Este protocolo demonstra uma técnica confiável e eficaz para isolar fibroblastos primários do tecido vaginal humano na pré-menopausa ou na pós-menopausa. Os protocolos existentes para isolamento de fibroblastos vaginais não consideram os desafios do isolamento celular do tecido senescente. O tecido vaginal foi obtido de mulheres após cirurgia de prolapso de órgãos pélvicos.
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Artigo de método
Processamento de tecidos e isolamento de fibroblastos primários da vagina humana
Neste artigo
Resumo
Resumo
O prolapso de órgãos pélvicos é um distúrbio que afeta seriamente a qualidade de vida das mulheres. Ocorre quando músculos e ligamentos enfraquecem e fazem com que os órgãos pélvicos caiam mais baixo na pelve, criando uma protuberância na vagina. A cirurgia para corrigir o prolapso dos órgãos pélvicos tem sido um tratamento básico. Recentemente, tem havido um interesse crescente em estudar a composição tecidual de pacientes com prolapso no nível celular.
Atualmente, há pouco consenso sobre o efeito da idade do doador ou do paciente nas terapias baseadas em células. Os protocolos atuais publicados para isolamento de fibroblastos vaginais concentram-se no tecido pré-menopausa ou negligenciam comentar sobre a idade do tecido do doador. A maioria dos protocolos existentes usa modelos animais. A consistência do tecido vaginal humano é mais densa do que os tecidos usados na maioria dos protocolos. Neste estudo, o tecido vaginal humano foi obtido principalmente de doadores mais velhos, o que provavelmente contribuiu para a falha dos protocolos existentes.
O objetivo deste estudo é descrever um protocolo padrão para a aquisição confiável de fibroblastos vaginais humanos, independentemente da idade da doadora e do status da menopausa. Os resultados foram reproduzidos usando tecido de nove doadores separados que foram submetidos à cirurgia de prolapso de órgãos pélvicos. Seis pacientes estavam na pós-menopausa, sendo que a doadora mais velha tinha 78 anos. A idade média dos doadores de tecidos foi de 59 anos.
Aqui, descrevemos um método confiável para gerar uma suspensão unicelular enriquecida com fibroblastos usando uma combinação de dissociação enzimática e mecânica e agrupamento de suspensão celular de várias biópsias vaginais de um único doador. O isolamento confiável de fibroblastos primários vaginais humanos pode ser útil no estudo do prolapso de órgãos pélvicos, bem como nas interações microbioma-hospedeiro.
Introdução
A disparidade de gênero na ciência e na pesquisa é um problema contínuo. A pesquisa sobre distúrbios que afetam principalmente pessoas do sexo feminino é subfinanciada1. O prolapso de órgãos pélvicos é um distúrbio fortemente associado ao sexo feminino. Ocorre quando músculos e ligamentos enfraquecem e fazem com que os órgãos pélvicos caiam mais baixo na pelve, criando uma protuberância na vagina2. Pouco se sabe sobre as interações celulares no contexto dessa fisiopatologia, nem como os fatores no nível do tecido afetam o sucesso das intervenções cirúrgicas3.
Células primárias, em vez de linhagens celulares, são amplamente reconhecidas como essenciais para a pesquisa clínica translacional, fornecendo mais relevância fisiológica4. As células primárias são retiradas diretamente do tecido corporal de interesse e podem imitar com mais precisão a fisiologia in vivo . O isolamento de fibroblastos primários da vagina humana pode ser útil para estudar os mecanismos biológicos do prolapso de órgãos pélvicos e modelagem de doenças, considerando as principais características do doador, como idade e estado menopausal.
O prolapso de órgãos pélvicos geralmente afeta indivíduos mais velhos ou na pós-menopausa. O isolamento e a proliferação de células primárias de fibroblastos no estudo dessa condição são desafiadores devido à redução das populações de células e à capacidade clonogênica de doadores mais velhos5. Em nossa experiência, o uso de protocolos descritos anteriormente para a dissociação do tecido vaginal não conseguiu extrair nenhum fibroblasto de uma biópsia de tecido padrão de 1 cm2 .
Por meio de uma revisão da literatura, verificamos que estudos semelhantes foram subdivididos em dois grupos: modelos animais, como osmurinos6, e modeloshumanos7,8. Ao seguir o protocolo do camundongo, o uso de tesouras para processamento de tecidos de tecido vaginal humano resultou em digestão mecânica inadequada. A extrapolação de protocolos usando tecido murino e outros locais de tecido9 não teve sucesso.
