Bioimpressão Tridimensional de Coculturas Neurônio-Astrócitos Derivadas de iPSC Humanas para Aplicações de Triagem

Resumo

Aqui, apresentamos um protocolo para produzir coculturas bioimpressas em 3D de neurônios e astrócitos derivados de iPSC. Este modelo de cocultura, gerado dentro de um arcabouço de hidrogel em formatos de 96 ou 384 poços, demonstra alta viabilidade pós-impressão e crescimento de neuritos em 7 dias e mostra a expressão de marcadores de maturidade para ambos os tipos celulares.

Resumo

Para que um modelo de célula seja viável para a triagem de drogas, o sistema deve atender aos requisitos de produtividade e homogeneidade, além de ter um tempo de desenvolvimento eficiente. No entanto, muitos modelos 3D publicados não satisfazem esses critérios. Isso, portanto, limita sua utilidade em aplicações de descoberta precoce de drogas. A bioimpressão tridimensional (3D) é uma nova tecnologia que pode ser aplicada ao desenvolvimento de modelos 3D para agilizar o tempo de desenvolvimento, aumentar a padronização e aumentar o rendimento. Aqui, apresentamos um protocolo para desenvolver modelos de cocultura bioimpressos 3D de neurônios glutamatérgicos e astrócitos derivados de células-tronco pluripotentes induzidas por humanos (iPSC). Essas coculturas estão embutidas dentro de uma matriz hidrogel de peptídeos bioativos, proteínas da matriz extracelular (MEC) de comprimento total e com rigidez fisiológica de 1,1 kPa. O modelo pode ser rapidamente estabelecido em formatos de 96 e 384 poços e produz uma viabilidade pós-impressão média de 72%. A relação astrócito-neurônio neste modelo é mostrada como sendo 1:1,5, que está dentro da faixa fisiológica para o cérebro humano. Essas populações de células bioimpressas em 3D também mostram expressão de marcadores do tipo de células neurais maduras e crescimento de projeções de neuritos e astrócitos dentro de 7 dias de cultivo. Como resultado, este modelo é adequado para análise usando corantes celulares e técnicas de imunomarcação ao lado de ensaios de crescimento de neuritos. A capacidade de produzir esses modelos fisiologicamente representativos em escala os torna ideais para uso em ensaios de triagem de médio a alto rendimento para alvos de neurociência.

Introdução

A pesquisa em doenças do sistema nervoso central (SNC) na indústria de descoberta de medicamentos está em expansão¹. No entanto, muitas doenças prevalentes do SNC, como epilepsia, esquizofrenia e doença de Alzheimer, ainda não apresentam tratamento curativo ^2,3,4. A falta de terapêutica eficaz nas doenças do SNC pode, pelo menos em parte, ser atribuída à falta de modelos acurados in vitro do cérebro⁵. Isso resultou em uma lacuna translacional entre os modelos in vitro atuais e os dados in vivo e um subsequente gargalo nos esforços de pesquisa.

Impulsionado por essa lacuna translacional, houve um aumento significativo no desenvolvimento de novos modelos de células 3D nos últimos anos, incluindo organoides neurais, neuroesferoides e modelos baseados em arcabouços⁶. A estrutura 3D desses modelos auxilia na recapitulação do microambiente neural, incluindo estresses biomecânicos, contatos célula-célula e matriz extracelular cerebral (MEC)⁷. A MEC cerebral é um elemento dinâmico da neurofisiologia que ocupa o espaço entre os tipos de células neurais, incluindo neurônios, astrócitos, oligodendrócitos e a unidade neurovascular⁷. Demonstrou-se que a recapitulação da MEC cerebral afeta a morfologia neuronal e o disparo neuronal, e muitos modelos 3D complexos do cérebro demonstraram deposição de proteínas da MEC por tipos de células neurais 8,9,10,11. Os modelos baseados em scaffolds consistem em coculturas neurais maduras suspensas em uma matriz porosa sintética ou biológica de hidrogel que representa a MEC cerebral¹². Ao contrário dos sistemas organoides e esferoides, os modelos 3D baseados em scaffolds permitem a personalização das proteínas da MEC presentes e têm o benefício adicional da tunabilidade da rigidez do hidrogel para mimetizar tensões biomecânicas^13,14.

Embora a esmagadora maioria dos modelos neurais 3D demonstre uma maior recapitulação do microambiente cerebral, nem todos os modelos são adequados para implementar aplicações de descoberta de drogas¹⁵. Para que um modelo 3D seja implementado em processos industriais, o sistema deve atender aos requisitos de throughput para aplicações de triagem e ter um tempo de desenvolvimento relativamente curto¹⁶. A bioimpressão 3D é uma nova tecnologia que oferece o potencial de criar modelos neurais baseados em arcabouços 3D com rápido tempo de desenvolvimento, maior rendimento e níveis mais altos de controle de precisão, juntamente com a remoção da variabilidade causada pelo erro humano¹⁷. Este protocolo apresenta um modelo de cocultura 3D de neurônios glutamatérgicos e astrócitos humanos derivados da iPSC em um arcabouço de hidrogel. Este arcabouço de hidrogel contém peptídeos bioativos fisiologicamente representativos (RGD, IKVAV, YIGSR) e proteínas da MEC dentro de uma rigidez biomecânica mimética. Essas proteínas de MEC, de comprimento total, incluem laminina-211 e ácido hialurônico, abundantes no córtex humano, com rigidez de 1,1 kPa, de acordo com medidas in vivo ¹⁸. Este modelo é projetado com praticidade para a descoberta de drogas, e é criado usando uma bioimpressora 3D em um formato de placa de 96 ou 384 poços adequado para análise de triagem usando técnicas de imagem com corantes celulares e anticorpos, juntamente com ensaios de crescimento de neuritos. As células apresentam expressão de marcadores do tipo celular neural e crescimento de projeções neuríticas e astrocitárias em até 7 dias após o cultivo. Assim, este protocolo apresentará a metodologia para o desenvolvimento de um modelo de cocultura neural 3D de alto rendimento para uso em aplicações de descoberta de fármacos.

