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Artigo de método

A combinação de fração vascular estromal isolada mecanicamente e hidrogel de fibrina: um protocolo de processamento

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DOI:

10.3791/65860

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17 de novembro de 2023

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1Department of Surgery, Triemli City Hospital Zurich, 2Department of Plastic Surgery and Hand Surgery, University Hospital Zurich, University of Zurich, 3Institute for Human Tissue Restoration, Department of Plastic and Reconstructive Surgery, Yonsei University College of Medicine

* These authors contributed equally

Neste artigo

Resumo

A fração vascular estromal isolada mecanicamente (SVF) em combinação com um hidrogel de fibrina oferece um transportador fácil e eficiente para células estromais derivadas de tecido adiposo viáveis para várias indicações, incluindo engenharia de tecidos e/ou fins de cicatrização de feridas. Aqui, apresentamos a preparação de uma construção mecânica de SVF (mSVF)-hidrogel de fibrina para pesquisa translacional e aplicação clínica.

Resumo

O potencial regenerativo das células estromais derivadas do tecido adiposo (ASCs) ganhou atenção significativa na pesquisa regenerativa e translacional. No passado, a extração dessas células do tecido adiposo exigia um processo baseado em enzimas em várias etapas, resultando em uma mistura de células heterogêneas consistindo de ACSs e outras células, que são denominadas conjuntamente de fração vascular estromal (SVF). Os protocolos de isolamento mecânico SVF (mSVF) introduzidos mais recentemente são menos demorados e ignoram as preocupações regulatórias. Recentemente, propusemos um protocolo que gera mSVF rico em células estromais com base em uma combinação de emulsificação e centrifugação. Um problema atual na aplicação de mSVF para aplicação de terapia de feridas é a falta de um andaime que forneça proteção contra manipulação mecânica e dessecação. Os hidrogéis de fibrina demonstraram ser um adjuvante útil na transferência de células para fins de cicatrização de feridas no passado. No trabalho aqui, delineamos as etapas de preparação de uma construção de hidrogel mSVF-fibrina como uma nova abordagem para pesquisa translacional e aplicação clínica.

Introdução

Nos últimos anos, a cirurgia plástica regenerativa surgiu como um pilar adicional da cirurgia plástica1. A cirurgia plástica regenerativa visa restaurar o tecido danificado por meio da transferência de fatores solúveis, células e tecidos colhidos do paciente para promover a restauração tecidual de maneira minimamente invasiva2. As células-tronco derivadas do tecido adiposo (ASCs) ganharam atenção devido à sua capacidade de se diferenciar em múltiplas linhagens mesenquimais, tornando-as candidatas promissoras para a pesquisa em medicina regenerativa3. Seu perfil de citocinas apresenta efeitos angiogênicos, imunossupressores e antioxidantes4.

Tradicionalmente, as ASCs eram isoladas do tecido adiposo usando uma abordagem enzimática com colagenase, resultando em uma fração vascular estromal (SVF), que foi posteriormente cultivada para obter ASCs. Essas tecnologias baseadas em laboratório são caras, demoradas e, principalmente, sujeitas a restrições regulatórias rígidas, complicando a tradução clínica 5,6,7. Em contraste, os protocolos de fração vascular estromal isolada mecanicamente (mSVF) oferecem os benefícios clínicos de não apenas contornar questões regulatórias, mas também minimizar os riscos de contaminação 8,9.

Numerosos protocolos para isolar mecanicamente a FVS foram descritos10. Dentre estes, o protocolo de mudança publicado por Tonnard et al. tem ganhado mais atenção entre os cirurgiões regenerativos11. A gordura coletada por meio de procedimentos padrão de lipoaspiração, conhecidos como lipoaspirados, pode ser transferida entre duas seringas portáteis conectadas a um dispositivo de conexão, resultando em uma forma líquida conhecida como nanogordura. Os benefícios óbvios desses protocolos de isolamento de mSVF incluem tempo de processamento reduzido, risco mínimo de contaminação, pois todo o procedimento é feito em um ambiente bem controlado e possível tradução clínica imediata12.

Evidências pré-clínicas e clínicas indicam que as propriedades do mSVF, incluindo viabilidade celular e propriedades de cicatrização de feridas, são comparáveis aos métodos de isolamento enzimático padrão12. O potencial da MFV na promoção da cicatrização de feridas em modelos de ratos e murinos foi validado por meio de estudos in vivo de Chen et al. e Sun et al.13,14. No entanto, há uma falta de dados disponíveis sobre a cicatrização de feridas no ambiente clínico. Resultados promissores foram relatados quando um grupo de estudo realizou transplante autólogo de gordura em um paciente de 83 anos que teve uma ferida com um implante exposto em uma fratura exposta da extremidade inferior15. Além disso, Lu et al. realizaram uma comparação entre mSVF e terapia de feridas por pressão negativa em uma coorte de 20 pacientes com feridas crônicas16. Seus achados revelaram que o tratamento com mSVF resultou em uma taxa mais alta de cicatrização de feridas em comparação com a terapia de feridas por pressão negativa16. Ambos os estudos mencionados injetaram mSVF isoladamente ou em combinação com um gel na área alvoda ferida 15,16.

