Artigo de método

Isolamento Químico por Afinidade de Vesículas Extracelulares de Biofluidos para Análise Proteômica e Fosfoproteômica

DOI:

10.3791/65844

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27 de outubro de 2023

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1Department of Biochemistry, Purdue University, 2Tymora Analytical Operations, 3Department of Chemistry, Purdue University, 4Purdue Institute for Cancer Research, Purdue University

Neste artigo

Resumo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

O presente protocolo fornece descrições detalhadas para o isolamento eficiente de vesículas extracelulares urinárias utilizando esferas magnéticas funcionalizadas. Além disso, engloba análises subsequentes, incluindo western blotting, proteômica e fosfoproteômica.

Resumo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Vesículas extracelulares (EVs) de biofluidos têm recentemente ganhado atenção significativa no campo da biópsia líquida. Liberados por quase todos os tipos de células, eles fornecem um instantâneo em tempo real das células hospedeiras e contêm uma riqueza de informações moleculares, incluindo proteínas, em particular aquelas com modificações pós-traducionais (PTMs), como a fosforilação, como o principal ator das funções celulares e do início e progressão da doença. No entanto, o isolamento de EVs de biofluidos permanece desafiador devido aos baixos rendimentos e impurezas dos métodos atuais de isolamento de EV, dificultando a análise a jusante de cargas de EV, como fosfoproteínas de EV. Aqui, descrevemos um método rápido e eficaz de isolamento de EV baseado em esferas magnéticas funcionalizadas para isolamento de EV de biofluidos como urina humana e análise proteômica a jusante e fosfoproteômica após isolamento de EV. O protocolo possibilitou um alto rendimento de recuperação de EVs urinários e perfis sensíveis de proteoma EV e fosfoproteoma. Além disso, a versatilidade deste protocolo e considerações técnicas relevantes também são abordadas aqui.

Introdução

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As vesículas extracelulares (EVs) são nanopartículas encapsuladas em membrana secretadas por todos os tipos de células e estão presentes em biofluidos como sangue, urina, saliva, etc.1,2,3,4. Os EVs carregam uma carga de diversas moléculas bioativas que refletem o estado fisiológico e patológico de suas células hospedeiras e, portanto, funcionam como fatores cruciais na progressão da doença 4,5,6. Além disso, extensos estudos estabeleceram que marcadores da doença baseados em EV podem ser identificados antes do início dos sintomas ou da detecção fisiológica de tumores5,6,7.

A fosforilação atua como um mecanismo chave na sinalização e regulação celular. Portanto, as fosfoproteínas fornecem uma fonte valiosa para a descoberta de biomarcadores, uma vez que eventos aberrantes de fosforilação estão associados a vias de sinalização celular desreguladas e ao desenvolvimento de doenças metastáticas, como o câncer8,9,10. Embora a dinâmica de fosforilação do perfil permita a identificação de assinaturas de fosfoproteínas doença-específicas como potenciais biomarcadores, a baixa abundância e a natureza dinâmica das fosfoproteínas representam grandes desafios no desenvolvimento de fosfoproteínas como biomarcadores11,12. Notavelmente, as fosfoproteínas pouco abundantes encapsuladas em EVs são protegidas da digestão enzimática externa no ambiente extracelular8. Consequentemente, EVs e fosfoproteínas derivadas de EV oferecem uma fonte ideal para a descoberta de biomarcadores na detecção em estágio inicial de câncer e outras doenças.

Embora a análise da fosforilação de proteínas em EVs ofereça um recurso valioso para a compreensão da sinalização do câncer e do diagnóstico de doenças em estágio inicial, a falta de métodos eficientes de isolamento de EV apresenta uma grande barreira. O isolamento da EV é comumente obtido por ultracentrifugação diferencial (DUC)13. No entanto, esse método é demorado e não é adequado para implicações clínicas devido ao baixo rendimento e à baixa reprodutibilidade13,14. Abordagens alternativas de isolamento de EV, como a precipitação induzida por polímero15, são limitadas pela baixa especificidade devido à co-precipitação de proteínas não-EV. Abordagens baseadas em afinidade, incluindo captura de afinidade baseada em anticorpos16 e filtração por afinidade17, oferecem especificidade aprimorada, mas são restritas a uma taxa de recuperação relativamente baixa devido ao pequeno volume.

