (GO-CC), Gene Ontology Molecular Function (GO-MF) e Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG).

  1. Vá para LinkedOmics e selecione TCGA_OV coorte de amostra.
  2. Escolha RNAseq na caixa Selecionar conjunto de dados de pesquisa e na caixa Selecionar conjunto de dados de destino .
  3. Clique em Enviar consulta para obter os resultados dos genes co-expressos com TMOD3.
  4. Vá para STRING (consulte Tabela de Materiais) e insira TMOD3 na caixa Nome da Proteína .
  5. Escolha homo sapiens na caixa Organismos e clique em pesquisar para obter o resultado (consulte a Figura Suplementar 6).
  6. Vá para DAVID (consulte Tabela de Materiais).
  7. Insira os genes sobrepostos na caixa Inserir lista de genes e escolha ENSEMBL _GENE_SYMBOL na caixa Selecionar identificador .
  8. Clique em Submit List para obter os resultados (consulte a Figura 7 suplementar).

9. Banco de dados CTD

NOTA: O banco de dados CTD é uma nova ferramenta para analisar as relações entre química, genes, fenótipos, doenças e ambiente32. O banco de dados CTD prevê medicamentos direcionados ao TMOD3. O banco de dados PubChem é então usado para determinar a estrutura molecular definitiva do medicamento.

  1. Vá para o banco de dados CTD (consulte Tabela de materiais) e escolha Consulta de interação química - gênica no menu Pesquisar .
  2. Insira TMOD3 na caixa GENE e clique em pesquisar para obter os resultados (consulte a Figura 8 suplementar).
  3. Vá para o banco de dados PubChem (consulte Tabela de Materiais) e insira medicamentos na caixa de pesquisa para obter os resultados (consulte a Figura Suplementar 9).

Resultados

Expressão de TMOD3 no câncer de ovário
Primeiro, o banco de dados GEO mostrou que os níveis de expressão de mRNA de TMOD3 foram elevados em conjuntos de dados de microarray GSE51088 e GSE66957 (Figura 1A, B). O TMOD3 também foi altamente expresso no câncer de ovário em comparação com os tecidos ovarianos normais pela ferramenta TNMplot web (Figura 1C). A análise dos dados de CPTAC pela ferramenta web UALCAN mostrou que o nível de proteína de TMOD3 também foi significativamente maior no câncer de ovário do que nos tecidos ovarianos normais (Figura 1D). Além disso, o conjunto de dados GEO GSE53963 mostrou que a expressão de TMOD3 foi significativamente maior em cânceres de ovário com grau 4 do que naqueles com graus 2 e 3 (Figura 1E), e o conjunto de dados GSE23554 mostrou que os níveis de TMOD3 eram mais altos em pacientes com câncer de ovário em estágio 3 do que naqueles com estágios 1 e 2 (Figura 1F). Além disso, o conjunto de dados GSE131978 mostrou que a expressão de TMOD3 também foi significativamente maior em tecidos de câncer de ovário com metástase do que naqueles sem metástase (Figura 1G). Esses resultados sugerem que o TMOD3 pode influenciar a progressão do câncer de ovário.

Efeitos da platina na expressão de TMOD3 no câncer de ovário
A quimioterapia é um fator importante que influencia a progressão do câncer de ovário33. Para investigar se o TMOD3 afeta a progressão do câncer de ovário influenciando a quimioterapia, este estudo observou primeiro se a expressão de TMOD3 foi alterada no câncer de ovário quando tratado com drogas quimioterápicas. GSE47856 conjunto de dados mostrou que o nível de expressão de TMOD3 diminuiu após ser tratado com cisplatina na linha celular CH1 do câncer de ovário (Figura 2A). O conjunto de dados GSE49577 mostrou que a expressão de mRNA de TMOD3 foi menor em camundongos xenoenxerto de câncer de ovário tratados com carboplatina do que nos não tratados (Figura 2B). Além disso, o conjunto de dados GSE63885 também mostrou que a expressão de TMOD3 foi significativamente reduzida após quimioterapia à base de platina em pacientes com câncer de ovário que eram altamente sensíveis à platina em comparação com pacientes com câncer de ovário que não foram tratadas com quimioterapia, mas não houve diferença em pacientes com câncer de ovário que eram moderadamente sensíveis à platina (Figura 2C). Os resultados acima sugerem que o TMOD3 é um possível alvo da platina.