No cenário do mundo real, a aplicação clínica do mSVF é limitada devido às taxas de absorção imprevisíveis nos locais receptores17,18. Os scaffolds prometem um remédio para esse problema, pois auxiliam na retenção celular, vascularização e integração no tecido circundante 19,20,21. Os hidrogéis de fibrina são uma ferramenta comumente usada, aprovada pela FDA, usada em disciplinas cirúrgicas e demonstraram ser um portador eficaz de mSVF19. O gel de fibrina é um material biopolimérico que oferece várias vantagens no funcionamento como carreador celular: apresenta excelente biocompatibilidade, promove a fixação celular e é capaz de se degradar de maneira controlável 22,24,25. Além disso, demonstra reação inflamatória e de corpo estranho mínima e é facilmente absorvida durante o curso natural da cicatrização da ferida22. Acreditamos que as diversas capacidades regenerativas das células mSVF mencionadas e a combinação vantajosa com um hidrogel de fibrina podem fornecer uma abordagem inovadora para melhorar os processos de cicatrização de feridas. No geral, essa abordagem permite uma entrega tópica eficiente de células mSVF viáveis. Apresentamos o protocolo que combina mSVF com um hidrogel de fibrina destinado à aplicação em cicatrização de feridas.

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Protocolo

Este estudo foi realizado de acordo com a Declaração de Helsinque. Todos os doadores adultos forneceram consentimento informado por escrito para permitir o uso posterior das amostras de tecido coletadas. O protocolo segue as diretrizes do comitê de ética em pesquisa com seres humanos de nossa instituição.

1. Colheita de tecido adiposo

  1. Colher o tecido adiposo realizando uma lipoaspiração padrão em uma técnica convencional de coleta de gordura descrita em publicações anteriores26,27. Certifique-se de usar uma solução tumescente que consista em lactato de ringer regular e epinefrina na proporção de 1: 200.000.
  2. Realizar a lipoaspiração com cânula de aspiração de 4 mm, sob pressão negativa e vibração, para bolsa estéril. Transfira a gordura colhida para o laboratório imediatamente.

2. Isolamento mSVF

  1. Execute as etapas a seguir (seções 2 e 3) em uma coifa de cultura de células para fornecer uma área de trabalho asséptica. Use um jaleco e luvas regulares para garantir o nível de segurança biológica 2.
  2. Prepare o meio de cultura: Suplementar 500 mL de meio de Eagles modificado de Dulbecco (DMEM) com alto teor de glicose com 50 mL de soro fetal bovino (FBS), 5 mL de penicilina-estreptomicina.
  3. Transfira o lipoaspirado para um tubo de centrífuga de 50 mL.
  4. Transfira o lipoaspirado para uma seringa Luer-lock estéril de 20 ml e coloque um conector de 1,4 mm. Certifique-se de que não há ar dentro da seringa.
  5. Conecte uma segunda seringa Luer-lock de 20 mL no lado contralateral do conector de 1.4 mm.
  6. Empurre o tecido adiposo de uma seringa para a outra por um total de 30 vezes.
  7. Transfira a gordura emulsionada para um novo tubo de centrifugação de 50 mL.
  8. Centrifugue a gordura emulsionada a 500 x g por 10 min.
  9. Após a centrifugação, descarte a camada superior oleosa. Em seguida, recolha a camada central de mSV purificada. Transfira-o para um novo tubo de centrifugação de 50 mL e descarte a fase aquosa.
  10. Encher o tubo de centrifugação com meio de cultura (do passo 2.2) até à marca de 40 ml.
  11. Coloque o tubo da centrífuga na centrífuga e centrifugue novamente a 500 x g por 5 min.
  12. Colete a camada de mSVF resultante e transfira-a para um novo tubo de centrífuga de 50 mL.

3. Fabricação de hidrogel de fibrina mSVF

  1. Combine 100 μL de mSVF com 10 μL de trombina (100 U / mL), 10 μL de CaCl2 (80 mM) e 70 μL de ácido tranexâmico (100 mg / mL) em um tubo estéril de 1.5 mL.
  2. Use uma ponta de pipeta nova para adicionar 10 μL de fibrinogênio (100 mg / mL) como último componente, pouco antes da aplicação. Esteja ciente de que a polimerização do hidrogel é observada dentro de aproximadamente 10-30 s.
  3. Para aplicação clínica, execute esta última etapa pouco antes da administração tópica, de preferência à beira do leito. Para fins analíticos, transfira para uma placa de 12 poços por pipetagem.

