Method Article

Processamento de tecidos e isolamento de fibroblastos primários da vagina humana

DOI:

10.3791/65864

⸱

November 22nd, 2024

 ,  , 
1Department of Obstetrics, Gynecology and Reproductive Biology, Division of Urogynecology, Massachusetts General Hospital, 2Massachusetts General Hospital/Vincent Center for Reproductive Biology/Harvard Medical School, 3Department of Obstetrics, Gynecology and Reproductive Biology, Massachusetts General Hospital, Vincent Center for Reproductive Biology

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Este protocolo demonstra uma técnica confiável e eficaz para isolar fibroblastos primários do tecido vaginal humano na pré-menopausa ou na pós-menopausa. Os protocolos existentes para isolamento de fibroblastos vaginais não consideram os desafios do isolamento celular do tecido senescente. O tecido vaginal foi obtido de mulheres após cirurgia de prolapso de órgãos pélvicos.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

O prolapso de órgãos pélvicos é um distúrbio que afeta seriamente a qualidade de vida das mulheres. Ocorre quando músculos e ligamentos enfraquecem e fazem com que os órgãos pélvicos caiam mais baixo na pelve, criando uma protuberância na vagina. A cirurgia para corrigir o prolapso dos órgãos pélvicos tem sido um tratamento básico. Recentemente, tem havido um interesse crescente em estudar a composição tecidual de pacientes com prolapso no nível celular.

Atualmente, há pouco consenso sobre o efeito da idade do doador ou do paciente nas terapias baseadas em células. Os protocolos atuais publicados para isolamento de fibroblastos vaginais concentram-se no tecido pré-menopausa ou negligenciam comentar sobre a idade do tecido do doador. A maioria dos protocolos existentes usa modelos animais. A consistência do tecido vaginal humano é mais densa do que os tecidos usados na maioria dos protocolos. Neste estudo, o tecido vaginal humano foi obtido principalmente de doadores mais velhos, o que provavelmente contribuiu para a falha dos protocolos existentes.

O objetivo deste estudo é descrever um protocolo padrão para a aquisição confiável de fibroblastos vaginais humanos, independentemente da idade da doadora e do status da menopausa. Os resultados foram reproduzidos usando tecido de nove doadores separados que foram submetidos à cirurgia de prolapso de órgãos pélvicos. Seis pacientes estavam na pós-menopausa, sendo que a doadora mais velha tinha 78 anos. A idade média dos doadores de tecidos foi de 59 anos.

Aqui, descrevemos um método confiável para gerar uma suspensão unicelular enriquecida com fibroblastos usando uma combinação de dissociação enzimática e mecânica e agrupamento de suspensão celular de várias biópsias vaginais de um único doador. O isolamento confiável de fibroblastos primários vaginais humanos pode ser útil no estudo do prolapso de órgãos pélvicos, bem como nas interações microbioma-hospedeiro.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

A disparidade de gênero na ciência e na pesquisa é um problema contínuo. A pesquisa sobre distúrbios que afetam principalmente pessoas do sexo feminino é subfinanciada1. O prolapso de órgãos pélvicos é um distúrbio fortemente associado ao sexo feminino. Ocorre quando músculos e ligamentos enfraquecem e fazem com que os órgãos pélvicos caiam mais baixo na pelve, criando uma protuberância na vagina2. Pouco se sabe sobre as interações celulares no contexto dessa fisiopatologia, nem como os fatores no nível do tecido afetam o sucesso das intervenções cirúrgicas3.

Células primárias, em vez de linhagens celulares, são amplamente reconhecidas como essenciais para a pesquisa clínica translacional, fornecendo mais relevância fisiológica4. As células primárias são retiradas diretamente do tecido corporal de interesse e podem imitar com mais precisão a fisiologia in vivo . O isolamento de fibroblastos primários da vagina humana pode ser útil para estudar os mecanismos biológicos do prolapso de órgãos pélvicos e modelagem de doenças, considerando as principais características do doador, como idade e estado menopausal.

O prolapso de órgãos pélvicos geralmente afeta indivíduos mais velhos ou na pós-menopausa. O isolamento e a proliferação de células primárias de fibroblastos no estudo dessa condição são desafiadores devido à redução das populações de células e à capacidade clonogênica de doadores mais velhos5. Em nossa experiência, o uso de protocolos descritos anteriormente para a dissociação do tecido vaginal não conseguiu extrair nenhum fibroblasto de uma biópsia de tecido padrão de 1 cm2 .