Para abordar as questões na exploração da dinâmica de fosfoproteínas em EVs, nosso grupo desenvolveu a técnica de recuperação e purificação total de vesículas extracelulares (EVtrap) baseada na afinidade química para capturar EVs em esferas magnéticas funcionalizadas18. Resultados anteriores demonstraram que este método de isolamento de EV baseado em esferas magnéticas é altamente eficaz no isolamento de EVs de uma ampla gama de amostras de biofluidos e é capaz de alcançar um rendimento de EV muito maior, minimizando a contaminação em comparação com o DUC e outros métodos de isolamento existentes18,19. Utilizamos com sucesso o EVtrap e um método de enriquecimento de fosfopeptídeos à base de titânio desenvolvido por nosso grupo20 para traçar o perfil do fosfoproteoma de EVs derivados de diversos biofluidos e detectar potenciais biomarcadores de fosfoproteínas para várias doenças 19,21,22.

Aqui, apresentamos um protocolo baseado no EVtrap para o isolamento de EVs circulantes. O protocolo se concentra nos EVs urinários. Nós também demonstramos a caracterização de EVs isolados usando western blotting. Em seguida, detalhamos a preparação da amostra e a aquisição por espectrometria de massas (MS) para análises proteômicas e fosfoproteômicas. Esse protocolo fornece um fluxo de trabalho eficiente e reprodutível para o perfil do proteoma urinário do EV e do fosfoproteoma, o que facilitará estudos adicionais sobre EVs e suas aplicações clínicas23.

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Protocolo

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Todas as amostras de urina foram coletadas de indivíduos saudáveis após consentimento informado. Os experimentos estavam em conformidade com todos os padrões éticos envolvendo amostras humanas e em conformidade com as diretrizes do Programa de Proteção à Pesquisa em Seres Humanos da Universidade de Purdue.

1. Coleta de amostras

  1. Centrifugar 12 mL de amostra de urina em um tubo de centrífuga cônica de 15 mL por 10 min a 2.500 x g, 4 °C para remover restos celulares e grandes corpos apoptóticos.
  2. Transfira 10 mL do sobrenadante para um novo tubo de 15 mL e prossiga com o isolamento EV.
    NOTA: O protocolo pode ser pausado aqui, e as amostras podem ser armazenadas a -80 °C e descongeladas a 37 °C após o uso.

2. Isolamento de EV usando a abordagem EVtrap

  1. Adicionar 0,5 ml de tampão de carga (relação 1:10 v/v) e 100 μL de pasta de esferas EVtrap (relação 1:50 v/v) à amostra de acordo com as instruções do fabricante.
  2. Incubar a amostra por rotação de ponta a ponta durante 30 minutos à temperatura ambiente.
  3. Pastilhar a amostra colocando o tubo cônico de 15 mL em um rack separador magnético. Remova o sobrenadante.
  4. Ressuspender as esferas em 1 mL de tampão de lavagem e transferir a suspensão para um tubo de microcentrífuga de 1,5 mL. Pipetar suavemente para ressuspender as contas ligadas ao EV.
  5. Coloque o tubo em um rack separador magnético de tubo de microcentrífuga de 1,5 mL e aspirar o sobrenadante. Use uma pipeta P200 para aspirar completamente o sobrenadante e evitar aspirar as contas.
  6. Lave as contas com 1 mL de tampão de lavagem. Adicione o tampão imediatamente após aspirar o sobrenadante para evitar que as contas sequem.
  7. Lavar as esferas 2x com 1 mL de solução salina tamponada com fosfato (PBS) à temperatura ambiente.
  8. Incubar as esferas com 100 μL de trietilamina 100 mM recém-preparada durante 10 minutos à temperatura ambiente e recolher a solução eluída contendo EV utilizando um separador magnético de tubo de microcentrífuga de 1,5 ml.
    NOTA: Para preparar 1 mL de trietilamina 100 mM, diluir 14 μL de solução de trietilamina em água.
  9. Repetir o passo 2.8 e combinar as soluções eluídas. Secar o eluato utilizando um concentrador centrífugo a vácuo a 4 °C.
    NOTA: O experimento pode ser pausado aqui. As amostras secas de EV podem ser armazenadas a -80 °C durante vários meses sem efeitos adversos nas etapas seguintes ou nos resultados.