A maioria dos artigos que utilizaram amostras vaginais humanas utilizou tecido de indivíduos na pré-menopausa com prolapso de órgãos pélvicos 7,10. Embora alguns artigos relatassem o uso de amostras de indivíduos na pré-menopausa e na pós-menopausa11, eles não descreveram com detalhes suficientes o protocolo usado para isolar com sucesso fibroblastos de doadores mais velhos ou na pós-menopausa. O isolamento e a modelagem da doença com fibroblastos do tecido pós-menopausa podem ser essenciais para a compreensão da fisiopatologia celular do prolapso de órgãos pélvicos, uma vez que essa condição tem a maior prevalência em indivíduos na década seguinte àmenopausa12.
Descrevemos um método para isolamento e cultura de uma suspensão unicelular enriquecida com fibroblastos de tecido vaginal humano usando uma combinação de dissociação mecânica e enzimática. Este artigo descreve um protocolo confiável sobre como adquirir fibroblastos vaginais humanos na pós-menopausa ou envelhecidos. As células isoladas foram confirmadas como fibroblastos por meio de exame morfológico usando microscopia de contraste de fase e imunofluorescência (IF) para avaliar a expressão de vimentina, F-actina e actina de músculo liso α (α-SMA).
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Protocolo
O tecido vaginal foi obtido de mulheres submetidas à cirurgia de prolapso de órgãos pélvicos. O tecido vaginal coletado após a cirurgia foi considerado resíduo e seria descartado. O estudo foi realizado em conformidade com as diretrizes institucionais e foi aprovado pelo Conselho de Revisão Institucional do Massachusetts General Brigham.
1. Colheita de tecido vaginal do paciente
- Diagnostique o prolapso de órgãos pélvicos fazendo um histórico e usando os achados do exame pélvico: As medições de quantificação do prolapso de órgãos pélvicos (POP-Q) foram obtidas na clínica, mostrando evidências de prolapso de órgãos pélvicos.
- Utilizou-se os seguintes critérios de inclusão: maiores de 18 anos; história de prolapso sintomático de órgãos pélvicos; optando pela correção cirúrgica do prolapso de órgãos pélvicos.
- Exclua o seguinte: Mulheres grávidas e pacientes que se recusam a doar tecidos.
- Apare o excesso de tecido vaginal como uma etapa necessária da cirurgia de prolapso de órgãos pélvicos. Este epitélio vaginal é excisado em espessura total após as seguintes cirurgias: colporrafia anterior, colporrafia posterior e colpocleise.
- Transporte o tecido para o laboratório em um copo de coleta de amostras estéril com solução salina normal ou meio DMEM/F12 (Gibco) sem soro. Mantenha no gelo.
2. Processamento e digestão de tecidos
- Preparação de tecidos
- Meça e corte o tecido para abranger toda a espessura do epitélio vaginal, criando segmentos de aproximadamente 1 cm2.
- Garanta a medição precisa do tamanho da biópsia1 cm 2.
NOTA: Superestimar o tamanho da biópsia tecidual pode prejudicar a digestão tecidual. - Prepare 2-3 biópsias vaginais adicionais medindo 1 cm2 cada de um único doador e deixe as biópsias de lado.
- Digestão mecânica
- Coloque a biópsia vaginal em uma placa de Petri de cultura de células de 10 cm. Pipete 500-1.000 μL de meio sem soro suplementado com 100 U / mL de penicilina / estreptomicina, 2,5 μg / mL de anfotericina Bonto no tecido vaginal para evitar que o tecido seque.
- Pique o tecido vaginal em pequenos fragmentos usando dois bisturis estéreis (nº 11 ou nº 15) em ambas as mãos.
- Certifique-se de que as pontas das lâminas estejam perpendiculares à superfície do tecido. Aplique pressão igual e constante na superfície do tecido, usando dois bisturis. Execute uma ação de puxar alternadamente para cortar o tecido em pedaços muito pequenos.
- Repita esta técnica de picagem usando a técnica de dois bisturis até que a amostra tenha uma consistência uniforme com pedaços de 1-2 mm.
NOTA: A digestão mecânica usando esta técnica de dois bisturis de uma biópsia de 1 cm2 deve levar aproximadamente 15-20 minutos para ser concluída. - Adicione 2-3 mL de meio DMEM/F12 sem soro suplementado com 100 U/mL de penicilina/estreptomicina, 2,5 μg/mL de anfotericina B à placa, suspendendo o tecido picado. Pipete a solução contendo fragmentos de tecido para cima e para baixo para quebrar quaisquer aglomerados.
- Digestão enzimática
- Transfira a solução contendo fragmentos de tecido para um tubo cônico de 15 mL. Adicione meio DMEM/F12 sem soro à placa de cultura de tecidos onde o tecido vaginal foi picado para coletar quaisquer fragmentos de tecido restantes. Transfira a solução contendo fragmentos de tecido para o tubo cônico. Adicione mais mídia DMEM/F12 sem soro até que o volume total seja de 10 mL.