Por meio de uma revisão da literatura, verificamos que estudos semelhantes foram subdivididos em dois grupos: modelos animais, como osmurinos6, e modeloshumanos7,8. Ao seguir o protocolo do camundongo, o uso de tesouras para processamento de tecidos de tecido vaginal humano resultou em digestão mecânica inadequada. A extrapolação de protocolos usando tecido murino e outros locais de tecido9 não teve sucesso.

A maioria dos artigos que utilizaram amostras vaginais humanas utilizou tecido de indivíduos na pré-menopausa com prolapso de órgãos pélvicos 7,10. Embora alguns artigos relatassem o uso de amostras de indivíduos na pré-menopausa e na pós-menopausa11, eles não descreveram com detalhes suficientes o protocolo usado para isolar com sucesso fibroblastos de doadores mais velhos ou na pós-menopausa. O isolamento e a modelagem da doença com fibroblastos do tecido pós-menopausa podem ser essenciais para a compreensão da fisiopatologia celular do prolapso de órgãos pélvicos, uma vez que essa condição tem a maior prevalência em indivíduos na década seguinte àmenopausa12.

Descrevemos um método para isolamento e cultura de uma suspensão unicelular enriquecida com fibroblastos de tecido vaginal humano usando uma combinação de dissociação mecânica e enzimática. Este artigo descreve um protocolo confiável sobre como adquirir fibroblastos vaginais humanos na pós-menopausa ou envelhecidos. As células isoladas foram confirmadas como fibroblastos por meio de exame morfológico usando microscopia de contraste de fase e imunofluorescência (IF) para avaliar a expressão de vimentina, F-actina e actina de músculo liso α (α-SMA).

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

O tecido vaginal foi obtido de mulheres submetidas à cirurgia de prolapso de órgãos pélvicos. O tecido vaginal coletado após a cirurgia foi considerado resíduo e seria descartado. O estudo foi realizado em conformidade com as diretrizes institucionais e foi aprovado pelo Conselho de Revisão Institucional do Massachusetts General Brigham.

1. Colheita de tecido vaginal do paciente

  1. Diagnostique o prolapso de órgãos pélvicos fazendo um histórico e usando os achados do exame pélvico: As medições de quantificação do prolapso de órgãos pélvicos (POP-Q) foram obtidas na clínica, mostrando evidências de prolapso de órgãos pélvicos.
  2. Utilizou-se os seguintes critérios de inclusão: maiores de 18 anos; história de prolapso sintomático de órgãos pélvicos; optando pela correção cirúrgica do prolapso de órgãos pélvicos.
  3. Exclua o seguinte: Mulheres grávidas e pacientes que se recusam a doar tecidos.
  4. Apare o excesso de tecido vaginal como uma etapa necessária da cirurgia de prolapso de órgãos pélvicos. Este epitélio vaginal é excisado em espessura total após as seguintes cirurgias: colporrafia anterior, colporrafia posterior e colpocleise.
  5. Transporte o tecido para o laboratório em um copo de coleta de amostras estéril com solução salina normal ou meio DMEM/F12 (Gibco) sem soro. Mantenha no gelo.