3. Caracterização de EVs por western blotting

  1. Ressuspender 5% da amostra de EV seca (equivalente a 0,5 mL da amostra de urina) em 20 μL de tampão de amostra 1x dodecil sulfato de lítio (LDS) com 10 mM de ditiotreitol (TDT).
    NOTA: EVs de 0,5 mL de urina são suficientes para detectar o sinal CD9 (um marcador EV24) no western blotting.
  2. Ferver a amostra durante 5 min a 95 °C. Carregar a amostra em gel de poliacrilamida e realizar eletroforese e immunoblotting seguindo protocolos padronizados25.
  3. Após a transferência das proteínas para uma membrana de fluoreto de polivinilideno (PVDF) de baixa fluorescência, bloquear a membrana com albumina de soro bovino (BSA) a 1% em solução salina tamponada trefóide-20 (TBST) por 1 h à temperatura ambiente. Para preparar 1 L de tampão TBST, adicionar 19 mM Tris base, 137 mM NaCl e 1 mL de Tween-20; ajustar o pH para 7,4 usando HCl.
  4. Incubar a membrana com anticorpo anti-CD9 de coelho na proporção de 1:5.000 em BSA a 1% em TBST a 4 °C durante a noite ou por 2 h à temperatura ambiente.
  5. Lave a membrana 3x por 5 min cada com TBST. Incubar a membrana com IgG anti-coelho, anticorpo secundário ligado à HRP na proporção de 1:5000 em BSA a 1% em TBST por 1 h à temperatura ambiente.
  6. Lave a membrana 3x por 5 min cada com TBST. Adicione os substratos de quimioluminescência aprimorada (ECL) obtidos comercialmente (proporção 1:1) à membrana e detecte sinais em um sistema de imagem por quimioluminescência.

4. Preparo de amostras para análise proteômica e fosfoproteômica

  1. Preparar tampão de lise fresco contendo 12 mM de desoxicolato de sódio (SDC), 12 mM de lauroyl sarcosinato de sódio (SLS), 100 mM tampão de bicarbonato de trietilamónio (TEAB), 10 mM de tris-(2-carboxietil)fosfina (TCEP), 40 mM de cloroacetamida (CAA) e 1x cocktails de inibidores de fosfatase.
    NOTA: As soluções de estoque estão listadas na descrição da Tabela de Materiais. O tampão de lise é preparado adicionando as soluções-mãe para atingir as concentrações desejadas dependendo do volume necessário.
  2. Solubilizar a amostra de EV seca em 100 μL de tampão de lise e aquecer a amostra durante 10 min a 95 °C com agitação a 1.100 rpm.
  3. Depois de arrefecer a amostra à temperatura ambiente, diluir-a cinco vezes adicionando 400 μL de TEAB 50 mM.
  4. Meça a concentração de proteína usando um kit de ensaio de BCA de acordo com as instruções do fabricante. Use o tampão de lise diluído cinco vezes com TEAB 50 mM como branco.
  5. Adicionar a mistura de tripsina/Lis-C a 1:50 p/p de relação enzima/proteína e incubar a amostra a 37 °C durante a noite com agitação a 1.100 rpm.
  6. Adicionar 50 μL de ácido trifluoroacético (TFA) a 10% para acidificar a amostra.
  7. Adicionar 600 μL de acetato de etila às amostras e agitar a mistura durante 2 min.
  8. Centrifugar a amostra por 3 min a 20.000 x g e remover a camada superior (camada orgânica). Evite perturbar a interface durante a aspiração.
  9. Repita as etapas 4.7-4.8. Secar a fase aquosa usando um concentrador centrífugo a vácuo.
  10. Ressuspender a amostra seca em 200 μL de TFA 0,1% para acidificar peptídeos e dessalgar a amostra usando uma ponta de dessalinização C18 de acordo com as instruções do fabricante. Condicionar a ponta com 200 μL de TFA 0,1% em acetonitrila a 80%, seguido de 2x com 200 μL de TFA 0,1%. Coloque a amostra de peptídeo acidificado na ponta e, em seguida, lave a ponta 3x com 200 μL de TFA 0,1%. Eluir os peptídeos com 200 μL de TFA 0,1% em acetonitrila a 80%.
  11. Secar o eluato usando um concentrador centrífugo a vácuo. Secar 2% da amostra de peptídeo (equivalente a 0,2 mL da amostra de urina) separadamente para análise proteômica. Utilizar o restante (98%) da amostra para análise fosfoproteômica.
  12. Enriqueça os fosfopeptídeos da amostra usando um kit de enriquecimento de fosfopeptídeos de acordo com as instruções do fabricante. Execute as etapas descritas abaixo para enriquecimento.
    1. Ressuspender a amostra seca em 200 μL de tampão de carga. Adicionar 50 μL das contas à amostra e agitar vigorosamente durante 20 minutos à temperatura ambiente. Coloque a amostra com as contas na ponta frita e centrifuja por 1 min a 100 x g.
    2. Lavar a ponta com 200 μL de tampão de carga, seguido de lavar o tampão de lavagem 1 e, em seguida, lavar o tampão 2. Execute as três etapas de lavagem centrifugando uma vez por 2 min a 20 x g e uma vez por 1 min a 100 x g.
    3. Coloque a ponta com contas em um novo tubo para coletar os fosfopeptídeos eluídos. Adicionar 50 μL de tampão de eluição à ponta e centrifugar uma vez por 2 min a 20 x g. Adicionar mais 50 μL de tampão de eluição à ponta e centrifugar uma vez por 2 min a 20 x g. Centrifugar uma última vez por 1 min a 100 x g.
  13. Secar os fosfopeptídeos eluídos usando um concentrador centrífugo a vácuo.