Figura 1: Visão geral ilustrativa da metodologia utilizada para coculturas de bioimpressão 3D. Neurônios e astrócitos humanos derivados de iPSC são combinados com soluções de ativador e biotinta contendo peptídeos bioativos e são bioimpressos em scaffolds de hidrogel em formatos de 96 ou 384 poços usando tecnologia de bioimpressão drop-on-demand. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Protocolo

1. Bioimpressão de modelos 3D

1. Gerando mapa de chapa e arquivo de impressão
   1. Antes da geração do modelo, gere um mapa de placa, protocolo e arquivo de impressão usando o software de mapa de placa. Abra o software de mapa de placas e selecione a opção Células de cultura em 3D .
   2. Selecione o tipo de modelo a ser bioimpresso nas opções disponíveis no menu suspenso; esse modelo foi validado nos formatos Imaging Model e HTP . Selecione Modelo de imagem para placas de 96 poços e HTP para placas de 384 poços.
   3. Na janela Seleção de matriz , selecione Hidrogel Px02.53, contendo proteínas de Laminina-211 e ácido hialurônico, com peptídeos IKVAV, RGD e YIGSR.
   4. Na janela pop-up, insira os tipos de células como neurônios glutamatérgicos e astrócitos e insira a densidade celular como 20 milhões de células/mL.
   5. Use o software para projetar o mapa de placa desejado, destacando poços na placa na tela. Inclua pelo menos 1 linha de controle 2D em plástico no projeto. O controle 2D em poços plásticos consiste em células depositadas diretamente no poço sem qualquer arcabouço de hidrogel; Revestir estes poços de acordo com o passo 1.2.
   6. Certifique-se de que o modelo de chapa listado na parte superior da janela seja alterado para o modelo de chapa pretendido para uso (consulte a Tabela de Materiais).
   7. Faça o download do protocolo e imprima o arquivo para o mapa da placa usando os botões de download e salve-os no computador vinculado à bioimpressora.
2. Revestimento de controle 2D em poços plásticos
   1. Pelo menos 24 h antes da impressão, revestir os poços para os modelos de controle 2D para aderência e crescimento celular. Os poços modelo 3D não requerem nenhum pré-revestimento. Todos os processos devem ser realizados em um gabinete de biossegurança, salvo indicação em contrário. As placas podem ser revestidas e preparadas até 7 dias antes da impressão.
   2. Completar 50 mL de tampão borato 1x diluindo 2,5 mL de solução-mãe de borato 20x com 47,5 mL de dH₂O estéril.
   3. Adicionar 100 μL de polietilenoimina (PEI) a 50% (p/v) a 50 mL de tampão borato 1x para criar uma solução de PEI a 0,1% (p/v) e filtro estéril através de um filtro de 0,22 μm.
   4. Adicionar 0,1% (p/v) de solução de PEI a cada poço de controle 2D, conforme indicado pelo mapa de placas gerado na etapa 1.1. Adicionar 100 μL/poço se utilizar uma placa de 96 poços ou 25 μL/poço se utilizar uma placa de 384 poços.
   5. Incubar a placa por 2 h a 37 °C antes de aspirar a solução de PEI a 0,1% (p/v) e enxaguar os poços 5x com PBS. Deixe os poços secarem completamente no armário de biossegurança.
   6. Diluir 100 μL de 1 mg/mL de solução de laminina em 5 mL de meio neurobasal. Adicionar 100 μL a cada poço de controle 2D se usar uma placa de 96 poços ou 25 μL se usar uma placa de 384 poços. Incubar durante 4 h a 37 °C.
   7. Se armazenar placas, deixar a solução de laminina no lugar após a incubação e armazenar a 4 °C.  Pré-aqueça as placas durante 1 h a 37 °C antes de utilizar.
3. Bioimpressão 3D de modelos de cocultura
   1. Sempre mantenha uma técnica estéril ao usar a bioimpressora e limpe luvas, cartuchos e placas de cultura com EtOH 70% antes de serem colocados dentro da impressora. Salvo indicação em contrário, execute todos os processos fora da bioimpressora em um gabinete de biossegurança.
   2. Ligue o compressor da bioimpressora e inicialize a impressora selecionando o botão Inicializar no software da bioimpressora. Assim que o fluxo de ar na impressora tiver iniciado, limpe as superfícies dentro da impressora com uma limpeza EtOH de 70%.
   3. No dia da impressão, realize o processo de Greenlighting guiado para garantir o status correto do bocal para a tiragem (status mínimo do bocal 2A2B).
   4. Retirar um cartucho de bioimpressora da embalagem estéril, adicionar 20 mL de dH₂O estéril no compartimento A e adicionar 6 mL de EtOH 70% filtrado estéril aos compartimentos B1-4. Insira o cartucho no suporte do cartucho esquerdo dentro da bioimpressora e coloque a tampa da placa no suporte da tampa dedicado.
   5. Selecione o botão Greenlighting na tela inicial do software e confirme no software que o cartucho está no lugar dentro da bioimpressora e que a tampa foi removida. Inicie o processo de greenlighting.
   6. Quando solicitado pelo software, confirme que não é possível ver gotejamentos consistentes das agulhas esquerda ou direita. Posteriormente, quando solicitado pelo software, confirme se há água nos compartimentos B7 e B8.
   7. Depois que a bioimpressora tiver concluído a etapa de iluminação verde autoguiada, insira uma placa de fundo plano estéril não revestida de 96 poços (separada da placa revestida para coculturas de bioimpressão) e insira essa nova placa na seção direita do suporte da placa da bioimpressora, quando solicitado pelo software. Certifique-se de que o suporte da placa esteja ajustado para Placa de perfil alto e que a tampa seja removida e colocada no suporte de tampa dedicado antes de iniciar a próxima etapa.
   8. A bioimpressora depositará gotículas de água em cada poço da placa de 96 poços. Depois de concluído, coloque a placa da bioimpressora e confirme se as gotículas de água estão presentes em cada poço da placa.