2. Processamento e digestão de tecidos

  1. Preparação de tecidos
    1. Meça e corte o tecido para abranger toda a espessura do epitélio vaginal, criando segmentos de aproximadamente 1 cm2.
    2. Garanta a medição precisa do tamanho da biópsia1 cm 2.
      NOTA: Superestimar o tamanho da biópsia tecidual pode prejudicar a digestão tecidual.
    3. Prepare 2-3 biópsias vaginais adicionais medindo 1 cm2 cada de um único doador e deixe as biópsias de lado.
  2. Digestão mecânica
    1. Coloque a biópsia vaginal em uma placa de Petri de cultura de células de 10 cm. Pipete 500-1.000 μL de meio sem soro suplementado com 100 U / mL de penicilina / estreptomicina, 2,5 μg / mL de anfotericina Bonto no tecido vaginal para evitar que o tecido seque.
    2. Pique o tecido vaginal em pequenos fragmentos usando dois bisturis estéreis (nº 11 ou nº 15) em ambas as mãos.
    3. Certifique-se de que as pontas das lâminas estejam perpendiculares à superfície do tecido. Aplique pressão igual e constante na superfície do tecido, usando dois bisturis. Execute uma ação de puxar alternadamente para cortar o tecido em pedaços muito pequenos.
    4. Repita esta técnica de picagem usando a técnica de dois bisturis até que a amostra tenha uma consistência uniforme com pedaços de 1-2 mm.
      NOTA: A digestão mecânica usando esta técnica de dois bisturis de uma biópsia de 1 cm2 deve levar aproximadamente 15-20 minutos para ser concluída.
    5. Adicione 2-3 mL de meio DMEM/F12 sem soro suplementado com 100 U/mL de penicilina/estreptomicina, 2,5 μg/mL de anfotericina B à placa, suspendendo o tecido picado. Pipete a solução contendo fragmentos de tecido para cima e para baixo para quebrar quaisquer aglomerados.
  3. Digestão enzimática
    1. Transfira a solução contendo fragmentos de tecido para um tubo cônico de 15 mL. Adicione meio DMEM/F12 sem soro à placa de cultura de tecidos onde o tecido vaginal foi picado para coletar quaisquer fragmentos de tecido restantes. Transfira a solução contendo fragmentos de tecido para o tubo cônico. Adicione mais mídia DMEM/F12 sem soro até que o volume total seja de 10 mL.
    2. Dissolva 5 mg de Liberase em 1 mL de água estéril (5 mg / mL). Armazenar em alíquotas de 230 μL a -20 °C por até um mês ou -80 °C por 6 meses.
    3. Adicione 230 μL de Liberase (estoque de 13 U / mL) ao tubo, com concentração final de 0,3 U / mL.
      NOTA: A atividade da liberase pode variar entre os lotes. Descongele cada alíquota imediatamente antes de usar em banho-maria. Evite congelamento e descongelamento repetidos.
    4. Repita as etapas 2.1-2.3 para 2-3 biópsias vaginais adicionais do mesmo doador.
      NOTA: Mantenha cada solução contendo fragmentos de tecido de uma única biópsia em tubos cônicos separados. Por exemplo, 4 biópsias vaginais em 4 tubos. Isso é importante para a peletização ideal das células após a centrifugação.
    5. Incubar os tubos durante 3 h a 37 °C com agitação constante e vigorosa utilizando um misturador de amostras.
    6. Coloque um misturador de amostras em uma incubadora de CO2 . Mantenha agitação constante. (Configurações do misturador de amostra: 25 rpm de movimento rotacional por 5 s, 30° de recíproco (rotação de inclinação) por 5 s e 2° de movimento de vibração (vórtice) por 3 s).
    7. Durante a incubação, vórtice os tubos em intervalos de 30 minutos.
    8. Centrifugue as amostras a 3.000 x g por 5 min. Remova e descarte o sobrenadante.
    9. Ressuspenda o pellet em 1-2 mL de meio DMEM/F12 com 10% de soro fetal bovino (FBS) e 100 U/mL de penicilina/estreptomicina, 2,5 μg/mL de anfotericina B para diluir a enzima Liberase. Pipetar vigorosamente até que o pellet esteja totalmente ressuspenso.

3. Cultura celular

  1. Remoção de fragmentos de tecido não digeridos
    1. Coloque um filtro de células de 100 μm sobre um recipiente cônico estéril de 50 mL.
    2. Agrupe a suspensão celular das múltiplas biópsias de tecido do mesmo doador.
    3. Coe a suspensão de tecido/enzima, pressionando com um êmbolo de seringa de 5 mL. Repita esta etapa até que os fragmentos de tecido restantes pareçam estar totalmente pressionados.
      NOTA: Pode haver algum muco dos fragmentos de tecido da vagina que não é totalmente trabalhado através do filtro. Descarte o muco com o filtro de células.
  2. Pool de cultura celular
    1. Suspensão de células agrupadas em placa de múltiplas biópsias vaginais (do mesmo doador) em placa de Petri (60 mm x 15 mm).
    2. Incubar a placa de Petri numa incubadora de CO2 a 37 °C durante a noite.
    3. Observe e confirme a presença de células não aderentes com um microscópio de contraste de fase.
    4. Certifique-se de que o foco do microscópio esteja na parte inferior da placa.
      NOTA: Pode haver muitas células imunológicas em primeiro plano. Um número menor de fibroblastos será fixado no fundo da placa.
    5. Aguarde 18-24 h antes de trocar o meio de cultura celular para garantir a adesão celular adequada.
    6. Troque o meio de cultura a cada três dias até que ocorra 80% de confluência. Quando as células atingirem 80-90% de confluência, expanda para um frasco maior ou congele alíquotas de células para uso futuro.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