4. Ensaio de viabilidade e histologia

  1. Pipetar 200 μL da mistura mSVF-hidrogel da etapa 3.3 em um poço de uma placa de 12 poços.
  2. Pipetar 100 μL da coleção de mSVF (etapa 2.12.) em um poço como controle positivo.
  3. Pipetar 200 μL de hidrogel de fibrina apenas para um poço como controlo negativo.
  4. Coloque a placa de 12 poços em uma incubadora regular a 37 °C e 5% de CO2 por 30 min.
  5. Após este tempo, adicione 1 mL de resazurina (azul de alamar, concentração de 10%, diluído em meio de cultura) a cada poço.
  6. Após a adição, incubar a placa de 12 poços a 37 °C e 5% de CO2 durante 24 h.
  7. Após 24 h, medir a primeira intensidade de fluorescência utilizando um leitor de microplacas multimodo de imagiologia celular, utilizando um comprimento de onda de excitação de 555 nm e um comprimento de onda de emissão de 596 nm.
  8. Realize medições consecutivas de intensidade de fluorescência nos dias 3 e 7.
  9. Se a avaliação histológica for necessária, interromper o experimento nos dias 1, 3 e 7 e fixar o hidrogel de fibrina em paraformaldeído a 4% a 4 °C por 24 h. Após a fixação, adicione solução salina tamponada com fosfato a 1% (PBS) e armazene-a a 4 °C.
  10. Incorporar os hidrogéis num composto de temperatura de corte ideal (OCT) e seccionar blocos congelados com 10 μm de espessura com um criostato. Manchar os cortes com solução de hematoxilina e eosina (H&E) de acordo com protocolos padrão28.

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Resultados

Ensaio de resazurina
Primeiro, examinamos a viabilidade celular in vitro das células mSVF. Para isso, realizamos um ensaio de viabilidade celular de resazurina nos dias 0, 3 e 7. A viabilidade celular nos dias 0, 3 e 7 de um total de quatro amostras é mostrada na Figura 1. Os valores do dia 0 servem como linha de base e foram definidos como 100%. No dia 3, o controle positivo (mSVF) mostrou uma ligeira diminuição para 78,92% (± 5,33%), enquanto a combinação mSVF-...

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Discussão

O isolamento mecânico da SVF fornece uma alternativa elegante à abordagem enzimática tradicional e oferece amplo acesso para aplicação clínica29. De fato, a MFV, como proposto no presente manuscrito, já está em uso clínico para o tratamento de cicatrizes de tecidos moles ou como adjuvante para procedimentos estéticos30. O protocolo apresentado aqui fornece um método simples para a entrega tópica eficiente de células mSVF viáveis. Enquanto o...

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Divulgações

Os autores não têm nada a divulgar.

Agradecimentos

Bong-Sung Kim é apoiado pela Fundação Alemã de Pesquisa (KI 1973/2-1) e pela Fundação Novartis para Pesquisa Médico-Biológica (#22A046).

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
12-WellplateSarstedt83.3921
4′,6-diamidino-2-fenilindol (DAPI)BiochemicaA1001.0010
50 mL-FalconFalcon352070
Toalhas Absorventes, Pacote com DoisHalyard89701
Alamar blue 25 mLInvitrogenDAL1025
Albumina, Bovino (BSA)VWR0332-500G
Biotek Cytation 5 LeitorMicroplacas Multimodo para Imagens Celulares
CaCl2 Sigma-AldrichC5670-500G
CriostatoMicrótomo
DMEM com 4,5 g/L de glicose, com L-Glutamina, com piruvato de sódioVWR392-0416
DPBSGibco14190-144
EpinefrinaSigma-AldrichE4250
Soro Fetal BovinoBiowestS181H-500
Fibrinogênio Plasma Humano 100 mgSigma-Aldrich341576-100MG
FormalinaFisher ScientificSF100-4
Formalina 4%Formafix1308069
FSC 22-Einbettmedium, blauBiosystems3801481S
Hematoxilina & Solução de eosinaSigma-AldrichH3136 / HT110132
Ringer com lactato' s Solução 1000 mLB BraunR5410-01
Mercedes Cânula 4mmMicroAirePAL-R404LL
NaCl 0,9%Bbraun570160
OCT Matriz de Incorporação 125 mLCellPathKMA-0100-00A
ParaformaldeídoFisher Scientific10342243
PBS 1%Sigma-AldrichP4474
PenStrepSigma-AldrichP4333-100ML
Petrídico 150mmSarstedt83.1803
Faloidina-iFluor 488 ReagenteAbcamab176753
Seringa Estéril 20 mL LuerHENKE-JECT5200-000V0
Seringa Estéril 30 mL Luer-LockBD10521
Trombina de Plasma HumanoSigma-AldrichT6884-100UN
Ácido tranexâmicoOrpha Swiss6837093
Tulipfilter 1.2Lencion CirúrgicoATLLLL
Tulipfilter 1.4Lencion CirúrgicoATLLLL
de Agilent 

Referências

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