Expressão de TMOD3 em câncer de ovário sensível ou resistente à platina
Com base nos resultados acima, este estudo levantou a hipótese de que a alta expressão de TMOD3 no câncer de ovário pode afetar a progressão do câncer de ovário, regulando a resistência à platina. Portanto, este estudo examinou pela primeira vez a expressão de TMOD3 em linhagens celulares resistentes a medicamentos ou tecidos de câncer de pacientes por vários conjuntos de dados GEO. Os conjuntos de dados GSE15372 e GSE33482 mostraram que a expressão de TMOD3 na linha celular de câncer de ovário resistente à cisplatina a2780 foi significativamente maior do que no grupo sensível à cisplatina (Figura 3A, B). O conjunto de dados GSE45553 mostrou que a expressão de TMOD3 na expressão de esferóides de câncer de ovário resistente à cisplatina foi significativamente maior do que a do grupo sensível à cisplatina ( Figura 3C ). Finalmente, uma análise abrangente de pacientes com quimioterapia de câncer de ovário TCGA e GEO usando o plotter ROC revelou que a expressão de TMOD3 foi significativamente maior em pacientes com câncer de ovário com resistência à platina do que com sensibilidade à platina (Figura 3D). Além disso, a curva ROC mostrou o TMOD3 como um marcador para determinar a resistência à platina no câncer de ovário (Figura 3E). Os resultados acima sugerem que a alta expressão de TMOD3 pode desempenhar um papel essencial na resistência à platina no câncer de ovário.

O efeito da expressão de TMOD3 na taxa de sobrevida de pacientes com câncer de ovário
A análise prognóstica de pacientes com câncer de ovário TCGA pela ferramenta KM-plotter revelou que a alta expressão de mRNA de TMOD3 foi significativamente associada a baixa OS e PFS em pacientes totais ou pacientes com tratamento com platina (Figura 4). Curiosamente, a PFS em pacientes com tratamento com platina foi mais significativa do que o total de pacientes (Figura 4D). Como a PFS é um indicador melhor dos resultados do tratamento do que a OS, a análise prognóstica demonstra ainda mais o papel crítico do TMOD3 em pacientes com quimioterapia à base de platina para câncer de ovário.

Análise de mRNA-miRNA de TMOD3 em câncer de ovário
A regulação pós-transcricional mediada por microRNAs é um importante mecanismo que afeta a expressão gênica. A função de um gene pode ser prevista com base na função dos microRNAs direcionadosa ele 34. Para explorar o possível mecanismo de expressão elevada de TMOD3 no câncer de ovário, vinte e um microRNAs direcionados ao TMOD3 foram identificados por previsão do TargetScan. Sua correlação com TMOD3 também foi validada em amostras de câncer de ovário TCGA (Figura 5A). Todos demonstraram mediar a quimiorresistência tumoral, e a maioria (17/21) demonstrou associar-se à resistência à cisplatina no câncer de ovário 35,36,37,38,39,40,41,42,43,44,45,46,47,48, exceto has-miR-301a-3p, has-miR -301b-3p, has-miR-365a-5p e has-miR-365b-5p. Além disso, a análise das amostras de câncer de ovário TCGA revelou que tanto o has-miR-454-3p quanto o has-miR-133a-3p foram mais significativamente correlacionados negativamente com a expressão de TMOD3 (Figura 5A-C). Além disso, descobriu-se que o has-miR-133a-3p é pouco expresso em cânceres de ovário resistentes à cisplatina pela análise Linkedomics ( Figura 5E ), enquanto não houve significância no has-miR-454-3p ( Figura 5D ). Portanto, é possível que a regulação pós-transcricional mediada por microRNAs, especialmente has-miR-133a-3p, seja responsável pela alta expressão de TMOD3 em câncer de ovário resistente à cisplatina.