   9. Descarte a placa de 96 poços usada para iluminação verde e permita que a bioimpressora termine o processo de iluminação verde. Uma vez concluído, o software indicará o status do bocal da bioimpressora e confirmará que a bioimpressora está pronta para imprimir modelos. Coloque a tampa no cartucho de impressão e remova-o para o armário de biossegurança para os próximos passos.
   10. Usando o software da bioimpressora, carregue o arquivo de impressão (gerado na etapa 1.1) no software usando o botão do software Print Run e abra o pdf do protocolo de impressão.
   11. Recupere a biotinta e os fluidos ativadores, conforme indicado no protocolo de impressão pdf, a partir de -20 °C e descongele à temperatura ambiente (RT) por 40 min. Para a matriz de hidrogel Px02.53 isso incluirá: 1x frasco F32, 1xvial F3, 1x frasco F261, 1x frasco F299. Não descongele biotinta e fluidos ativadores nas mãos ou banhos de água.
   12. Levar 50 ml de meio completo com doxiciclina e inibidor de ROCK (meio completo +DOX/ROCKi) (ver passo 2.2) para RT enquanto a biotinta e os fluidos ativadores estão a descongelar.
   13. Depois que as biotintas e ativadores forem descongelados, prepare o cartucho de impressão conforme as instruções nas duas páginas finais do pdf do protocolo de impressão gerado. O cartucho da impressora greenlighting será reutilizado para as etapas de impressão do modelo.
       1. Certifique-se de que há 40 mL de dH₂O no compartimento A1 e 8 mL de EtOH 70% nos compartimentos B1 e B2. Adicionar 1,2 mL do ativador F32 a C1, 1,2 mL de F3 a C2 e 200 μL de F261 a C4.
       2. Recupere o PEI e a placa revestida de laminina da incubadora e coloque-a dentro da impressora no compartimento direito do suporte da placa. Não remova a solução de laminina-meio dos poços neste ponto. Certifique-se de que o compartimento do suporte da placa esteja ajustado para Placa de perfil baixo e que a tampa esteja removida e no suporte da tampa.
   14. Coloque o cartucho de impressão na bioimpressora, garantindo que a tampa seja removida e colocada no suporte, e inicie a execução de impressão no software selecionando o botão Base inerte de impressão no software da bioimpressora.
   15. Enquanto a base inerte estiver imprimindo, recupere os frascos de neurônios glutamatérgicos e astrócitos do armazenamento de nitrogênio líquido, descongele e ressuspenda de acordo com as instruções na seção 2.
   16. Uma vez que as células são descongeladas, e 8 mL de meio completo +DOX/ROCKi foram adicionados a cada tipo de célula separadamente (conforme seção 2), centrifugar as células a 300 x g por 5 min no RT.
   17. Aspirar o sobrenadante e ressuspender os dois tipos celulares separadamente em 1 mL de meio completo +DOX/ROCKi.
   18. Adicionar 20 μL de suspensão celular a 20 μL de azul de tripano e misturar antes de contar as células para determinar a concentração celular viável por mL para cada tipo celular.
   19. Combinar um total de 3 milhões de neurônios glutamatérgicos com 1 milhão de astrócitos em um tubo de 15 mL. Adicione mídia para criar um volume total de 8 mL.
   20. Centrifugar as células a 300 x g durante 5 min em RT.
   21. Aspirar o máximo possível do sobrenadante sem perturbar a pastilha celular e ressuspender a pastilha celular em 200 μL de fluido ativador F299.
   22. Observe que o fluido ativador é viscoso; Pipetar para cima e para baixo para ressuspender totalmente o pellet. Os tipos celulares são delicados; Minimize o cisalhamento e as bolhas usando uma ponta de pipeta de furo largo e a técnica de pipetagem reversa. Pipetar para cima e para baixo firmemente não mais do que 3 vezes para evitar a perda celular.
   23. Terminada a impressão do estágio de base inerte, coloque as tampas no cartucho e na placa de cultura, retire ambas da bioimpressora e coloque no gabinete de biossegurança.
   24. Adicione os 200 μL de suspensão celular em F299 ao poço C3 do cartucho de impressão, reinsira o cartucho na bioimpressora, remova a tampa e coloque-a no suporte da tampa. Ainda não reinsira a placa de cultura.
   25. Inicie o estágio Modelos de Impressão da tiragem. Enquanto a bioimpressora estiver preparando fluidos, remova a solução de meio laminina dos poços de controle 2D da placa e substitua-a por 150 μL de mídia completa +DOX/ROCKi em cada poço de controle 2D se usar uma placa de 96 poços e 50 μL de meio completo +DOX/ROCKi se estiver usando uma placa de 384 poços.
   26. Depois que os líquidos tiverem sido preparados, insira a placa de direcionamento de bioimpressão na bioimpressora, remova a tampa e coloque-a no suporte da tampa.
   27. Inicie o processo de segmentação da bioimpressora.
       1. Quando solicitado pelo software de bioimpressão, remova a placa de destino da bioimpressora.
       2. Use o guia para selecionar onde as gotículas podem ser observadas na placa. Reinsira a placa de direcionamento na bioimpressora e repita o processo de impressão e seleção de gotículas.
       3. Quando solicitado, remova novamente a placa de direcionamento e, em seguida, substitua-a pela placa de cultura de células (contendo mídia nos poços de controle 2D conforme etapa 1.3.25). Certifique-se de que a tampa da placa de cultura está desligada e colocada no suporte. A bioimpressora finalizará a impressão do modelo.
   28. Quando a impressão do modelo estiver concluída, siga os métodos de cultura de células na seção 2 (etapa 2.8) para adicionar mídia aos poços.
   29. Inicie o processo de limpeza da bioimpressora e, uma vez concluído, descarte os cartuchos e líquidos remanescentes de acordo com os protocolos do laboratório.

