Microscopia de dois fótons para o estudo de tendões

Resumo

Este artigo descreve o processo de preparação, configuração e imagem de tendões usando microscopia multifotônica. Além disso, abrange a aplicação de SHG para analisar o alinhamento das fibrilas de colágeno e a criação de uma representação 3D dos tendões. Esta metodologia se mostra altamente valiosa na caracterização das células tendíneas e sua ECM durante a lesão e o desenvolvimento.

Resumo

A microscopia de dois fótons surgiu como uma ferramenta potente para avaliar células de tecidos profundos e caracterizar o alinhamento da matriz extracelular (MEC) em vários sistemas biológicos. Essa técnica depende de interações não lineares luz-matéria para detectar dois sinais distintos: o sinal de difusão gerado pelo segundo harmônico (SHG), que facilita a visualização das fibras de colágeno e sua orientação, e o sinal de excitação do infravermelho próximo para imagens de autofluorescência excitada ultravioleta.

A imagem SHG mostra-se especialmente eficaz na visualização de fibras de colágeno devido à estrutura cristalina não centrossimétrica do colágeno fibrilar I. Dado que os tendões são tecidos ricos em matriz com um número limitado de células, seu alto teor de colágeno os torna candidatos ideais para análise usando microscopia de dois fótons. Consequentemente, a microscopia de dois fótons oferece um meio valioso para analisar e caracterizar anormalidades do colágeno nos tendões. Sua aplicação se estende ao estudo do desenvolvimento, lesões, cicatrização e envelhecimento do tendão, permitindo a caracterização abrangente das células tendíneas e suas interações com a ECM sob várias condições usando ferramentas de microscopia de dois fótons. Este protocolo descreve o uso da microscopia de dois fótons na biologia tendínea e apresenta uma metodologia adaptada para obter imagens e caracterização eficazes das células tendíneas durante o desenvolvimento e após a lesão. O método permite a utilização de cortes microscópicos finos para criar uma imagem abrangente da ECM dentro dos tendões e das células que interagem com essa matriz. Mais notavelmente, o artigo mostra uma técnica para gerar imagens 3D usando microscopia de dois fótons em modelos animais.

Introdução

Para funcionar adequadamente e transmitir força do músculo para o osso¹, os tendões dependem das ligações intermoleculares e intramoleculares entre as fibras de colágeno. A intrincada automontagem, reticulação e alinhamento das fibras colágenas resultam no estabelecimento de uma matriz altamente organizada que contribui para a resistência biomecânica e flexibilidade do tecido tendíneo ^2,3,4. Embora outras proteínas da MEC também contribuam para a estabilidade da rede fibrilar nos tendões⁵, a massa seca do tendão é de aproximadamente 86% de colágeno⁶, sendo que o colágeno I representa 96% do conteúdo total de colágeno ^7,8. Em última análise, isso torna a estrutura do colágeno uma saída chave da saúde e função normais do tendão.

Algumas modalidades de imagem clínica usadas para tendões são ressonância magnética e/ou ultrassom. Embora a tecnologia de ultrassom forneça imagens da estrutura fascicular do tendão e revele parte da estrutura fibrilar do tecido⁹, a resolução não é ideal para quantificação. A ressonância magnética tem melhor resolução espacial do que a imagem de ultrassom, mas ainda é limitada. No entanto, esses métodos também são limitados em sua profundidade potencial de imagem através de um tecido. Em uma escala mais micrométrica, a dispersão de luz de pequena e grande angular e a microscopia confocal podem ser usadas para avaliar a estrutura das fibrilas de colágeno e quaisquer anormalidades potenciais.

Em contraste, a microscopia de geração de segundo harmônico (SHG) difere de outros métodos de imagem, pois pode capturar a camada externa das fibrilas de colágeno. As fibrilas de colágeno I nos tendões são organizadas de forma paralela uniaxial através da MEC do tendão e são de natureza não centrossimétrica ^4,10. Essas propriedades podem ser aproveitadas para imagens usando um microscópio multifotônico, que pode produzir imagens nítidas que são até 2-3 vezes mais profundas do que a imagem confocal¹¹. Isso também nos permite gerar seções ópticas de melhor qualidade do tendão. Quando a luz é projetada na amostra de interesse, um sinal SHG é produzido e essa dispersão de luz pode ser capturada. Nos tendões, isso produz uma imagem da estrutura e alinhamento do colágeno, permitindo-nos avaliar possíveis consequências morfológicas e patológicas de tendinopatias, lesões, etc.