Relação entre a expressão de TMOD3 e a infiltração imunológica no câncer de ovário
A imunoterapia é uma estratégia terapêutica nova e promissora em comparação com a quimioterapia e a cirurgia. Cerca de 50% das pacientes com câncer de ovário apresentam infiltração espontânea de múltiplas células imunes49,50. Além disso, a imunoterapia para pacientes com câncer de ovário com quimiorresistência é de interesse. Por exemplo, o inibidor do ligante 1 de morte celular programada 1 (PD-L1) Durvalumabe, em combinação com o inibidor de PARP Olaparibe, mostrou bons efeitos terapêuticos em pacientes com câncer de ovário com resistência à platina51. O conjunto de dados HPA mostrou que o TMOD3 foi amplamente distribuído em várias células imunes (Figura 6A, B), o que implica que o TMOD3 desempenha um papel importante nas células imunes. Portanto, este estudo investigou a correlação entre TMOD3 e infiltração imune ao câncer de ovário usando TIMER. O TMOD3 foi negativamente correlacionado com a pureza do tumor (Figura 6C). Isso sugere que muitas outras células se infiltram no tecido do câncer de ovário e que o TMOD3 pode influenciar o câncer de ovário por meio dessas células infiltradas. De fato, os resultados mostraram ainda que a expressão de TMOD3 foi positivamente correlacionada com linfócitos B, células T CD8+, neutrófilos e células dendríticas, mas não com células T CD4+ e macrófagos (Figura 6D-I). Este estudo investigou ainda mais a relação entre a expressão de TMOD3 e imunomoduladores ou quimiocinas no câncer de ovário. Ele descobriu que a expressão de TMOD3 estava significativamente correlacionada com vários imunomoduladores (Figura 7A), incluindo pontos de verificação imunológicos bem estabelecidos, como Morte Programada 1 (PD1), PD-L1 (CD274) e Antígeno de Linfócitos T citotóxicos 4 (CTLA4) (Figura 7B-D). Esses resultados sugerem que o TMOD3 pode desempenhar um papel importante na infiltração imune do câncer de ovário.

Redes de coexpressão de TMOD3 no câncer de ovário
Este estudo explorou os mecanismos potenciais do TMOD3 no envolvimento do câncer de ovário. Primeiro, este estudo construiu a rede de coexpressão de TMOD3 no câncer de ovário. Um total de 4774 genes foram significativamente associados ao TMOD3 nas amostras de câncer de ovário TCGA reveladas pelo LinkedOmics. O mapa de calor mostrou os genes TOP50 positiva ou negativamente associados ao TMOD3 (Figura 8A,B). Em seguida, este estudo rastreou 295 genes interagindo com TMOD3 usando STRING. Após a sobreposição de 4774 genes significativamente associados ao TMOD3 e 295 genes interagindo com o TMOD3, 76 genes foram rastreados (Figura 8C). A análise de enriquecimento funcional desses 76 genes mostrou que o citoesqueleto de actina e a adesão focal foram os mais enriquecidos (Figura 8D). A análise de enriquecimento da via KEGG revelou que os proteoglicanos no câncer foram os mais enriquecidos ( Figura 8E ).

Terapêutica de pequenas moléculas
As correlações entre TMOD3 e drogas potenciais ou pequenas moléculas foram analisadas usando o banco de dados CTD. Um total de oito drogas foram identificadas como tendo potenciais efeitos inibitórios sobre o TMOD3 (Figura 9A), incluindo paracetamol, ácido aristolóquico I, bufalina, doxorrubicina, ácido fólico, haloperidol, toxina T-2 e tetraclorodibenzodioxina (Figura 9B-I). As estruturas moleculares dos fármacos identificados foram determinadas pelo banco de dados PubChem. Esses medicamentos fornecem pistas para superar o processo de resistência aos medicamentos no câncer de ovário mediado pela superexpressão de TMOD3.