2. Cultura celular

1. Os modelos são gerados usando 1x frasco de neurônios glutamatérgicos (>5 milhões de células por frasco) e 1x frasco de astrócitos (>1 milhão de células por frasco).
2. Pré-aqueça o banho-maria a 37 °C.
3. Transporte ambos os frascos de células para o laboratório em gelo seco e imerso em banho-maria imediatamente após a remoção do gelo seco. Descongele os dois frascos simultaneamente.
4. Retire os frascos para injetáveis do banho-maria quando restar apenas um pequeno cristal de gelo; Isso levará aproximadamente 3 minutos após a imersão. Não gire ou misture as células no banho-maria.
5. Borrife os frascos com EtOH 70% e transfira-os para o armário de biossegurança.
6. Adicionar 500 μL de meio completo +DOX/ROCKi gota a gota em cada frasco para injetáveis antes de transferir cada suspensão para tubos separados de 15 ml.
7. Recompletar o meio em cada tubo para 8 mL e prosseguir com as etapas de bioimpressão de acordo com a etapa 1.3.
8. Seguindo os modelos de bioimpressão (passo 1.3), adicione imediatamente o meio completo +DOX/ROCKi a todos os poços de cocultura 3D e coloque os modelos em uma incubadora a 37 ^oC e 5% CO₂. Se usar uma placa de 96 poços, adicionar 150 μL de meio por poço; se usar uma placa de 384 poços, use 50 μL de meio por poço.
9. Nenhuma mudança de mídia é necessária para as primeiras 48 h de cultura.
10. Ao realizar mudanças de meios em controles e modelos 2D, deve-se tomar cuidado para evitar a indução de estresse mecânico, que poderia destacar culturas 2D ou causar deformação do hidrogel. Execute a aspiração e adição do meio lentamente usando uma micropipeta apontando para o lado do poço.
11. Após 48 h, realizar uma mudança de meio de 90% em todos os poços e remover ROCKi da composição do meio (ver passo 2.14).
12. Após 96 horas, realizar uma nova mudança de meio de 90% em todos os poços para remover o DOX da composição do meio (ver etapa 2.14).
13. Após as duas trocas de mídia de 90% em 48 h e 96 h, realizar trocas de mídia de 50% a cada 48 h, onde 50% da mídia é aspirada e substituída por mídia completa fresca
14. Composição da mídia:
    1. Meio completo: Meio neurobasal com 1x GlutaMAX, 1x B27, 12,5 nM 2-mercaptoetanol, 10 ng/mL NT3, 5 ng/μL BDNF.
    2. Meio completo mais doxiciclina (DOX): Meio neurobasal com 1x GlutaMAX, 1x B27, 12,5 nM 2-mercaptoetanol, 10 ng/mL neurotrofina-3 (NT3), 5 ng/μL de fator neurotrófico derivado do cérebro (BDNF) e 1 μg/mL de doxiciclina.
    3. Meio completo mais inibidor de DOX/ROCK (ROCKi): Meio neurobasal com 1x GlutaMAX, 1x B27, 12,5 nM 2-mercaptoetanol, 10 ng/mL NT3, 5 ng/μL BDNF, 1 μg/mL doxiciclina e 10 μM inibidor de ROCK.

3. Análise do crescimento de neuritos

1. Coloque as células em um microscópio de células vivas para obter imagens de campo claro imediatamente após a adição de mídia pós-bioimpressão.
2. Use o software do microscópio para programar as células a serem fotografadas com aumento de 4x em cada poço, incluindo controles 2D, a cada 12 h por pelo menos 7 dias.
3. Realizar trocas de meios a cada 48 h, conforme detalhado na seção 2, colocando as células de volta no microscópio após as trocas de mídia a cada vez.
4. Após 7 dias de dados, exporte as imagens do software em .jpg formato
5. Importe todas as imagens .jpg para o software ImageJ e converta arquivos para o formato de 8 bits. Carregue o plugin NeuronJ e trace o crescimento de neuritos em imagens, incluindo pontos de ramificação, usando a ferramenta de rastreamento.
6. Use os dados de rastreamento de neuritos gerados a partir do NeuronJ para plotar o crescimento de neuritos ao longo do tempo.

4. Análise de viabilidade celular

1. A cada 24 horas de cultura, corar 3 ou mais poços para análise de viabilidade celular usando um kit de viabilidade vivo/morto. Repita esta etapa em 24 h ou 48 h durante o estudo.
2. Preparar meios reagentes vivos/mortos suspendendo o reagente de células vivas (1x Calceína-AM) e o reagente de células mortas (1x homodímero de etídio-1) e 1x a coloração nuclear de células vivas (Hoechst 33342) em 10 mL de meio sérico reduzido sem vermelho de fenol (Opti-MEM) 30 minutos antes da obtenção de imagens. Deixe a mídia reagente viva/morta chegar ao RT. Armazene a mídia reagente viva/morta fora da luz direta devido ao branqueamento por fluorescência.
3. Remova o meio de 3 poços contendo modelos celulares/controles 2D, prevenindo cuidadosamente a perturbação do gel. Lave os modelos celulares uma vez com RT estéril PBS. Adicionar 100 μL de meio reagente vivo/morto a cada poço para uma placa de 96 poços ou 25 μL para uma placa de 384 poços.
4. Incubar os modelos por 30 min a 37 °C e 5% CO_2.
5. Após a incubação, os modelos estão prontos para a obtenção de imagens. Realizar imagens em qualquer microscópio padrão com canais de excitação vermelhos (647 nm, células mortas), verdes (488 nm, células vivas) e azuis (405 nm, coloração nuclear). Para obter melhores resultados em modelos 3D, modelos de imagem usando um microscópio confocal de alto conteúdo e realizar imagens usando uma função Z-stack em aumento de 4x ou 10x.
   NOTA: Neste estudo, os modelos celulares foram fotografados usando o INCell Analyzer 6500HS (sistema de imagem de alto conteúdo), e a análise foi realizada usando o Signals Image Artist (plataforma de análise de imagens, veja passo 4.7).
6. Após a conclusão das imagens, os modelos celulares retornam à incubadora de cultura celular a 37 °C e 5% de CO_2. No entanto, omitir modelos celulares usados para análise de viabilidade de estudos posteriores devido ao meio reagente vivo/morto na viabilidade a longo prazo.
7. Análise de imagens na plataforma de análise de imagens
   1. Selecione cada plano da imagem Z-stack no software. Combine imagens planas como uma imagem de projeção de intensidade máxima.
   2. Crie uma nova análise selecionando o modelo bioimpresso como uma região de interesse (ROI) identificando a fluorescência do canal de células vivas a 488 nm (certifique-se de que todas as células sejam selecionadas sob ROI).
   3. Dentro da região de interesse, utilizar o software de imagem para identificar o número de células na ROI através do canal de coloração nuclear (405 nm), o número de células vivas na ROI usando o canal de 488 nm e o número de células mortas na ROI usando o canal de 647 nm.
   4. Execute a análise em todos os poços modelo de células tratadas vivas/mortas e exporte a tabela de dados contendo a área de ROI, o número total de células, o número de células vivas e o número de células mortas.
   5. Calcular o número de células vivas e mortas como uma porcentagem do número total de células por dia de análise.