O tecido vaginal foi coletado de 10 doadores independentes submetidos à cirurgia de prolapso de órgãos pélvicos. Usando o protocolo descrito, as células foram isoladas do tecido vaginal humano. As populações de células tinham uma aparência alongada, plana e fusiforme característica. Como outros estudos, observamos capacidades de duplicação celular significativamente mais lentas e capacidade clonogênica reduzida dos fibroblastos com o aumento da idade do doador. Essas diferenças foram marcantes quando comparados fibroblastos isolados de indivíduos mais velhos (75-78 anos) com aqueles isolados de indivíduos jovens (35-47 anos). As células de doadores de meia-idade exibiram um perfil intermediário (56-61 anos). As taxas de proliferação celular foram inicialmente estimadas por visualização direta usando um microscópio de contraste de fase com a mesma densidade de semeadura conhecida.

figure-results-1
Figura 1: Representação diagramática do protocolo. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

A Figura 1 mostra uma representação diagramática do protocolo de dissociação e isolamento. Seguindo essas etapas, este protocolo produziu uma taxa de sucesso de 90% do isolamento primário de fibroblastos em nove em cada dez doadores em número de células suficiente para permitir a subcultura de células. A idade média dos doadores era de 59 anos.

Protocolo (Autor, ano)Tecido doador do protocolo originalNúmero de doadoresIdade do doador em anosFibroblastos obtidosMorfologia
Ruiz-Zapata et al., 2013Vagina humana356-78NãoN/A
Khan et al., 2016Orelha e cauda do rato248-65NãoN/A
Waise et al., 2019Tecido humano356-75NãoN/A
Nadalutti et al., 2020Prepúcio humano165NãoN/A
AtualVagina humana1035-79SimEm forma de fuso

Tabela 1: Comparação de protocolos para isolamento bem-sucedido de fibroblastos vaginais humanos. Comparação de diferentes protocolos existentes com o nosso e evidenciado por resultados morfológicos.

A Tabela 1 mostra os resultados do uso de outros protocolos para tentar o isolamento de fibroblastos vaginais neste estudo. Desenvolvemos um protocolo padrão para o isolamento de fibroblastos primários da mucosa vaginal e de doadoras mais velhas5.

Testamos vários protocolos estabelecidos, incluindo os listados na Tabela 1, e não observamos sucesso no isolamento celular usando esses protocolos em nosso estudo. Propomos as seguintes razões para suas limitações.

O protocolo publicado por Ruiz et al.3 envolve a raspagem da fáscia e o corte do tecido em pequenos pedaços. Em nossa experiência, é difícil distinguir a fáscia, e as tentativas de raspagem podem resultar em uma redução significativa no rendimento celular. Embora esse método seja direto, ele carece de detalhes críticos, o que limita sua generalização. Além disso, a digestão mecânica neste protocolo parece insuficiente para o tecido pós-menopausa, que tende a ser mais denso.

Os protocolos publicados por Khan et al.9 e Waise et al.13 empregam tesouras para picagem de tecidos, que não introduzem forças de cisalhamento multidirecionais significativas em comparação com a técnica de bisturi. Em nossa experiência, o método da tesoura também não funcionou de forma eficaz.

Por fim, o protocolo de Nadalutti et al.14 , que utilizou o método do explante, não produziu fibroblastos com sucesso em nossas mãos. Este método pode ser menos eficaz devido à natureza do tecido pós-menopausa, que pode exigir processamento mecânico e enzimático mais agressivo para dissociar os fibroblastos com sucesso.

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Figura 2: Imagem de contraste de fase de células suspensas no dia 0. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

A Figura 2 mostra as células suspensas no dia 0 usando nosso protocolo.