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Figura 1: Níveis de expressão de mRNA e proteína de TMOD3 em vários conjuntos de dados de câncer de ovário. (A) Análise da expressão de mRNA de TMOD3 em tecidos ovarianos normais (n = 20) e câncer de ovário (n = 152) por GSE51088 conjunto de dados. (B) Análise da expressão de mRNA de TMOD3 em tecidos ovarianos normais (n = 12) e câncer de ovário (n = 57) por GSE66957 conjunto de dados. (C) Análise da expressão de mRNA de TMOD3 em tecido ovariano normal (n = 133) e câncer de ovário (n = 374) pela ferramenta TNM plotter. (D) Análise da expressão proteica de TMOD3 em tecido ovariano normal (n = 25) e câncer de ovário (n = 100) em dados CPTAC pela ferramenta UALCAN. (E) Análise da expressão de mRNA de TMOD3 em câncer de ovário de grau 2 e 3 (n = 94) e câncer de ovário de grau 4 (n = 80) por GSE53963 conjunto de dados. (F) Análise da expressão de mRNA de TMOD3 em câncer de ovário de estágio 1 e 2 (n = 10) e câncer de ovário de estágio 3 (n = 18) por GSE23554 conjunto de dados. Insira o texto aqui. (G) Análise da expressão de mRNA de TMOD3 em câncer de ovário com ou sem metástase pelo conjunto de dados GSE131978. Os dados são representados como média ± SEM. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Figura 2: Níveis de expressão de mRNA de TMOD3 em linhagens celulares de câncer de ovário, tumores transplantados e pacientes após tratamento com drogas de platina. (A) Análise da expressão de mRNA de TMOD3 em linhagens de células de câncer de ovário CH1 (n = 3) tratadas com cisplatina (n = 3) pelo conjunto de dados GSE47856. (B) Análise da expressão de mRNA de TMOD3 em expressão de mRNA de TMOD3 tratados com cisplatina (n = 12) e não tratados em transplantes de câncer de ovário CH1 (n = 19). (C) Análise da expressão de mRNA de TMOD3 em pacientes com câncer de ovário tratadas com cisplatina com alta sensibilidade (HS, n = 13) e moderadamente sensível à cisplatina (n = 28), bem como em pacientes sem tratamento com cisplatina (n = 26). Os dados são representados como média ± SEM. *em comparação com os não tratados, P < 0,05. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Figura 3: Níveis de expressão de mRNA de TMOD3 em linhagens celulares ou pacientes de câncer de ovário sensíveis e resistentes à platina. (A, B) Os níveis de expressão de mRNA de TMOD3 em linhagens celulares A2780 sensíveis e resistentes à cisplatina foram analisados pelo conjunto de dados GSE15372 (A) e GSE33482 conjunto de dados (B). (C) Os níveis de expressão de mRNA de TMOD3 em esferóides de câncer de ovário sensíveis e resistentes à cisplatina foram analisados pelo conjunto de dados GSE45553. (D, E) Os níveis de expressão de mRNA de TMOD3 em pacientes com câncer de ovário sensível e resistente à platina foram analisados pela ferramenta ROC plotter (D), e o TMOD3 foi identificado como um marcador para determinar a resistência à platina por curvas ROC (E). Os dados são representados como média ± SEM. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Figura 4: Análise de correlação dos níveis de expressão de mRNA de TMOD3 com OS e PFS de pacientes com câncer de ovário. (A, B) Análise de correlação dos níveis de expressão de mRNA de TMOD3 com OS em todos os pacientes com câncer de ovário TCGA (A) ou pacientes recebendo quimioterapia à base de platina (B). (C, D) Análise de correlação dos níveis de expressão de mRNA de TMOD3 com PFS em todos os pacientes com câncer de ovário TCGA (C) ou pacientes recebendo quimioterapia à base de platina (D). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Figura 5: Determinação das relações entre TMOD3 e resistência a medicamentos por análise de interação mRNA-microRNA. (A) Previsão de miRNAs direcionados ao TMOD3. A cor da linha representa o percentil de pontuação do TargetScan Context++ e a cor do nó representa a força de correlação entre este miRNA e o TMOD3 no conjunto de dados de câncer de ovário TCGA. (B, C) Correlação entre os níveis de expressão de mRNA de TMOD3 e has-miR454-3p (B) e has-miR133a-3p (C) em amostras de câncer de ovário TCGA. (D, E) Expressão de has-miR454-3p (D) e has-miR133a-3p (E) em câncer de ovário sensível e resistente à cisplatina em amostras de câncer de ovário TCGA. Os dados são representados como média ± SEM. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Figura 6: Correlação dos níveis de expressão de mRNA de TMOD3 com infiltração de células imunes no câncer de ovário. (A, B) Níveis de expressão de mRNA TMOD3 de células imunes no conjunto de dados HPA (A) e no conjunto de dados Monaco (B). (CI) Correlação dos níveis de expressão de mRNA de TMOD3 com a pureza do tumor na infiltração de câncer de ovário TCGA (C), linfócitos B (D), células T CD4+ (E), células T CD8+ (F), macrófagos (G), neutrófilos (H) e infiltração de células dendríticas (I). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Figura 7: Análise de correlação dos níveis de expressão de mRNA de TMOD3 com fatores imunorreguladores em pacientes com câncer de ovário. (A) O mapa de calor da correlação entre a expressão de mRNA de TMOD3 e imunorreguladores no câncer de ovário TCGA, incluindo inibidores imunológicos, imunoestimuladores, MHCs, quimiocinas e receptores. (BD) Análise de correlação dos níveis de expressão de mRNA de TMOD3 com pontos de verificação imunológicos como PD1 (B), PD-L1 (CD274) (C) e CTLA4 (D) em amostras de câncer de ovário TCGA. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Figura 8: Redes de co-expressão de TMOD3 no câncer de ovário. (A, B) Mapas de calor mostrando os 50 principais genes positivamente (A) e negativamente (B) correlacionados com TMOD3 em conjuntos de dados de câncer de ovário TCGA usando LinkedOmics. Vermelho e azul representam genes correlacionados positiva e negativamente, respectivamente. (C) Diagrama de Venn de 295 genes interagiram com TMOD3, e os 4774 genes correlacionados com TMOD3 no câncer de ovário TCGA. (D) Análise de enriquecimento funcional de 76 genes sobrepostos. O gráfico de bolhas demonstrou os 5 principais elementos significativamente enriquecidos em BP, CC e MF. (E) As vias TOP10 da análise de enriquecimento da via KEGG. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Figura 9: Previsão de medicamentos potenciais ou pequenas moléculas direcionadas ao TMOD3. (A) A previsão de medicamentos potenciais que têm como alvo o TMOD3 usando o banco de dados CTD, com o vermelho representando o medicamento, pode inibir o TMOD3. (BH) O banco de dados PubChem revela as estruturas moleculares de oito medicamentos direcionados. (B) Paracetamol, (C) ácido aristolóquico I, (D) bufalina, (E) Doxorrubicina, (F) Ácido fólico, (G) Haloperidol, (H) Toxina T-2. (I) Tetraclorodibenzodioxina. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura suplementar 1: Métodos para analisar os níveis de expressão de mRNA e proteína de TMOD3 em vários conjuntos de dados de câncer de ovário. (A) Análise da expressão de TMOD3 usando o banco de dados GEO. (B) Análise adicional dos dados extraídos do banco de dados GEO usando estatísticas e software gráfico. (C) Análise da expressão de TMOD3 usando o TNMplot. (D) Análise da expressão proteica usando o UALCAN. Clique aqui para baixar este arquivo.