5. Imunomarcação e análise da população celular

1. Antes da fixação, retire o meio dos modelos celulares e lave os modelos uma vez em PBS.
2. Fixar células com paraformaldeído a 4% (v/v) em PBS em RT por 20 min.
   ATENÇÃO: Todo trabalho com paraformaldeído deve ser realizado de acordo com procedimentos laboratoriais.
3. Aspirar a solução de paraformaldeído a 4% (v/v) dos modelos e lavar os modelos quatro vezes em PBS para remover completamente o paraformaldeído.
4. Permeabilizar os modelos celulares com triton-X 0,2% por 30 min no TR e lavar três vezes com PBS.
5. Bloquear os modelos celulares usando 10% (v/v) de soro de burro normal (NDS) por 3 h no TR.
6. Remova a solução de bloqueio e adicione anticorpos primários (diluídos em NDS v/v a 1% em PBS) aos modelos. Se estiver a realizar a análise da razão da população celular (ver passo 5.11), certifique-se de incluir modelos celulares que são co-corados para tubulina Β-III (com conjugação AF647 vermelha) e GFAP (com conjugação AF488 verde). Incubar modelos com anticorpos primários durante 24 h a 4 °C.
7. Após a incubação primária, lavar os modelos corados com anticorpos primários conjugados três vezes em PBS e contracorar com 20 μM Hoechst por 30 min. Imagem conforme detalhado na etapa 5.10.
8. Lavar os modelos corados com anticorpos primários não conjugados três vezes em PBS e adicionar anticorpos secundários (diluídos em 1% v/v NDS em PBS). Incubar durante 24 h a 4 °C.
9. Remover anticorpos secundários lavando três vezes em PBS e contracorar modelos com 20 μM Hoechst por 30 min antes da aquisição de imagens.
10. Realizar imagens em microscópios padrão com canais de excitação vermelhos (647 nm) e verdes (488 nm). No entanto, para obter melhores resultados em modelos 3D, os modelos de imagem usam um microscópio confocal de alto conteúdo e realizam imagens usando uma função Z-stack em aumento de 4x ou 10x.
11. Análise da razão da população celular na plataforma de análise de imagens
    1. Obter uma análise das populações celulares usando modelos co-corados para GFAP (com conjugação AF488) e tubulina Β-III (com conjugação AF647).
    2. Selecione cada plano da imagem Z-stack no software e combine as imagens planas como uma imagem de projeção de intensidade máxima.
    3. Crie uma nova análise selecionando o modelo bioimpresso como uma ROI, identificando a fluorescência do canal de tubulina Β-III a 647 nm (certifique-se de que toda a área contendo células seja selecionada sob ROI).
    4. Dentro da ROI, utilizar o software para identificar o número de células no canal Hoechst (405 nm), o número de astrócitos GFAP+ na ROI usando o canal de 488 nm e o número de células Β-III tubulina+ na ROI usando o canal de 647 nm.
    5. Execute a análise em todos os poços modelo de células cocoradas e exporte a tabela de dados contendo a área de ROI, o número total de células, o número de células GFAP+ e o número de células Β-III tubulina+.
    6. Calcular o número de células GFAP+ e Β-III tubulina+ como uma porcentagem do número total de células.

Resultados

Análise do crescimento de neuritos
Neste protocolo, neurônios glutamatérgicos derivados de iPSC e astrócitos foram bioimpressos em cocultura em uma matriz de hidrogel usando a bioimpressora 3D. Durante os primeiros 7 dias pós-impressão, as células foram fotografadas a cada 12 h usando um microscópio de células vivas. Após a bioimpressão, as células devem ter uma morfologia arredondada e devem ser dispersas por toda a matriz de hidrogel, mudando gradualmente para formar aglomerados celulares menores com poucas saliências ao longo dos primeiros dias de cultura (veja o Vídeo Suplementar 1 para o crescimento celular saudável representativo). No dia 4, as células saudáveis migrarão por todo o gel para formar aglomerados maiores, que são conectados através de crescimentos de neuritos. Até o 7º dia, quase nenhuma célula deve permanecer, os feixes interconectados de neuritos e projeções astrocitárias devem aparecer fortificados, e muitos excrescências neuríticas menores podem ser vistos se formando a partir dos aglomerados (Figura 2A). Usando uma série de imagens de campo claro de células vivas tiradas durante o período de crescimento de 7 dias, uma análise do crescimento de neuritos foi realizada conforme detalhado na seção 3. Essa análise demonstrou que o crescimento dos neuritos aumenta de forma quase linear (valor de R² = 0,84) entre 12 h e 156 h (Figura 2B). Durante este período de crescimento de neuritos, os aglomerados de corpos celulares também aumentam de tamanho (ver Vídeo Suplementar 1), o que é indicativo de migração celular ao longo do hidrogel.

Viabilidade celular e razão populacional
Nesse protocolo, uma concentração de 20 milhões de células/mL, compreendendo 15 milhões de neurônios/mL e 5 milhões de astrócitos/mL, é utilizada para bioimpressão dos modelos celulares. Usando a coloração de células vivas com calceína-AM (células vivas), homodímero-1 de etídio (células mortas) e uma coloração nuclear, o número de células sobreviventes durante um período de 7 dias pode ser calculado de acordo com a seção 4 (Figura 3A). Os resultados de viabilidade celular para culturas representativas são mostrados para o dia 4, onde 72% ± 1% (média ± MEV) do total de células estão vivas e mostram coloração para Calceína-AM, enquanto 29% ± 2% (média ± MEV) células totais estão mortas e mostram coloração com homodímero etídio-1 (Figura 3B). Imagens representativas da coloração celular com Calceína-AM e homodímero de etídio-1 podem ser vistas na Figura Suplementar 1. Deve-se notar que os valores de sobrevivência celular para culturas 3D não podem ser diretamente comparados com culturas 2D, pois as células mortas são retidas no hidrogel e não serão removidas durante os processos de alimentação celular.