- Dissolva 5 mg de Liberase em 1 mL de água estéril (5 mg / mL). Armazenar em alíquotas de 230 μL a -20 °C por até um mês ou -80 °C por 6 meses.
- Adicione 230 μL de Liberase (estoque de 13 U / mL) ao tubo, com concentração final de 0,3 U / mL.
NOTA: A atividade da liberase pode variar entre os lotes. Descongele cada alíquota imediatamente antes de usar em banho-maria. Evite congelamento e descongelamento repetidos. - Repita as etapas 2.1-2.3 para 2-3 biópsias vaginais adicionais do mesmo doador.
NOTA: Mantenha cada solução contendo fragmentos de tecido de uma única biópsia em tubos cônicos separados. Por exemplo, 4 biópsias vaginais em 4 tubos. Isso é importante para a peletização ideal das células após a centrifugação. - Incubar os tubos durante 3 h a 37 °C com agitação constante e vigorosa utilizando um misturador de amostras.
- Coloque um misturador de amostras em uma incubadora de CO2 . Mantenha agitação constante. (Configurações do misturador de amostra: 25 rpm de movimento rotacional por 5 s, 30° de recíproco (rotação de inclinação) por 5 s e 2° de movimento de vibração (vórtice) por 3 s).
- Durante a incubação, vórtice os tubos em intervalos de 30 minutos.
- Centrifugue as amostras a 3.000 x g por 5 min. Remova e descarte o sobrenadante.
- Ressuspenda o pellet em 1-2 mL de meio DMEM/F12 com 10% de soro fetal bovino (FBS) e 100 U/mL de penicilina/estreptomicina, 2,5 μg/mL de anfotericina B para diluir a enzima Liberase. Pipetar vigorosamente até que o pellet esteja totalmente ressuspenso.
3. Cultura celular
- Remoção de fragmentos de tecido não digeridos
- Coloque um filtro de células de 100 μm sobre um recipiente cônico estéril de 50 mL.
- Agrupe a suspensão celular das múltiplas biópsias de tecido do mesmo doador.
- Coe a suspensão de tecido/enzima, pressionando com um êmbolo de seringa de 5 mL. Repita esta etapa até que os fragmentos de tecido restantes pareçam estar totalmente pressionados.
NOTA: Pode haver algum muco dos fragmentos de tecido da vagina que não é totalmente trabalhado através do filtro. Descarte o muco com o filtro de células.
- Pool de cultura celular
- Suspensão de células agrupadas em placa de múltiplas biópsias vaginais (do mesmo doador) em placa de Petri (60 mm x 15 mm).
- Incubar a placa de Petri numa incubadora de CO2 a 37 °C durante a noite.
- Observe e confirme a presença de células não aderentes com um microscópio de contraste de fase.
- Certifique-se de que o foco do microscópio esteja na parte inferior da placa.
NOTA: Pode haver muitas células imunológicas em primeiro plano. Um número menor de fibroblastos será fixado no fundo da placa. - Aguarde 18-24 h antes de trocar o meio de cultura celular para garantir a adesão celular adequada.
- Troque o meio de cultura a cada três dias até que ocorra 80% de confluência. Quando as células atingirem 80-90% de confluência, expanda para um frasco maior ou congele alíquotas de células para uso futuro.
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Resultados
O tecido vaginal foi coletado de 10 doadores independentes submetidos à cirurgia de prolapso de órgãos pélvicos. Usando o protocolo descrito, as células foram isoladas do tecido vaginal humano. As populações de células tinham uma aparência alongada, plana e fusiforme característica. Como outros estudos, observamos capacidades de duplicação celular significativamente mais lentas e capacidade clonogênica reduzida dos fibroblastos com o aumento da idade do doador. Essas diferenças foram marcantes quando comparados fibroblas...
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Discussão
Muitos estudos anteriores relataram como isolar fibroblastos primários da vagina humana 3,7. Vários estudos usaram tecido vaginal humano de indivíduos na pré-menopausa com prolapso de órgãos pélvicos. Embora alguns trabalhos relatem o uso de tecido de indivíduos na pré-menopausa e na pós-menopausa 7,11, eles não descrevem com detalhes suficientes o protocolo usado para is...
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Divulgações
Não temos conflitos de interesse a divulgar.