Figura suplementar 2: Análise prognóstica usando plotter KM. Clique aqui para baixar este arquivo.

Figura suplementar 3: Análise de curvas ROC usando plotter ROC. Clique aqui para baixar este arquivo.

Figura Suplementar 4: Métodos para análise de mRNA-miRNA. (A) Previsão de miRNAs alvo TMOD3 usando TargetScan. (B) Análise de correlação de TMOD3 com miRNAs usando cBioportal. (C) Visualização da análise de correlação usando o Cytoscape. (D) Análise da expressão de miRNAs usando LinkedOmics. Clique aqui para baixar este arquivo.

Figura 5 suplementar: Métodos para análise de imunoinfiltração. (A) Análise da distribuição de TMOD3 em várias células imunes. (B) Análise de correlação de TMOD3 com infiltração imunológica usando cBioportal. (C) Análise de correlação de TMOD3 com imunomoduladores usando TISIDB. Clique aqui para baixar este arquivo.

Figura 6 suplementar: Previsão de genes interagidos com TMOD3 usando STRING. Clique aqui para baixar este arquivo.

Figura 7 suplementar: Anotação funcional usando DAVID. Clique aqui para baixar este arquivo.

Figura suplementar 8: Previsão de drogas direcionadas ao TMOD3 usando o banco de dados CTD. Clique aqui para baixar este arquivo.

Figura suplementar 9: Análise da estrutura molecular dos medicamentos usando o banco de dados PubChem. Clique aqui para baixar este arquivo.

Discussão

O citoesqueleto tem sido considerado essencial no desenvolvimento e progressão, tratamento e prognóstico de vários tumores52. Comparado com o TMOD1, que é restrito aos eritrócitos e ao sistema cardiovascular53, e o TMOD2, que é restrito ao sistema nervoso54, o TMOD3 tem uma distribuição ubíqua, o que torna o estudo do TMOD3 em tumores sistêmicos mais popular14,15,16,17,18,19. No entanto, ainda não existem estudos sobre o TMOD3 no câncer de ovário. Esta pesquisa descobriu a alta expressão de TMOD3 no câncer de ovário e analisou ainda mais seu papel na resistência à platina e infiltração imune tumoral no câncer de ovário.

O GEO é o principal banco de dados de expressão gênica totalmente disponível publicamente do mundo. Ao integrar os bancos de dados GEO e TCGA, este estudo demonstrou que o TMOD3 foi superexpresso no câncer de ovário a partir de vários conjuntos de dados independentes nos níveis de mRNA e proteína. A expressão gênica anormal é um mecanismo importante para o desenvolvimento do tumor55, e este estudo descobriu ainda que o TMOD3 foi significativamente associado a metástases, graus, estágios e prognóstico do câncer de ovário. Portanto, o TMOD3 desempenha um papel vital no câncer de ovário.

Estudos anteriores relataram que os genes relacionados ao citoesqueleto eram geralmente expressos de forma aberrante na apoptose desencadeada pela cisplatina, e o citoesqueleto de actina foi significativamente modificado7. De fato, como uma proteína que cobre as extremidades de crescimento lento (pontiagudas) dos filamentos de actina, o TMOD3 foi alterado após o tratamento com cisplatina e carboplatina, e a análise de termos GO e a análise de KEGG também demonstraram que o citoesqueleto de actina pode ser um mecanismo potencial para o TMOD3 afetar o processo no câncer de ovário. No entanto, o citoesqueleto é um processo biológico complexo, e este estudo demonstrou apenas que a expressão de TMOD3 foi afetada por drogas de platina. Se o TMOD3 é um alvo direto dos medicamentos de platina e se outros medicamentos quimioterápicos também alteram a expressão do TMOD3 deve ser comprovado por experimentos de biologia molecular. Neste estudo, a expressão de TMOD3 em pacientes com sensibilidade moderada à platina não foi significativamente alterada após quimioterapia à base de platina, enquanto TMOD3 diminuiu significativamente em pacientes altamente sensíveis. Com base na alta expressão de TMOD3 no câncer de ovário, é razoável especular que o TMOD3 está associado à resistência à platina no câncer de ovário. Usando conjuntos de dados experimentais in vitro e conjuntos de dados de pacientes, este estudo também descobriu que a expressão de TMOD3 foi significativamente maior em linhagens celulares de câncer de ovário resistentes à platina ou pacientes do que em pacientes sensíveis à platina. O diagnóstico tardio da doença e a recidiva da doença devido à quimiorresistência contribuíram para uma alta taxa de mortalidade no câncer de ovário 1,2. Foi relatado que o anti-TMOD3b-autoAb no soro demonstrou ter uma sensibilidade de ≥80% no diagnóstico de endometriose estágio I a II do rAFS e endometriose negativa para ultrassom56. Este estudo mostrou o TMOD3 como um marcador valioso para determinar a resistência à platina. No entanto, mais análises clínicas são necessárias para determinar se o TMOD3 é um biomarcador valioso em todos os casos em que a resistência à platina aparece em momentos diferentes ou em diferentes níveis.