Usando a coloração de imunofluorescência para tubulina Β-III e GFAP, como descrito na seção 5 e na Figura 4, a análise de imagens pode ser realizada para determinar as razões da população celular entre neurônios e astrócitos (Figura 3A). Do total de células por modelo em culturas representativas, neurônios β-III positivos para tubulina representam 49% ± 3% (média ± EPM), enquanto astrócitos positivos para GFAP representam 30% ± 4% (média ± EPM). Isso dá uma proporção de 1:1,5, astrócitos para neurônios, respectivamente. Isso deixa um restante de 21% de células totais por modelo, que não mancham para nenhum dos marcadores celulares. Como a análise de viabilidade celular demonstrou que um valor médio de 29% das células não são viáveis no dia 4, é provável que essas células estejam mortas dentro do hidrogel.

Expressão de marcadores celulares
A morfologia dos neurônios bioimpressos e astrócitos foi avaliada através da imunomarcação para marcador do tipo celular neuronal (tubulina Β-III) e marcador astrocitário (GFAP). Nas culturas representativas mostradas, a imunomarcação está localizada em tipos celulares individuais, mostrando morfologia celular saudável, com ambos os tipos celulares exibindo crescimento de protrusões celulares (Figura 4A,B). Como o hidrogel e as estruturas celulares são tridimensionais, cada imagem representa apenas um corte através da estrutura na Figura 4A,B. A Figura 4C mostra uma pilha mesclada de imagens ao longo do hidrogel, demonstrando visões da localização celular nos planos X, Y e Z. A Figura 4D mostra imunomarcação apenas para tubulina Β-III; destacando excrescências de neuritos mais finos dos aglomerados do corpo celular. Para examinar melhor o fenótipo dos neurônios glutamatérgicos, a imunomarcação para o marcador do receptor iônico glutamatérgico, GluR2, pode ser realizada. Na Figura 4E, a área 4E.1 (inset) foi destacada para mostrar coloração puntiforme de maior resolução ao longo dos feixes de neuritos. Isso, portanto, confirma que os neurônios dessa cocultura possuem fenótipo glutamatérgico. Em todas as imagens de imunomarcação, estruturas não-celulares coradas por imunofluorescência podem ser observadas ao redor dos aglomerados celulares e neuritos. É provável que essas estruturas representem detritos retidos dentro do hidrogel em combinação com pequenas quantidades de ligação de anticorpos inespecíficos ao hidrogel. Isso é esperado em culturas bioimpressas, pois dentro de modelos de arcabouço 3D, células mortas e detritos não são removidos durante a alimentação celular. Uma imagem representativa de imunomarcação de controle negativo é mostrada na Figura 2 Suplementar para uma demonstração de ligação inespecífica de anticorpos secundários ao hidrogel.

Figura 2: Neurônios glutamatérgicos e astrócitos foram bioimpressos na matriz de hidrogel usando a bioimpressora e foram fotografados a cada 12 h usando um microscópio de campo claro . (A) Um exemplo de imagem de campo brilhante obtida de culturas de células durante a análise. A imagem representa o ponto de tempo 156 h, e a barra de escala representa 400 μm. (B) O comprimento médio dos crescimentos neuríticos (μm) das culturas medidos usando o pacote NeuronJ para ImageJ. Cada ponto de dados é n = 3 neuritos, e os dados são mostrados como média ± MEV. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3: Uma concentração de 20 milhões de células/mL de solução ativadora foi utilizada para bioimpressão dos modelos celulares. (A) A viabilidade celular foi calculada usando corantes de células vivas/mortas (Calceína-AM e homodímero de etídio-1, respectivamente). Os valores mostram que 72% ± 1% (média ± EPM, n = 3) do total de células por poço estão vivas e 29% ± 2% (média ± MEV, n = 3) das células estão mortas da população celular total por poço no Dia 4. Os valores apresentados representam a média ± EPM. (B) A porcentagem de populações celulares de neurônios e astrócitos por poço foi calculada através da análise de imagem da coloração mostrada na Figura 4. Os neurônios representam a porcentagem de células coradas positivamente para Β-III tubulina no Dia 7 (49% ± 3%, média ± EPM, n = 3), enquanto os astrócitos representam a porcentagem de células coradas positivas para GFAP no Dia 7 (30% ± 4%, média ± EPM, n = 3). Os valores apresentados representam a média ± EPM. Todas as imagens para os cálculos mostrados na Figura 3 foram realizadas em um sistema de imagem confocal, e todas as análises foram realizadas na plataforma de análise de imagens e no GraphPad Prism, conforme os métodos. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 4: Expressão de marcadores do tipo celular neural em coculturas bioimpressas 3D de neurônios glutamatérgicos e astrócitos no dia 7. (A,B) Coloração por imunofluorescência do marcador neuronal Β-III tubulina e do marcador astrócitos GFAP, obtida em plataforma de microscópio invertido com aumento de 10x. As barras de escala representam 100 μm. (C) Coloração imunofluorescente do marcador neuronal β-III tubulina e do marcador astrócitos GFAP co-corados com Hoechst, mostrados em visão plana XYZ, obtidos em um sistema de imagem confocal em aumento de 10x. Criado na plataforma de análise de imagens. A barra de escala representa 100 μm. (D) Coloração imunofluorescente do marcador neuronal β-III tubulina co-corada com Hoechst, imageada em um sistema de imagem confocal em aumento de 20x. A barra de escala representa 100 μm. (E) Coloração imunofluorescente do marcador glutamatérgico GluR2 co-corado com Hoechst, imageada em plataforma de microscópio invertido em aumento de 10x. A caixa 3E.1 mostra áreas destacadas de coloração de GluR2. A barra de escala representa 100 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Vídeo Suplementar 1: Neurônios glutamatérgicos e astrócitos foram bioimpressos na matriz de hidrogel usando a bioimpressora e foram fotografados a cada 12 h usando um microscópio de campo claro. Vídeo de imagens de campo brilhante tiradas de culturas de células durante a análise, os pontos de tempo são indicados no canto inferior direito e as barras de escala representam 400 μm. Clique aqui para baixar este arquivo.