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Figura 3: Imagem de contraste de fase de fibroblastos primários vaginais no dia 14 de cultura com aumento de 100x de uma suspensão de células agrupadas de três biópsias de tecido de 1 cm2 . Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

A Figura 3 mostra fibroblastos primários com aumento de 100x de uma suspensão de células agrupadas de 3 biópsias de tecido de 1 cm² de dimensões.

A identidade dos fibroblastos foi investigada por técnicas de imunofluorescência, conforme descrito anteriormente, com pequenas modificações. Para verificar a origem celular das células vaginais primárias, utilizamos biomarcadores específicos de origem fibroblástica via coloração imunofluorescente. As células foram identificadas como fibroblastos com base na coloração positiva de vimentina (Figura 4), F-actina e α-SMA de amostras de tecido na pré-menopausa e pós-menopausa (Figura 5). Os fibroblastos foram cultivados para expansão com alta viabilidade (>90%) para uso em experimentos.

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Figura 4: Coloração positiva de vimentina de fibroblastos vaginais. Os fibroblastos primários de tecido pré-menopausa e pós-menopausa isolados foram submetidos à análise de FI e as imagens foram obtidas com aumento de 200x. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Figura 5: Coloração positiva de F-actina e α-SMA de fibroblastos vaginais. Os resultados da expressão proteica em comparação com o controle de IgG. As imagens foram coletadas com aumento de 200x. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Muitos estudos anteriores relataram como isolar fibroblastos primários da vagina humana 3,7. Vários estudos usaram tecido vaginal humano de indivíduos na pré-menopausa com prolapso de órgãos pélvicos. Embora alguns trabalhos relatem o uso de tecido de indivíduos na pré-menopausa e na pós-menopausa 7,11, eles não descrevem com detalhes suficientes o protocolo usado para isolar com sucesso fibroblastos de doadores mais velhos ou na pós-menopausa. A parede vaginal é mais espessa em mulheres na pós-menopausa com prolapso genital do que em mulheres na pré-menopausa, o que pode explicar a maior dificuldade de isolamento nessa população13. O isolamento bem-sucedido de doadores na pós-menopausa é essencial para a modelagem e investigação da doença, pois os distúrbios do assoalho pélvico são mais prevalentes nas faixas etárias pós-menopáusicas ou mais avançadas.

Estabelecemos um protocolo para colher e cultivar fibroblastos vaginais humanos de doadoras com idade entre 35 e 78 anos. A origem celular das células vaginais primárias foi confirmada por biomarcadores de origem fibroblástica via coloração imunofluorescente.

O procedimento de isolamento de fibroblastos vaginais humanos apresentado aqui permite o isolamento e a cultura de células primárias de fibroblastos. Em nossa experiência, o uso de protocolos publicados anteriormente para tecidos animais9e humanos 3,14,16 para dissociação de células primárias não conseguiu extrair nenhum fibroblasto de amostras de vagina humana neste estudo14.

Nossa hipótese é duas razões prováveis para os desafios da dissociação celular do tecido vaginal humano: (1) a espessura dérmica da mucosa é maior em doadores mais velhos e quando comparada à do tecido não mucoso de doadores mais velhos13,17 dificultando a dissociação celular e (2) a densidade de fibroblastos pode ser acentuadamente reduzida em indivíduos mais velhos17.

Dados esses desafios, existem algumas etapas críticas neste protocolo que não devem ser modificadas. O primeiro passo crítico é a implementação de uma digestão mecânica muito rigorosa. Aqui, usamos a técnica de dois bisturis. Em nossa experiência, a substituição por tesouras para picar o tecido não produz fragmentos pequenos o suficiente para dissociar os fibroblastos do tecido vaginal humano.

A outra etapa crítica é agrupar a suspensão celular e agrupar 3-4 biópsias de espessura total (1 cm2) de um único doador. Isso é necessário para obter células suficientes para o cultivo contínuo. Em todos os casos, colhemos significativamente mais tecido do que 1 cm2 , pois o excesso de epitélio vaginal é aparado como parte necessária da cirurgia de prolapso de órgãos pélvicos. Neste estudo, reunimos apenas suspensões celulares originadas do mesmo doador, pois buscamos investigar e diferenciar as características celulares e a proliferação entre vários doadores.