5. Análise de LC-MS/MS

NOTA: Diferentes sistemas/configurações LC-MS/MS e métodos de aquisição de dados, como aquisição dependente de dados (DDA) podem ser usados.

  1. Ressuspender as amostras secas de proteoma/fosfoproteoma em ácido fórmico a 0,1% (solvente A) e carregar as amostras de acordo com as instruções do fabricante.
  2. Injetar as amostras em MS de tempo de voo de mobilidade iônica aprisionada através do sistema de cromatografia líquida (LC) e usar o método padronizado predefinido Whisper 40 amostras por dia. Os peptídeos são separados em uma coluna C18 de 15 cm (75 μm de diâmetro interno, tamanho de partícula de 1,9 μm) conforme mencionado na Tabela de Materiais.
  3. Para análise proteômica, adquira dados usando um método de aquisição de acumulação paralela-fragmentação seriada combinado com aquisição independente de dados (dia-PASEF) com uma faixa de massa por rampa abrangendo de 300-1200 m/z e de 0,6-1,50 1/K0 com um tempo de ciclo de 1,38 s.
  4. Para a análise fosfoproteômica, adquirir dados usando um método de aquisição dia-PASEF com uma faixa de massa por rampa abrangendo de 400-1550 m/z e 0,6-1,50 1/K0 com um tempo de ciclo de 1,38 s.
  5. Carregue os arquivos brutos no software proteomics e execute a extração, identificação e quantificação de sinais usando um fluxo de trabalho de aquisição independente de dados sem biblioteca.
    1. Para configurações de pesquisa, use o banco de dados do Homo sapiens , tipos específicos de digestos com enzimas tripsina/P, 7 comprimentos mínimos de peptídeos, 52 comprimentos máximos de peptídeos, duas clivagens perdidas, carbamidometil em cisteína como modificação fixa, proteína acetil N-termo, oxidação em metionina e fosforilação em serina, treonina e tirosina (para análise fosfoproteômica) como modificações variáveis e 5 como modificações variáveis máximas. Defina o FDR no PSM, peptídeo e grupo de proteínas como 0,01.
      NOTA: O software Spectronaut foi utilizado neste protocolo. Outros softwares de busca de dados DIA, como DIA-NN e PEAKS, também são comumente usados. Se os dados foram adquiridos no modo DDA, softwares como MaxQuant e Proteome Discoverer são aplicáveis.