Como o colágeno compõe a maior parte da massa seca do tendão e contribui para a função do tendão ^6,12, a ruptura da estrutura do colágeno pode afetar as propriedades biomecânicas dos tendões. Assim, analisar sua estrutura pode nos ajudar a entender melhor o impacto e a gravidade das lesões, além de criar uma métrica para a eficácia da cicatrização. Este artigo revisa um método que usa microscopia multifotônica e SHG para analisar como o desenvolvimento e as lesões afetam a estrutura e o alinhamento das fibrilas de colágeno I e para gerar imagens 3D da MEC do tendão em modelos animais. Portanto, nosso método para obter imagens de tendões pode ajudar os pesquisadores a caracterizar as células tendíneas e a ECM durante o desenvolvimento ou após a lesão.

Protocolo

Todos os experimentos com animais foram realizados de acordo com o Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais (IACUC) (Protocolo #2013N0000062) e as diretrizes da AAALAC no Massachusetts General Hospital. BHLHE40 camundongos fêmeas nocaute nulo ou heterozigotos em um fundo Scx-GFP, com idade de 30 dias, foram usados para o presente estudo. Os animais foram obtidos de uma fonte comercial (ver Tabela de Materiais).

1. Preparação e fixação de tecidos

1. Para preparar o tecido, eutanasiar camundongos em uma câmara de CO₂ (seguindo protocolos aprovados institucionalmente) seguido de luxação cervical.
2. Para ajudar a reduzir a quantidade de pelo que pode grudar na amostra de tecido, borrife o camundongo com 70% de EtOH até que o pelo fique saturado. Esfole os membros posteriores e, em seguida, usando uma tesoura, remova os dois membros posteriores cortando a articulação do quadril.
3. Coloque os dois membros posteriores em um frasco de cintilação de 20 mL e mergulhe-os em PFA a 4% para que o frasco seja preenchido. Colocar os frascos para injetáveis a 4 °C com agitação durante a noite.
4. Lave os membros posteriores em 1x PBS à temperatura ambiente (TR) com agitação por 10 min e repita um total de 3 vezes. Mergulhe os membros posteriores em EDTA 0,5 M (pH 8,0) a 4 °C com agitação por até 2 semanas, substituindo por EDTA fresco a cada 2-3 dias.
5. Lavar os membros posteriores em 1x PBS em RT com agitação por 10 min, repetindo as lavagens um total de 3 vezes.
6. Mergulhe os membros em PBS 1x fresco e armazene a 4 ° C até que sejam usados para imagens.

2. Dissecção do tendão e preparação do tecido para a imagiologia

1. Enquanto segura o pé com uma pinça, deslize uma extremidade da lâmina da tesoura de mola (consulte a Tabela de Materiais) por baixo do tendão de Aquiles e certifique-se de cortar o mais próximo possível da junção miotendínea.
2. Segure a extremidade miotendínea cortada do tendão com uma pinça e use a tesoura de mola para cortar o tendão o mais próximo possível do osso.
   NOTA: Se necessário, use uma pinça para ajudar a manter o tendão de Aquiles longe do resto do membro posterior durante o primeiro corte. Certifique-se de não esmagar ou danificar o tecido, pois isso afetará o alinhamento do colágeno durante a imagem.
3. Para permeabilizar e ter uma contracoloração nuclear, mergulhe o tendão dissecado em PBT (1% Triton-X em PBS) com 0,1% de Draq5 (concentração de estoque, 5 mM, consulte a Tabela de Materiais). Coloque o tendão em um tubo de microcentrífuga de 2 mL e adicione 1 uL de Draq5 a 1 mL de PBT. Incube durante a noite no RT em um balancim. Como o Draq5 é sensível à luz, cubra os tubos da microcentrífuga com papel alumínio e proteja as amostras da luz.
4. Antes de fazer a imagem, remova a solução Draq5 e substitua-a por dPBS. Certifique-se de continuar a proteger a amostra da luz.
   CUIDADO: Draq5 tem toxicidade de categoria três e é considerado perigoso pelo Padrão de Comunicação de Perigos da OSHA. Evite o contato e descarte-o em um recipiente de lixo rotulado.
5. Usando uma ferramenta de punção de biópsia com um diâmetro interno de 6 mm, corte um pedaço de espuma de gel (consulte a Tabela de Materiais) e coloque-o em uma pequena placa de Petri de 60 x 15 mm. Adicione ddH₂O ao prato para permitir que a espuma de gel se expanda.
6. Coloque o tendão de Aquiles dissecado na espuma de gel. Usando uma lamínula colada a uma arruela, coloque cuidadosamente a arruela sobre o tendão até que a lamínula entre em contato com o tecido. Para evitar problemas ao criar imagens, certifique-se de não ter bolhas de ar entre a amostra e a lamínula. Se necessário, adicione mais ddH₂O ao prato para cobrir a amostra e a lavadora com a lamínula.