Nosso protocolo tem uma vantagem distinta: a digestão mecânica e enzimática leva a melhores rendimentos para o tecido pós-menopausa, mas não tem um impacto negativo nas amostras da pré-menopausa.

Reconhecemos várias limitações ao nosso protocolo. O acesso ao tecido vaginal humano pode ser um desafio em situações em que a cirurgia de prolapso vaginal não está sendo realizada. A necessidade de agrupamento de suspensões celulares de múltiplas amostras de biópsia de tecido também pode ser uma limitação.

Em conclusão, este protocolo para aquisição de fibroblastos vaginais humanos será uma ferramenta útil para futuras investigações em distúrbios do assoalho pélvico, especialmente em indivíduos na pós-menopausa, bem como uma adição importante à pesquisa em saúde da mulher.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Não temos conflitos de interesse a divulgar.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Gostaríamos de expressar nossa gratidão a todos os membros do Centro Vincent de Biologia Reprodutiva do Hospital Geral de Massachusetts, bem como à VIncent Memorial Hospital Foundation, por seu generoso apoio. Agradecimentos especiais ao Dr. Bo Rueda e seu laboratório por suas valiosas sugestões e por nos emprestar equipamentos de laboratório.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Anfotericina BBio TechneB23192
Filtro de células (100 μ m)ThermoFisher Scientific22363549
Tubos de Centrífuga Cônicos (15 mL)Fisher Scientific 14-959-53A
DMEM/F12ThermoFisher Scientific11320033
Feather Bisturi Descartável No. 15SocorexFB.15
Soro Fetal BovinoSigma AldrichNC1983075
Tubos de Centrífuga Cônicos de Alta Clareza (50 mL)Fisher Scientific 14-432-22
Misturador de amostras HulaMixerThermoFisher Scientific15920D
Fibronectina humana DuoSet ELISAR& D SystemsDY1918-05
Pró-Colágeno Humano I alfa 1 DuoSet ELISAR & D SystemsDY6220-05
Liberase Research GradeSigma Aldrich05 401 119 001
Penicilina/Estreptomicina (5000U/ml)15070063ThermoFisher Scientific
, poliestireno (100 mm x 20 mm)Millipore SigmaP5606
(10 mL)ThermoFischer Scientific170356N
Seringas estéreis (5 mL)Fischer Scientific14-955-458
Placas de Petri Pipetas sorológicas