Figura suplementar 1: Exemplo de imagens de análise de neurônios bioimpressos e astrócitos bioimpressos no Dia 4. Coloração de calceína-AM mostrada em verde (488 nm) e coloração de homodímero de etídio mostrada em vermelho (647 nm). A imagem é mostrada na visualização de plano XYZ, criada na plataforma de análise de imagem. A barra de escala representa 100 μm. (A) As imagens foram realizadas usando um sistema de imagem confocal em aumento de 4x. (B) As imagens foram realizadas com um sistema de imagem confocal em aumento de 10x Clique aqui para baixar este arquivo.

Figura 2 suplementar: Exemplo de imagem de controle negativo após coloração por imunofluorescência. Anticorpos primários foram omitidos, e anticorpos secundários verdes (488 nm) e vermelhos (647 nm) foram usados de acordo com os protocolos de imunomarcação. A imagem é mostrada na visualização de plano XYZ, criada na plataforma de análise de imagem. A barra de escala representa 100 μm. As imagens foram realizadas com um sistema de imagem confocal em aumento de 10x. Clique aqui para baixar este arquivo.

Discussão

A necessidade de modelos precisos do SNC nunca foi tão grande, e as limitações dos modelos tradicionais de cultura de células bidimensionais (2D) têm impulsionado uma geração de modelos complexos do SNC nos últimos anos¹⁹. Entretanto, muitos modelos 3D complexos que representam interações entre tipos de células neurais e a MEC apresentam limitações que impediriam a aplicação desses modelos em processos industriais 6,20,21. Neste protocolo, desenvolvemos um modelo de cocultura 3D de neurônios e astrócitos humanos derivados de iPSC, que visa resolver algumas dessas limitações usando a tecnologia de bioimpressão 3D para criar um arcabouço de hidrogel bioativo nos formatos de 96 e 384 poços.

A metodologia para o desenvolvimento desses modelos foi simplificada através do software de desenho de mapas de placas, protocolos de impressão gerados automaticamente e processo de impressão guiada a partir da bioimpressora. No entanto, devido à natureza sensível dos tipos celulares sensíveis derivados de iPSC usados neste protocolo, deve-se tomar cuidado com as seguintes etapas críticas no descongelamento e cultura. Em primeiro lugar, a inclusão do inibidor de ROCK (ROCKi) tem vários benefícios ao longo do processo de bioimpressão e durante o cultivo inicial. O descongelamento celular é um ponto crítico em que os neurônios podem experimentar uma resposta ao estresse, e protocolos de descongelamento inadequados podem diminuir as chances de sobrevivência²². Normalmente, recomenda-se descongelar células, adicionar meios e elevar as células à temperatura da incubadora da forma mais eficiente possível²³. No entanto, durante o processo de bioimpressão descrito neste protocolo, é necessário que os neurônios e astrócitos sejam ressuspensos em uma solução ativadora em vez de meio, e as células não serão elevadas acima da temperatura ambiente até o final da tiragem (até 30 minutos pós-descongelamento). Assim, a adição de ROCKi ao meio imediatamente após o descongelamento e sua inclusão durante as duas etapas de centrifugação (etapas 2.1--2.7 e 1.3.15-1.3.20) é imperativa para inibir as vias de estresse celular, o que resultaria em menores níveis de viabilidade²⁴. Além disso, foi demonstrado que o ROCKi promove o crescimento neurológico e melhora a maturação neuronal²⁵. Assim, a suplementação com ROCKi é continuada por 48 h pós-bioimpressão. No entanto, é imperativo remover a suplementação de ROCKi após 48 h para garantir a lavagem completa durante as mudanças de meios subsequentes antes que as células sejam usadas para ensaio.

Uma etapa adicional que requer atenção crítica é durante a adição de mídia pós-impressão e as alterações de mídia (etapas 2.8-2.13). O arcabouço de hidrogel bioimpresso tem uma rigidez biomecânica equivalente de apenas 1,1 kPa, equivalente à substância cinzenta. Conforme descrito na etapa 2.10, é fundamental pipetar suavemente para o lado do poço durante a adição e aspiração do meio para evitar perturbações. Isso é particularmente relevante para placas de 384 poços, onde o nível de gel ocupa uma proporção maior do volume total do poço. Este método também deve ser usado em poços de controle 2D para evitar o levantamento de borda de células e cisalhamento de excrescências de neuritos. Os autores também gostariam de destacar a importância da técnica estéril dentro da bioimpressora, que deve ser tratada com cautela equivalente à de um gabinete de biossegurança usado para culturas de células derivadas de iPSC. Isso inclui filtragem estéril 70% EtOH e dH2O usados nos procedimentos de greenlighting e impressão, manter tampas nos cartuchos e placas enquanto movem as mãos para dentro e para fora da bioimpressora e descontaminar superfícies dentro da bioimpressora com lenços de etanol 70% antes e depois da impressão.

O arcabouço de hidrogel bioimpresso, formado a partir de soluções de biotinta e ativador, selecionado para desenvolver este modelo é selecionado a partir de uma gama de biotintas e soluções ativadoras desenvolvidas pela Inventia Life Science para uso dentro da bioimpressora RASTRUM. A laminina e o ácido hialurônico foram identificados como moléculas de relevância para a maturação neuronal derivada da iPSC devido ao seu papel na orientação axonal, formação de sinapses e formação da rede perineuronal^26,27. Além disso, uma rigidez biomecânica de 1,1 kPa foi selecionada, uma vez que hidrogéis de baixa densidade demonstraram permitir um melhor crescimento de neuritos dos neurônios¹². Se forem feitas modificações no protocolo usando neurônios e astrócitos que foram diferenciados internamente ou de um fornecedor comercial diferente, recomenda-se fazer um teste de seleção de matriz para determinar o arcabouço de hidrogel mais suportável¹⁵. Além disso, a densidade celular também pode precisar ser otimizada se mudanças nas fontes celulares forem feitas para garantir a viabilidade ideal e evitar a superlotação de hidrogel. Para todas as modificações e solução de problemas relacionados à função da bioimpressora, os autores recomendam entrar em contato com os fabricantes e referenciar os protocolos do fabricante.