3. Imagem com um microscópio multifotônico

1. Usando um microscópio a laser multifotônico FVMPE-RS, objetiva de 25x que pode ser imersa em água, laser pulsado HPDS-O IR e laser pulsado IR (consulte a Tabela de Materiais), localize a amostra e a região de interesse que será fotografada usando o caminho da luz EPI. Uma vez localizada a amostra, coloque a câmera na extremidade miotendínea ou enteal do tendão de Aquiles.
2. Mude o caminho da luz para LSH, ajuste a configuração do laser IR do Laser 2 para 840 nm e alinhe ativamente. Ajuste a força HV para poder ver o tecido e o sinal SHG, sem exceder 20%. Não ajuste o ganho e mantenha o deslocamento igual a 0.
3. Em seguida, configure os parâmetros z-stack para adquirir as imagens de amostra. Use um tamanho de varredura de 1024 x 1024 e defina o tamanho do passo para 0,4 mícrons. As pilhas Z têm, em média, cerca de 150 fatias, e partem da bainha externa e se movem em direção ao centro do tendão até que o sinal SHG não seja mais claro, produzindo seções ópticas sagitais¹³.
4. Ajuste a potência do laser para o modo Bright Z para permitir a padronização da detecção de sinal. Uma vez estabelecidos os parâmetros de início/parada da pilha Z, defina a intensidade do laser de 4 no início da imagem e 6 no final da imagem. Isso ajuda a manter a consistência na sinalização SHG à medida que o endoscópio se aprofunda no tecido.
5. Depois que as pilhas z forem geradas, processe-as ainda mais no ImageJ/FIJI para criar um filme de seções ópticas na orientação transversal. Para fazer isso, abra o software ImageJ/FIJI¹⁴ e clique em Image > Stacks > Reslice. Isso nos permitirá ter uma visão transversal do tendão de Aquiles, revelando a morfologia estrelada dos tenócitos e sua orientação na matriz de colágeno.

Resultados

Este protocolo é útil para caracterizar as células tendíneas e sua matriz extracelular (MEC) após a lesão, durante o desenvolvimento ou em uma condição mutante. Com dissecção cuidadosa e preparação da amostra, vídeos z-stack podem ser gerados através do tecido em uma orientação sagital (Vídeo 1 e Vídeo 2). Usando o ImageJ/FIJI para processar e refatiar as imagens, uma visão transversal do tendão de Aquiles é criada (Vídeos 3 e Vídeo 4). Isso revela a morfologia estrelada dos tenócitos e nos permite observar sua arquitetura única dentro da densa matriz de colágeno.

Utilizando microscopia multifotônica e aproveitando as propriedades cristalinas não centrossimétricas do colágeno fibrilar I, foram geradas imagens de seção óptica de alta resolução que capturam as células do tendão e sua matriz. Essas seções ópticas são isoladas das pilhas z para o BHLHE40 +/-; Scx-GFP e BHLHE40 -/-; Camundongos Scx-GFP (Figura 1A, B, respectivamente). As seções são retiradas da pilha z sagital original criada por imagens 2-P e da pilha z refatiada gerada usando ImageJ / FIJI. Além disso, também podemos usar este método de imagem para analisar quaisquer diferenças potenciais na organização do colágeno, morfologia celular, etc., entre os dois camundongos.

Figura 1: Seção óptica do BHLHE40 +/-; Scx-GFP e BHLHE40 -/-; Tendão de camundongo Scx-GFP. A pilha Z foi capturada usando um microscópio multifotônico. (A) As seções ópticas adquiridas da pilha Z mostram o sinal SHG e as células GFP+/Draq5+ em um BHLHE40 +/-; Scx-GFP (P30, fêmea, 14,68 g) e (B) BHLHE40 -/-; Scx-GFP (P30, fêmea, 12,16 g). As seções sagitais têm sinal SHG incluído, enquanto as seções transversais não. As amostras foram contracoradas com Draq5. SHG captura a matriz de colágeno no tecido. Barra de escala = 10 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Vídeo 1: Vídeos Z-stack da visão sagital de BHLHE40 +/-; Tendão de camundongo Scx-GFP. A pilha Z foi capturada usando um microscópio de dois fótons. O vídeo mostra a visão sagital do tendão de Aquiles. As amostras foram contracoradas com Draq5. SHG captura a matriz de colágeno no tecido. Clique aqui para baixar este vídeo.