A regulação pós-transcricional mediada por microRNA é um mecanismo importante para a expressão aberrante de genes associados à quimiorresistência34. Neste estudo, a análise de mRNA-miRNA revelou uma possível razão para a alta expressão de TMOD3 no câncer de ovário e no câncer de ovário resistente à platina. Foi demonstrado que o miR-133a aumentou a sensibilidade do câncer de mama à doxorrubicina ao regular negativamente a expressão de UCP-257 e aumentou a sensibilidade da linhagem celular de câncer de laringe humana ao regular negativamente a expressão de ATP7B58. Neste estudo, o miR-133a também foi direcionado ao TMOD3 e foi significativamente correlacionado negativamente com o TMOD3 nas amostras de câncer de ovário TCGA. A expressão de miR-133a em pacientes com câncer de ovário sensível à cisplatina também foi maior do que a de pacientes resistentes à cisplatina. Isso implica que o miR-133a pode mediar a resistência à cisplatina no câncer de ovário, influenciando a expressão de TMOD3 por meio da regulação pós-transcricional. O microRNA é considerado um fator valioso no diagnóstico do tumor por vários motivos. Primeiro, é viável detectar miRNAs em fluidos corporais, como sangue, urina, colostro e líquido pleural. Em segundo lugar, os miRNAs circulantes são muito estáveis nos fluidos corporais e não são afetados por RNases endógenos. Em terceiro lugar, os miRNAs circulantes carregam sinais patológicos de vários locais tumorais ou metastáticos, superando assim a questão da heterogeneidade do tumor59. Por exemplo, a imuno-histoquímica combinada com miR-133a plasmático pode melhorar significativamente a especificidade e a sensibilidade do diagnóstico precoce do câncer colorretal60. Portanto, a aplicação diagnóstica do miR133a na resistência à platina do câncer de ovário merece mais estudos.

Estudos sobre o papel do TMOD3 em células imunes são limitados. A análise de correlação entre a expressão de TMOD3 e a infiltração de células imunes no câncer de ovário não foi realizada anteriormente. Neste estudo, descobrimos que o TMOD3 foi positivamente correlacionado com o número de células imunes infiltrantes, como células T CD8+ e células dendríticas, nos tecidos tumorais. Relatos anteriores de nosso grupo demonstraram que o TMOD1 promove a maturação e a função imunológica das células dendríticas61, sugerindo que o TMOD3 pode desempenhar um papel semelhante no câncer de ovário. Além disso, a expressão de TMOD3 também foi positivamente correlacionada com a expressão de PD-L1, PDCD1 e CTLA4 neste estudo. Portanto, embora o TMOD3 esteja envolvido no recrutamento de células imunes para o tecido tumoral, ele também pode levar ao aumento da expressão de PD-L1, PDCD1 e CTLA4 na superfície das células tumorais, indicando que a alta expressão desse gene ainda tem um efeito supressor nas respostas imunes tumorais. É necessário investigar mais a fundo seu mecanismo e explorar a viabilidade de implementar imunoterapia no câncer de ovário quimiorresistente, interferindo na expressão de TMOD3.

Para explorar ainda mais a possibilidade de TMOD3 como um potencial alvo terapêutico no câncer de ovário quimiorresistente, este estudo analisou a interação entre o TMOD3 e os medicamentos existentes e descobriu que vários medicamentos poderiam reduzir a expressão do TMOD3. No entanto, é necessário mais suporte experimental, incluindo estudos clínicos pré-clínicos e prospectivos, para determinar se pacientes com câncer de ovário resistente a medicamentos com superexpressão de TMOD3 podem se beneficiar da inibição de TMOD3 ou se TMOD3 é um alvo terapêutico promissor.