Agradecimentos
Gostaríamos de expressar nossa gratidão a todos os membros do Centro Vincent de Biologia Reprodutiva do Hospital Geral de Massachusetts, bem como à VIncent Memorial Hospital Foundation, por seu generoso apoio. Agradecimentos especiais ao Dr. Bo Rueda e seu laboratório por suas valiosas sugestões e por nos emprestar equipamentos de laboratório.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Anfotericina B | Bio Techne | B23192 | |
| Filtro de células (100 μ m) | ThermoFisher Scientific | 22363549 | |
| Tubos de Centrífuga Cônicos (15 mL) | Fisher Scientific | 14-959-53A | |
| DMEM/F12 | ThermoFisher Scientific | 11320033 | |
| Feather Bisturi Descartável No. 15 | Socorex | FB.15 | |
| Soro Fetal Bovino | Sigma Aldrich | NC1983075 | |
| Tubos de Centrífuga Cônicos de Alta Clareza (50 mL) | Fisher Scientific | 14-432-22 | |
| Misturador de amostras HulaMixer | ThermoFisher Scientific | 15920D | |
| Fibronectina humana DuoSet ELISA | R& D Systems | DY1918-05 | |
| Pró-Colágeno Humano I alfa 1 DuoSet ELISA | R & D Systems | DY6220-05 | |
| Liberase Research Grade | Sigma Aldrich | 05 401 119 001 | |
| Penicilina/Estreptomicina (5000U/ml) | 15070063 | ThermoFisher Scientific | |
| , poliestireno (100 mm x 20 mm) | Millipore Sigma | P5606 | |
| (10 mL) | ThermoFischer Scientific | 170356N | |
| Seringas estéreis (5 mL) | Fischer Scientific | 14-955-458 |
Referências
- Mirin, A. A. Gender disparity in the funding of diseases by the U.S. J Womens Health. 30 (7), 956-963 (2021).
- MacLennan, A. H., Taylor, A. W., Wilson, D. H., Wilson, D. The prevalence of pelvic floor disorders and their relationship to gender, age, parity, and mode of delivery. BJOG. 107 (12), 1460-1470 (2000).
- Ruiz-Zapata, A. M., Kerkhof, M. H., Zandieh-Doulabi, B., Brölmann, H. A. M., Smit, T. H., Helder, M. N. Fibroblasts from women with pelvic organ prolapse show differential mechanoresponses depending on surface substrates. Int Urogynecol J Pelvic Floor Dysfunct. 24 (9), 1567-1575 (2013).
- Kaur, G., Dufour, J. M. Cell lines. Spermatogenesis. 2 (1), 1-5 (2012).
- Rorteau, J., et al. Maintenance of chronological aging features in culture of normal human dermal fibroblasts from old donors. Cells. 11 (5), 858(2022).
- Blum, M., Koehler, J., Yangdon, T., Chatterjea, D. Generating primary murine vaginal fibroblast cell lines. MethodsX. 7, 101100(2020).
- Kufaishi, H., Alarab, M., Drutz, H., Lye, S., Shynlova, O. comparative characterization of vaginal cells derived from premenopausal women with and without severe pelvic organ prolapse. Reprod Sci. 23 (7), 931-943 (2016).
- Ruiz-Zapata, A. M., et al. Vaginal fibroblastic cells from women with pelvic organ prolapse produce matrices with increased stiffness and collagen content. Sci Rep. 6 (1), 22971(2016).
- Khan, M., Gasser, S. Generating primary fibroblast cultures from mouse ear and tail tissues. J Vis Exp. (107), e53565(2016).
- Kufaishi, H., Alarab, M., Drutz, H., Lye, S., Shynlova, O. Static mechanical loading influences the expression of extracellular matrix and cell adhesion proteins in vaginal cells derived from premenopausal women with severe pelvic organ prolapse. Reprod Sci. 23 (8), 978-992 (2016).
- Medel, S., Alarab, M., Kufaishi, H., Drutz, H., Shynlova, O. Attachment of primary vaginal fibroblasts to absorbable and nonabsorbable implant materials coated with platelet-rich plasma. Female Pelvic Med Reconstr Surg. 21 (4), 190-197 (2015).
- Awwad, J., Sayegh, R., Yeretzian, J., Deeb, M. E. Prevalence, risk factors, and predictors of pelvic organ prolapse. Menopause. 19 (11), 1235-1241 (2012).
- Waise, S., et al. An optimized method to isolate human fibroblasts from tissue for ex vivo analysis. Bio Protoc. 9 (23), e3440(2019).
- Nadalutti, C. A., Wilson, S. H. Using human primary foreskin fibroblasts to study cellular damage and mitochondrial dysfunction. Curr Protoc Toxicol. 86 (1), (2020).
- Da Silva Lara, L. A., et al. Menopause Leading to Increased Vaginal Wall Thickness in Women with Genital Prolapse: Impact on Sexual Response. J Sex Med. 6 (11), 3097-3110 (2009).
- Stasio, D. D., Lauritano, D., Iquebal, H., Romano, A., Gentile, E., Lucchese, A. Measurement of oral epithelial thickness by optical coherence tomography. Diagnostics. 9 (3), 90(2019).
- Zorina, A., Zorin, V., Kudlay, D., Kopnin, P. Age-related changes in the fibroblastic differon of the dermis: role in skin aging. Int J Mol Sci. 23 (11), 6135(2022).
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Reimpressões e permissões