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Resultados

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Este protocolo demonstra um fluxo de trabalho abrangente desde o isolamento de EVs até análises proteômicas e fosfoproteômicas a jusante (Figura 1). As amostras de urina em triplicata foram submetidas ao isolamento EV. Os EVs isolados foram caracterizados por western blotting e subsequentemente processados para preparação de amostras proteômicas baseadas em espectrometria de massa, incluindo extração de proteínas, digestão enzimática e limpeza de peptídeos. Para a análise fosfoproteômica, os...

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Discussão

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O isolamento eficaz de EV é um pré-requisito essencial para detectar proteínas e fosfoproteínas pouco abundantes em EVs. Apesar do desenvolvimento de inúmeros métodos para suprir essa necessidade, a maioria ainda sofre de limitações como má recuperação ou baixa reprodutibilidade, que impedem sua utilização em estudos em larga escala e cenários clínicos de rotina. O DUC é geralmente considerado o método mais comum para o isolamento de EV, e as etapas adicionais de lavagem são normalmente aplicadas para ajudar a aumentar a...

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Divulgações

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Os autores declaram um interesse financeiro concorrente. Anton Iliuk e W. Andy Tao são co-fundadores da Tymora Analytical Operations, que desenvolveu contas EVtrap e comercializou o kit de enriquecimento de fosfopeptídeos PolyMAC.

Agradecimentos

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Este trabalho foi financiado em parte pelos subsídios do NIH 3RF1AG064250 e R44CA239845.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Tubo de microcentrífuga de 1,5 mLde Ciências da VidaM-1700C-LB
Rack separador magnético de tubo de 1,5 mLSergi Lab Supplies1005
Tubo de centrífuga cônico de 15 mLCorning 
Rack separador magnético de tubo de 15 mLSergi Lab Supplies1002
IgG anti-coelho, tecnologia de sinalização celular de anticorpos ligada a HRP7074P2
agitador incubado de bancadaBioerDIS-87999-3367802Bloco de mistura de termocélulas Bioer MB-101
CD9 (D3H4P) Tecnologiade sinalização de células13403S
CloroacetamidaSigma -AldrichC0267-100GUsado para alquilação de grupos de sulfeto reduzidos. Preparar 400 mM em água como solução reserva.
Acetato de etila Fisher Scientific E145-4Detergentes precipitados
Evosep One Sistema de cromatografia líquidaEvosep
EvotipsEvosepEV2013Carregamento de amostras para o sistema Evosep One 
EVtrapTymora AnalyticalContas magnéticas funcionalizadas, buffer de carregamento e buffer de lavagem 
Membrana Immobilon-FL PVDFSigma -AldrichIPFL00010Membrana Blotting 
NuPAGE 4-12% Bis-Tris GelInvitrogenNP0322BOXInvitrogen NuPAGE 4 a 12%, Bis-Tris, 1.0 mm, Mini Protein Gel, 12-well
NuPAGE LDS Sample Buffer (4X)InvitrogenNP0007
PBSThermoFisher10010023
Pepsep C18 15 x 75 x 1.9Bruker 1893473Coluna de separação 
Coquetel Inibidor de Fosfatase 2Sigma -AldrichP5726-5ML100X, Inibidor de fosfatase.
Coquetel Inibidor de Fosfatase 3Sigma -AldrichP0044-1ML100X,  Inibidor de fosfatase. 
Kit de Ensaio de Proteína BCA PierceThermoFisher23225
Substrato de Western Blotting Pierce ECLThermoFisher32106Substrato HRP 
Kit de enriquecimento de fosfopeptídeos PolyMACTymora AnalyticalCaptura de afinidade de íons metálicos à base de polímeros (PolyMAC) para enriquecimento de fosfopeptídeos
Desoxicolato de sódio Sigma -AldrichD6750-10GDetergente para tampão de lise. Preparar 120 mM em água como solução reserva.
Lauroil sarcosinato de sódioSigma -AldrichL9150-50GDetergente para tampão de lise. Preparar 120 mM em água como solução reserva.
timsTOF HTBrukerEspectrometria de massa de tempo de voo de mobilidade iônica presa
TopTip C-18 (10-200 μ L) dicas GlygenTT2C18.96Método de dessalinização
TrietilaminaSigma -Aldrich471283-100MLPara eluição EV. 
Tampão de bicabonato de trietilamônioSigma -AldrichT7408-100ML1 M
Ácido trifluoroacéticoSigma -Aldrich302031-100ML
Cloridrato de tris-(2-carboxietil)fosfinaSigma -AldrichC4706Usado para redução de ligações dissulfeto. Preparar 200 mM em água como solução reserva. Alíquota da solução estoque em um pequeno volume e armazene-a em 20 graus; C (evite vários ciclos de congelamento e descongelamento).
Tripsina / Lys-C MIXThermoFisherPIA41007
Produtos 352097 mAb de coelho