O presente estudo tem várias limitações. Primeiro, a expressão e o significado prognóstico do TMOD3 foram investigados por meio de bancos de dados públicos on-line, e análises subsequentes são necessárias para validar esses resultados em experimentos celulares e animais. Em segundo lugar, experimentos in vitro e in vivo devem ser projetados para elucidar os mecanismos detalhados pelos quais o TMOD3 medeia a resistência à platina no câncer de ovário. Em terceiro lugar, pode ser melhor investigar o papel do TMOD3 em combinação com o sequenciamento de célula única para evitar a heterogeneidade das células cancerígenas.

Em resumo, esses resultados descobriram que a expressão de TMOD3 é regulada positivamente no câncer de ovário resistente a medicamentos pela primeira vez. Este estudo também explorou preliminarmente seus mecanismos potenciais e seu potencial como alvo terapêutico.

Divulgações

Os autores relatam não haver conflito de interesses.

Agradecimentos

Este trabalho foi apoiado por doações da Fundação Nacional de Ciências Naturais da China (nº 32171143, 31771280) e doações da Fundação de Ciências Naturais do Departamento de Educação da Província de Jiangsu (nº 18KJD360003, 21KJD320004).

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
cBioportalMemorial Sloan Kettering Cancer CenterAnálise de correlação de  TMOD3 com miRNAs direcionados (https://www.cbioportal.org)
Banco de dados CTDEstadualPara analisar as relações entre química, genes, fenótipo, doença e ambiente (https://ctdbase.org/)
CytoscapeInstituto Nacional de Ciências Médicas Gerais dos Institutos Nacionais de Integração de Dados da Rede deSaúde (www.cytoscape.org/)
DAVIDFrederick Laboratório Nacional de Pesquisado Câncer Um conjunto abrangente de ferramentas de anotação funcional para os investigadores entenderem o significado biológico por trás de grandes listas de genes(https://david.ncifcrf.gov/)
GEONCBIAnálise de expressão gênica (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/
HPAKnut & Fundação Alice WallenbergO banco de dados do Atlas de Proteínas Humanas (HPA) ajudou a analisar a distribuição de TMOD3 em várias células imunes (https://www.proteinatlas.org/)
Departamento de Bioinformática da UniversidadeSemmelweis Análise Prognóstica (https://kmplot.com/analysis/)
LinkedOmicsBaylor College of MedicineUma plataforma para biólogos e clínicos acessarem, analisarem e compararem dados multiômicos de câncer dentro e entre tipos de tumores (http://www.linkedomics.org/)
Banco de dados PubChemBiblioteca Nacional de Medicinados EUAPara determinar a estrutura molecular definitiva do medicamento
ROC Plotter  Departamento de Bioinformática da UniversidadeValidação do gene de interesse como marcador preditivo (http://www.rocplot.org/)
STRINGInstituto Suíço de BioinformáticaAnálise de redes de coexpressão(https://string-db.org)
TargetScanWhitehead Institute for Biomedical ResearchPrevisão de alvos de miRNA (www.targetscan.org/)
TIMERHarvard UniversidadeAnálise sistemática de infiltrados imunológicos em diversos tipos de câncer (https://cistrome.shinyapps.io/timer/)
TISIDBUniversidade de Hong KongUm portal da web para interação entre tumor e sistema imunológico(http://cis.hku.hk/TISIDB/)
TNMplotDepartamento de Bioinformática da UniversidadeAnálise de expressão gênica (https://www.tnmplot.com/
UALCANA Universidade de Alabama em Birmingham Análise da expressão gênica (http://ualcan.path.uab.edu)
Universidade da Carolina do Norte )KM-plotter  Semmelweis Semmelweis )

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Superexpressão de tropomodulina 3 como marcador de resistência à platina e infiltração imunológica no câncer de ovário
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