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Gender disparity in the funding of diseases by the U.S. J Womens Health. 30 (7), 956-963 (2021).">Mirin, A. A. Gender disparity in the funding of diseases by the U.S. J Womens Health. 30 (7), 956-963 (2021).
  2. The prevalence of pelvic floor disorders and their relationship to gender, age, parity, and mode of delivery. BJOG. 107 (12), 1460-1470 (2000).">MacLennan, A. H., Taylor, A. W., Wilson, D. H., Wilson, D. The prevalence of pelvic floor disorders and their relationship to gender, age, parity, and mode of delivery. BJOG. 107 (12), 1460-1470 (2000).
  3. Fibroblasts from women with pelvic organ prolapse show differential mechanoresponses depending on surface substrates. Int Urogynecol J Pelvic Floor Dysfunct. 24 (9), 1567-1575 (2013).">Ruiz-Zapata, A. M., Kerkhof, M. H., Zandieh-Doulabi, B., Brölmann, H. A. M., Smit, T. H., Helder, M. N. Fibroblasts from women with pelvic organ prolapse show differential mechanoresponses depending on surface substrates. Int Urogynecol J Pelvic Floor Dysfunct. 24 (9), 1567-1575 (2013).
  4. Cell lines. Spermatogenesis. 2 (1), 1-5 (2012).">Kaur, G., Dufour, J. M. Cell lines. Spermatogenesis. 2 (1), 1-5 (2012).
  5. Maintenance of chronological aging features in culture of normal human dermal fibroblasts from old donors. Cells. 11 (5), 858(2022).">Rorteau, J., et al. Maintenance of chronological aging features in culture of normal human dermal fibroblasts from old donors. Cells. 11 (5), 858(2022).
  6. Generating primary murine vaginal fibroblast cell lines. MethodsX. 7, 101100(2020).">Blum, M., Koehler, J., Yangdon, T., Chatterjea, D. Generating primary murine vaginal fibroblast cell lines. MethodsX. 7, 101100(2020).
  7. comparative characterization of vaginal cells derived from premenopausal women with and without severe pelvic organ prolapse. Reprod Sci. 23 (7), 931-943 (2016).">Kufaishi, H., Alarab, M., Drutz, H., Lye, S., Shynlova, O. comparative characterization of vaginal cells derived from premenopausal women with and without severe pelvic organ prolapse. Reprod Sci. 23 (7), 931-943 (2016).
  8. Vaginal fibroblastic cells from women with pelvic organ prolapse produce matrices with increased stiffness and collagen content. Sci Rep. 6 (1), 22971(2016).">Ruiz-Zapata, A. M., et al. Vaginal fibroblastic cells from women with pelvic organ prolapse produce matrices with increased stiffness and collagen content. Sci Rep. 6 (1), 22971(2016).
  9. Generating primary fibroblast cultures from mouse ear and tail tissues. J Vis Exp. (107), e53565(2016).">Khan, M., Gasser, S. Generating primary fibroblast cultures from mouse ear and tail tissues. J Vis Exp. (107), e53565(2016).
  10. Static mechanical loading influences the expression of extracellular matrix and cell adhesion proteins in vaginal cells derived from premenopausal women with severe pelvic organ prolapse. Reprod Sci. 23 (8), 978-992 (2016).">Kufaishi, H., Alarab, M., Drutz, H., Lye, S., Shynlova, O. Static mechanical loading influences the expression of extracellular matrix and cell adhesion proteins in vaginal cells derived from premenopausal women with severe pelvic organ prolapse. Reprod Sci. 23 (8), 978-992 (2016).
  11. Attachment of primary vaginal fibroblasts to absorbable and nonabsorbable implant materials coated with platelet-rich plasma. Female Pelvic Med Reconstr Surg. 21 (4), 190-197 (2015).">Medel, S., Alarab, M., Kufaishi, H., Drutz, H., Shynlova, O. Attachment of primary vaginal fibroblasts to absorbable and nonabsorbable implant materials coated with platelet-rich plasma. Female Pelvic Med Reconstr Surg. 21 (4), 190-197 (2015).
  12. Prevalence, risk factors, and predictors of pelvic organ prolapse. Menopause. 19 (11), 1235-1241 (2012).">Awwad, J., Sayegh, R., Yeretzian, J., Deeb, M. E. Prevalence, risk factors, and predictors of pelvic organ prolapse. Menopause. 19 (11), 1235-1241 (2012).
  13. An optimized method to isolate human fibroblasts from tissue for ex vivo analysis. Bio Protoc. 9 (23), e3440(2019).">Waise, S., et al. An optimized method to isolate human fibroblasts from tissue for ex vivo analysis. Bio Protoc. 9 (23), e3440(2019).
  14. Using human primary foreskin fibroblasts to study cellular damage and mitochondrial dysfunction. Curr Protoc Toxicol. 86 (1), (2020).">Nadalutti, C. A., Wilson, S. H. Using human primary foreskin fibroblasts to study cellular damage and mitochondrial dysfunction. Curr Protoc Toxicol. 86 (1), (2020).
  15. Menopause Leading to Increased Vaginal Wall Thickness in Women with Genital Prolapse: Impact on Sexual Response. J Sex Med. 6 (11), 3097-3110 (2009).">Da Silva Lara, L. A., et al. Menopause Leading to Increased Vaginal Wall Thickness in Women with Genital Prolapse: Impact on Sexual Response. J Sex Med. 6 (11), 3097-3110 (2009).
  16. Measurement of oral epithelial thickness by optical coherence tomography. Diagnostics. 9 (3), 90(2019).">Stasio, D. D., Lauritano, D., Iquebal, H., Romano, A., Gentile, E., Lucchese, A. Measurement of oral epithelial thickness by optical coherence tomography. Diagnostics. 9 (3), 90(2019).
  17. Age-related changes in the fibroblastic differon of the dermis: role in skin aging. Int J Mol Sci. 23 (11), 6135(2022).">Zorina, A., Zorin, V., Kudlay, D., Kopnin, P. Age-related changes in the fibroblastic differon of the dermis: role in skin aging. Int J Mol Sci. 23 (11), 6135(2022).

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