Referências

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  1. Abels, E. R., Breakefield, X. O. Introduction to extracellular vesicles: Biogenesis, RNA cargo selection, content, release, and uptake. Cell Mol Neurobiol. 36 (3), 301-312 (2016).
  2. Maacha, S., et al. Extracellular vesicles-mediated intercellular communication: roles in the tumor microenvironment and anti-cancer drug resistance. Mol Cancer. 18 (1), 55(2019).
  3. van Niel, G., D’Angelo, G., Raposo, G. Shedding light on the cell biology of extracellular vesicles. Nat Rev Mol Cell Biol. 19 (4), 213-228 (2018).
  4. Becker, A., et al. extracellular vesicles in cancer: cell-to-cell mediators of metastasis. Cancer Cell. 30 (6), 836-848 (2016).
  5. Bebelman, M. P., Smit, M. J., Pegtel, D. M., Baglio, S. R. Biogenesis and function of extracellular vesicles in cancer. Pharmacol Ther. 188, 1-11 (2018).
  6. Urabe, F., et al. Extracellular vesicles as biomarkers and therapeutic targets for cancer. Am J Physiol Cell Physiol. 318 (1), C29-C39 (2020).
  7. Chang, W. H., Cerione, R. A., Antonyak, M. A. Extracellular Vesicles and Their Roles in Cancer Progression. Methods Mol Biol. 2174, 143-170 (2021).
  8. Chen, I. H., et al. Phosphoproteins in extracellular vesicles as candidate markers for breast cancer. Proc Natl Acad Sci U S A. 114 (12), 3175-3180 (2017).
  9. Harsha, H. C., Pandey, A. Phosphoproteomics in cancer. Mol Oncol. 4 (6), 482-495 (2010).
  10. Singh, V., et al. Phosphorylation: Implications in Cancer. Protein J. 36 (1), 1-6 (2017).
  11. Delom, F., Chevet, E. Phosphoprotein analysis: from proteins to proteomes. Proteome Sci. 4, 15(2006).
  12. Thingholm, T. E., Jensen, O. N., Larsen, M. R. Analytical strategies for phosphoproteomics. Proteomics. 9 (6), 1451-1468 (2009).
  13. Taylor, D. D., Shah, S. Methods of isolating extracellular vesicles impact down-stream analyses of their cargoes. Methods. 87, 3-10 (2015).
  14. Witwer, K. W., et al. Standardization of sample collection, isolation and analysis methods in extracellular vesicle research. J Extracell Vesicles. 2, (2013).
  15. Zeringer, E., et al. Methods for the extraction and RNA profiling of exosomes. World J Methodol. 3 (1), 11-18 (2013).
  16. Mathivanan, S., et al. Proteomics analysis of A33 immunoaffinity-purified exosomes released from the human colon tumor cell line LIM1215 reveals a tissue-specific protein signature. Mol Cell Proteomics. 9 (2), 197-208 (2010).
  17. Enderle, D., et al. Characterization of RNA from exosomes and other extracellular vesicles isolated by a novel spin column-based method. PLoS ONE. 10 (8), e0136133(2015).
  18. Wu, X., Li, L., Iliuk, A., Tao, W. A. Highly Efficient Phosphoproteome Capture and Analysis from Urinary Extracellular Vesicles. J Proteome Res. 17 (9), 3308-3316 (2018).
  19. Iliuk, A., et al. Plasma-derived extracellular vesicle phosphoproteomics through chemical affinity purification. J Proteome Res. 19 (7), 2563-2574 (2020).
  20. Iliuk, A. B., Martin, V. A., Alicie, B. M., Geahlen, R. L., Tao, W. A. In-depth analyses of kinase-dependent tyrosine phosphoproteomes based on metal ion-functionalized soluble nanopolymers. Mol Cell Proteomics. 9 (10), 2162-2172 (2010).