Vídeo 2: Vídeos Z-stack da visão sagital de BHLHE40 -/-; Tendão de Aquiles de camundongo Scx-GFP. A pilha Z foi capturada usando um microscópio de dois fótons. O vídeo mostra a visão sagital do tendão de Aquiles em um camundongo KO BHLHE40 nulo. As amostras foram contracoradas com Draq5. SHG captura a matriz de colágeno no tecido. Clique aqui para baixar este vídeo.

Vídeo 3: Vídeos Z-stack da vista transversal do BHLHE40 +/-; Tendão de camundongo Scx-GFP. A pilha Z foi capturada usando um microscópio de dois fótons. O vídeo mostra a visão transversal do tendão de Aquiles. As amostras foram contracoradas com Draq5. SHG captura a matriz de colágeno no tecido. Clique aqui para baixar este vídeo.

Vídeo 4: Vídeos Z-stack da vista transversal de BHLHE40 -/-; Tendão de Aquiles de camundongo Scx-GFP. A pilha Z foi capturada usando um microscópio de dois fótons. O vídeo mostra a visão transversal do tendão de Aquiles em um camundongo KO BHLHE40 nulo. As amostras foram contracoradas com Draq5. SHG captura a matriz de colágeno no tecido. Clique aqui para baixar este vídeo.

Discussão

Este artigo apresenta um método para preparar, dissecar e obter imagens do tendão de Aquiles de camundongo, utilizando as propriedades cristalinas não centrossimétricas da ECM do tendão. As principais etapas na preparação do tecido envolvem permeabilização para contracolorações e garantia da colocação adequada do tecido em uma placa de Petri durante a imagem. Em vez de Draq5, Hoechst 33258 pode ser usado em uma diluição de 1:100.000¹³, mas Draq5 é preferido por sua alta permeabilidade, fotoestabilidade e fotobranqueamento mínimo. A colocação adequada do tecido é crucial para evitar bolhas entre a lamínula e o tendão, pois a orientação incorreta pode afetar as imagens resultantes.

Em comparação com outros métodos de microscopia, a microscopia de geração de segundo harmônico (SHG) permite a captura de fibrilas de colágeno e células tendíneas dentro da matriz¹⁰. Combinados com contracolorações, esses dados permitem a análise de como o desenvolvimento, lesões ou mutações afetam a estrutura do tendão. A geração de imagens 3D da ECM do tendão permite a observação de seções ópticas à medida que passam pelo tendão. Embora a tecnologia multifotônica forneça penetração superior no tecido, ela ainda tem limitações na imagem de todo o tendão de Aquiles, necessitando de técnicas adicionais, como seccionamento. No entanto, este método permite a produção de aproximadamente 150 seções ópticas de 0,4 mícron com clareza, evitando a perturbação do tecido por meio do seccionamento.

Em resumo, este método oferece informações valiosas sobre a caracterização do desenvolvimento, lesões, cicatrização e envelhecimento do tendão, por meio de imagens de células tendíneas e ECM usando microscopia multifotônica. A utilização de imagens multifotônicas para seções ópticas e vídeos de pilha z em todo o tecido fornece uma melhor compreensão das mudanças na morfologia do tendão em condições experimentais.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
0,5 M EDTA pH 8,0	Invitrogen	AM9262
Tubos de microcentrífuga de 2 mL	USA Scientific	1620-2700
Frasco de cintilação de 20 mL	Sigma-Aldrich	Z190527-1PAK
4% Paraformaldeído	Microscopia Eletrônica Ciências	50-980-487	Use PFA ampuole para criar solução de PFA a 4%
Ferramenta de punção de biópsia de 6 mm	Ted Pella Inc.	15111-60
			Petri de 60 x 15 mm
BHLHE40 camundongos nocaute nulo ou heterozigotos em um fundo Scx-GFP	The Jackson Laboratory	JAX ID #029732	MGI ID #3717419
Coverslips	Fisher	12-544-F	Pode usar qualquer lamínula que abranja a área da arruela M20
dPBS	Gibco	14190144
Draq5	ABCAM	ab108410
Tesoura fina 21 mm de ponta	Fine Science Tools	14060-10
FVMPE-RS multifotônico laser microscópio de varredura	Olympus
Gelfoam Esponja Estéril Tamanho 50	Pfizer	00009-0323-01
INSIGHT X3-OL IR pulsado laser	Olympus
MaiTai HPDS-O IR laser pulsado	Olympus
Phosphate-Buffered Saline (1x)	Invitrogen	AM9625	Dilua 10x PBS em água mili-Q para obter 1x solução
Arruela plana de aço inoxidável M20	McMaster-Carr
Triton X-100	MP Biomedicals	807426	Dilua Triton X-100 em dPBS para obter solução a 1%
Tesoura de mola Vannas 4 mm de ponta	Fine Science Tools	15018-10
XLPlan N 25X WMP Lens