O SNC contém uma ampla gama de subtipos neuronais e células gliais, todos os quais existem em diferentes nichos cerebrais e têm papéis específicos contribuindo para a função^neural28. Dentro do contexto dessa ampla abrangência, este modelo representa apenas os dois tipos celulares mais abundantes (astrócitos e neurônios glutamatérgicos excitatórios). Importantes tipos celulares como micróglia, oligodendrócitos e células endoteliais formadoras de barreira hematoencefálica são omitidos desse sistema. A inclusão de microglia pode ser relevante no foco em interações neuroimunes, e oligodendrócitos podem ser de interesse em doenças que afetam a mielinização central. Além de seu papel na patologia, células como as células endoteliais formadoras da barreira hematoencefálica excretam enzimas metabolizadoras de fármacos, o que poderia afetar o uso desse modelo para ensaios farmacocinéticos²⁹. Uma outra limitação do modelo pode ser a proporção de astrócitos para neurônios; A proporção de astrócitos/neurônios varia muito entre as regiões cerebrais, com valores sugeridos entre 1:1 e 1:3^30,31. Este modelo tem uma proporção aproximada de 1:1,5 astrócitos para neurônios; Assim, esse modelo pode não ser relevante para modelar áreas cerebrais onde os astrócitos são mais abundantes, como em áreas da substância branca³⁰.

Outros protocolos para o desenvolvimento de modelos de cocultura bioimpressos 3D têm sido publicados nos últimos anos. Uma publicação de Sullivan et al., 2021, apresentou um modelo neural bioimpresso 3D usando células progenitoras neurais derivadas de iPSC, que demonstra alta viabilidade pós-impressão e aprimoramento da função neuronal em comparação com culturas 2D³². Entretanto, neste protocolo, células progenitoras neurais foram utilizadas como fonte celular e mantidas em cultura por 4 semanas. Neste protocolo, neurônios glutamatérgicos derivados de iPSC e astrócitos comercialmente disponíveis foram usados. Isso permite que uma rede 3D de células co-cultivadas seja estabelecida em apenas 7 dias; Como demonstrado pela análise de crescimento de neuritos, o crescimento de neuritos começa dentro de 24 h e continua de forma linear durante todo o período de 156 h para o qual o crescimento celular foi monitorado. O rápido estabelecimento dessas redes pode ser atribuído, em parte, ao uso de neurônios glutamatérgicos que utilizam a expressão gênica otimizada de NGN2 induzível por doxiciclina, que mostra a expressão de marcadores maduros do subtipo neuronal em 7 dias, mesmo em cultura 2D³³. O encurtamento desse período de crescimento com o uso dessa técnica é importante para a implementação de modelos na indústria biofarmacêutica, uma vez que o desenvolvimento de ensaios requer rápido retorno e desenvolvimento de modelos celulares¹⁵.

Em conclusão, este modelo mostra potencial para um modelo 3D de neurônios e astrócitos, que é estabelecido de forma rápida e conveniente para fins de triagem. Aplicações futuras para este tipo de modelo poderiam ser para esforços de descoberta de drogas em diferentes doenças do SNC, com a oportunidade de expandir para diferentes doenças usando linhagens iPSC de pacientes ou doenças editadas geneticamente. Além disso, o uso de neurônios glutamatérgicos derivados da expressão de NGN2 induzida por doxiciclina iPSC permite que as células atinjam a maturidade em menos tempo, o que pode ser utilizado para o desenvolvimento de modelos do cérebro envelhecido para pesquisa em neurodegeneração. Este sistema também pode ser expandido através do uso de tipos celulares adicionais em cocultura, incluindo micróglia e oligodendrócitos.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
2-mercaptoetanol	Thermofisher	31350010
placa de 384 poços	PerkinElmer	6057300
placa de 96 poços	PerkinElmer	6055300
Fluido ativador F299	Inventia Life Science	N/A
Fluido ativador F3	Inventia Life Science	N/A
B27 (50x) menos Vit A	Thermofisher	12587010
Fluido Bioink F261	Inventia Life Science	N/A
Fluido Bioink F32	Inventia Life Science	N/A
Hidroclina de doxiciclina	Sigma Aldrich	D5207
GlutaMAX (100x)	Thermofisher	35050061
Goat anti-mouse IgG H& L Alexa Fluor 647	Abcam	ab150115
Cabra anti-coelho IgG H & L Alexa Fluor 488	Abcam	ab150077
Hoechst	Abcam	ab228551
Proteína Recombinante BDNF Humana	Thermofisher	PHC7074
Proteína Recombinante NT3 Humana	Thermofisher	PHC7036
astrócitos	iCell Fujifilm CDI	1434
INCell Analyser 6500HS	Dispositivos Moleculares	N / A	sistema de imagem de alto conteúdo
Incucyte S3	Sartorius	N/A
ioNeurônios glutamatérgicos (frasco grande)	Bit.bio	e001
Laminina (1 mg/mL)	Sigma Aldrich	L2020
Kit vivo/morto (Calceína-AM, Ethidium homo-dímero-1)	Invitrogen	L3224
Camundongo anti-BIII tubulina NL637 conjugado	R& D systems	SC024
Mídia neurobasal	Thermofisher	21103049
Soro de burro normal	Abcam	ab7475
NucBlue Live (Hoechst 33342)	Thermofisher	R37605
Opti-MEM	Thermofisher	11058021
Paraformaldeído	Sigma Aldrich	P6148
PEI 50% em H2O	Sigma Aldrich	181978
Pierce Borate Buffer 20x	Thermofisher	28341
Prism	GraphPad		Software de análise de dados
Receptor de glutamatre anti-ionotrópico de coelho 2 (GluR2)	Abcam	ab206293
RASTRUM(TM) Bioprinter	Inventia Life Science	N/A	Bioprinter
Cartuchos de bioimpressora RASTRUM(TM)	Inventia Life Science	N/A	Cartuchos de bioimpressora Placa
de direcionamento RASTRUM(TM)	Inventia Life Science	N/A	Placa de direcionamento
Inibidor de Rho quinase (ROCK)	Abcam	ab120129
Ovinos anti-GFAP NL493 conjugado	R& D systems	SC024
Sinaliza Imagem Artista	PerkinElmer	N/A	Plataforma de análise de imagem
Triton X-100	Thermofisher	HFH10
Zeiss Axio Observer	Zeiss	N/A	Plataforma de microscópio invertido