  21. Hadisurya, M., et al. Quantitative proteomics and phosphoproteomics of urinary extracellular vesicles define diagnostic and prognostic biosignatures for Parkinson’s Disease. Commun Med. 3 (1), 64(2023).
  22. Hadisurya, M., et al. Data-independent acquisition phosphoproteomics of urinary extracellular vesicles enables renal cell carcinoma grade differentiation. Mol Cell Proteomics. 22 (5), 100536(2023).
  23. Wu, X., Liu, Y. K., Iliuk, A. B., Tao, W. A. Mass spectrometry-based phosphoproteomics in clinical applications. Trends Analyt Chem. 163, 117066(2023).
  24. Mathieu, M., et al. Specificities of exosome versus small ectosome secretion revealed by live intracellular tracking of CD63 and CD9. Nat Commun. 12 (1), 4389(2021).
  25. Mahmood, T., Yang, P. C. Western blot: technique, theory, and trouble shooting. N Am J Med Sci. 4 (9), 429-434 (2012).
  26. Keerthikumar, S., et al. ExoCarta: A web-based compendium of exosomal cargo. J Mol Biol. 428 (4), 688-692 (2016).
  27. Théry, C., Amigorena, S., Raposo, G., Clayton, A. Isolation and characterization of exosomes from cell culture supernatants and biological fluids. Curr Protoc Cell Biol. 3 (22), (2006).
  28. Livshits, M. A., et al. Isolation of exosomes by differential centrifugation: Theoretical analysis of a commonly used protocol. Sci Rep. 5, 17319(2015).
  29. Konoshenko, M. Y., Lekchnov, E. A., Vlassov, A. V., Laktionov, P. P. Isolation of extracellular vesicles: general methodologies and latest trends. BioMed Res Int. 2018, (2018).
  30. Webber, J., Clayton, A. How pure are your vesicles. J Extracell Vesicles. 2, (2013).
  31. Erdjument-Bromage, H., Huang, F. K., Neubert, T. A. Sample preparation for relative quantitation of proteins using tandem mass tags (TMT) and mass spectrometry (MS). Methods Mol Biol. 1741, 135-149 (2018).
  32. Charles Jacob, H. K., et al. Identification of novel early pancreatic cancer biomarkers KIF5B and SFRP2 from “first contact” interactions in the tumor microenvironment. J Exp Clinl Cancer Res. 41 (1), 258(2022).
  33. Nunez Lopez, Y. O., et al. Extracellular vesicle proteomics and phosphoproteomics identify pathways for increased risk in patients hospitalized with COVID-19 and type 2 diabetes mellitus. Diabetes Res Clin Pract. 197, 110565(2023).
  34. Hinzman, C. P., et al. A multi-omics approach identifies pancreatic cancer cell extracellular vesicles as mediators of the unfolded protein response in normal pancreatic epithelial cells. J Extracell Vesicles. 11 (6), e12232(2022).
  35. Kornilov, R., et al. Efficient ultrafiltration-based protocol to deplete extracellular vesicles from fetal bovine serum. J Extracell Vesicles. 7 (1), 1422674(2018).
  36. Willms, E., et al. Cells release subpopulations of exosomes with distinct molecular and biological properties. Sci Rep. 6, 22519(2016).
  37. Searle, B. C., et al. Generating high quality libraries for DIA MS with empirically corrected peptide predictions. Nat Commun. 11 (1), 1548(2020).
  38. Skowronek, P., et al. Rapid and in-depth coverage of the (Phospho-)proteome with deep libraries and optimal window design for dia-PASEF. Mol Cell Proteomics. 21 (9), 100279(2022).

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