É necessária uma assinatura do JoVE para visualizar este conteúdo. Faça login ou inicie seu teste gratuito.

Artigo de método

Ruptura da Barreira Hematoencefálica de Camundongos por Pequenas Vesículas Extracelulares de Placentas Humanas Hipóxicas

1.8K visualizações

⸱

DOI:

10.3791/65867

⸱

26 de janeiro de 2024

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Vascular Physiology Laboratory, Department of Basic Sciences, Universidad del Bío-Bío, Chillan, 2Nursery School, Health Faculty, Universidad Santo Tomás, Los Angeles, 3Obstetrics and Gynecology Department, Herminda Martin Clinical Hospital, Chillan, 4Faculty of Medicine, Universidad Católica de la Santísima Concepción, Concepcion, 5Laboratory of Animal Biotechnology, Department of Animal Science, Faculty of Veterinary Sciences, Universidad de Concepción, Chillan, 6Group of Research and Innovation in Vascular Health (GRIVAS Health), Chillan

* These authors contributed equally

Neste artigo

Resumo

Um protocolo é apresentado para avaliar se pequenos EVs (sEVs) isolados de explantes placentários cultivados sob condições hipóxicas (modelando um aspecto da pré-eclâmpsia) rompem a barreira hematoencefálica em camundongos fêmeas adultas não grávidas.

Resumo

As complicações cerebrovasculares, incluindo edema cerebral e acidente vascular cerebral isquêmico e hemorrágico, constituem a principal causa de mortalidade materna associada à pré-eclâmpsia. Os mecanismos subjacentes dessas complicações cerebrovasculares permanecem obscuros. No entanto, eles estão ligados à disfunção placentária e à interrupção da barreira hematoencefálica (BHE). No entanto, a conexão entre esses dois órgãos distantes ainda está sendo determinada. Evidências crescentes sugerem que a placenta libera moléculas sinalizadoras, incluindo vesículas extracelulares, na circulação materna. As vesículas extracelulares são categorizadas de acordo com seu tamanho, sendo que pequenas vesículas extracelulares (sEVs menores que 200 nm de diâmetro) são consideradas partículas sinalizadoras críticas em condições fisiológicas e patológicas. Na pré-eclâmpsia, há um aumento do número de EVs circulantes na circulação materna, cuja função de sinalização não é bem compreendida. Os EVs placentários liberados na pré-eclâmpsia ou em placentas gestacionais normais expostas à hipóxia induzem disfunção endotelial cerebral e interrupção da BHE. Neste protocolo, avaliamos se sEVs isolados de explantes placentários cultivados sob condições hipóxicas (modelando um aspecto da pré-eclâmpsia) interrompem a BHE in vivo.

Introdução

Aproximadamente 70% das mortes maternas por pré-eclâmpsia, síndrome hipertensiva da gravidez caracterizada por processos de placentação prejudicados, disfunção endotelial sistêmica materna e, em casos graves, falência de múltiplos órgãos 1,2, estão associadas a complicações cerebrovasculares agudas 3,4. A maioria das mortes maternas ocorre em países de baixa e médiarenda5. No entanto, os mecanismos subjacentes ainda não estão claros, apesar da relevância clínica e epidemiológica das complicações cerebrovasculares associadas à pré-eclâmpsia.

Por outro lado, as vesículas extracelulares (EVs) (diâmetro ~30-400 nm) são mediadores essenciais da comunicação intercelular entre tecidos e órgãos, incluindo a interação materno-placentária6. Além de proteínas e lipídios na superfície externa, os EVs carregam carga dentro (proteínas, RNA e lipídios). Os EVs podem ser categorizados em (1) exossomos (diâmetro ~50-150 nm, também chamados de EVs pequenos (sEVs)), (2) EVs médios/grandes e (3) corpos apoptóticos, que diferem pelo tamanho, biogênese, conteúdo e função de sinalização potencial. A composição dos EVs é determinada pelas células de onde se originam e pelo tipo de doença7. Os EVs derivados de sinciciotrofoblastos expressam fosfatase alcalina placentária (PLAP)8,9, que detecta pequenas EVs circulantes derivadas da placenta (PDsEVs) na gravidez. Além disso, o PLAP ajuda a discernir mudanças na carga de PDsEVs e seus efeitos na pré-eclâmpsia versus gestações normotensas 10,11,12,13,14,15.

A placenta tem sido reconhecida como o componente necessário na fisiopatologia da pré-eclâmpsia16 ou complicações cerebrais associadas a esta doença 17,18,19. No entanto, não se sabe como esse órgão distante pode induzir alterações na circulação cerebral. Uma vez que as EVs desempenham papéis fundamentais na comunicação célula-célula devido à sua capacidade de transferir componentes bioativos das células doadoras para as receptoras 6,20,21, um número crescente de estudos tem associado as EVs placentárias à geração de disfunção endotelial materna 21,22,23,24, incluindo células endoteliais cerebrais 25,26em mulheres com pré-eclâmpsia. Assim, o comprometimento da função endotelial cerebral pode levar à ruptura da barreira hematoencefálica (BHE), componente crítico nas complicações cerebrovasculares associadas à pré-eclâmpsia 3,27.

No entanto, achados pré-clínicos utilizando vasos cerebrais de ratas expostos ao soro de mulheres com pré-eclâmpsia28 ou células endoteliais cerebrais humanas expostas ao plasma de mulheres com pré-eclâmpsia29 relataram que o(s) fator(es) circulante(s) induz(em) a interrupção da BHE. Apesar de vários candidatos com potencial para prejudicar a BHE presente na circulação materna durante a pré-eclâmpsia, como níveis elevados de citocinas pró-inflamatórias (i.e., fator de necrose tumoral)18,28 ou reguladores vasculares (i.e., fator de crescimento endotelial vascular (VEGF))29,30,31, ou moléculas oxidativas como lipoproteínas oxidadas (oxo-LDL)32,33, entre outras34, nenhum deles estabelece uma conexão direta entre a placenta e o BBB. Recentemente, sEVs isolados de placentas hipóxicas mostraram a capacidade de interromper a BBB em camundongos fêmeas não gestantes25. Uma vez que os sEVs placentários podem carregar a maioria dos fatores circulantes listados com a capacidade de interromper o BBB, os sEVs são considerados candidatos adequados para conectar a placenta lesionada, ser o portador de fatores circulantes prejudiciais e interromper o BBB na pré-eclâmpsia.

Este protocolo permite investigar se sEVs isolados de explantes placentários cultivados sob condições hipóxicas podem interromper a BHE em camundongos fêmeas não gestantes como proxy para a compreensão da fisiopatologia das complicações cerebrais durante a pré-eclâmpsia.

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Protocolo

A pesquisa foi realizada seguindo os princípios expressos na Declaração de Helsinque e sob autorização dos respectivos Comitês de Ética em Pesquisa. Todos os participantes humanos deram seu consentimento informado antes da coleta da amostra, conforme relatado anteriormente25. Adicionalmente, o Comitê de Bioética e Biossegurança da Universidade Bío-Bío aprovou este projeto (bolsa Fondecyt 1200250). O trabalho com animais foi conduzido de acordo com os princípios cardeais dos três R's no uso de animais em experimentação35, e de acordo com as recomendações das diretrizes para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório publicadas pelo Instituto Nacional de Saúde dos EUA. Os animais foram mantidos em ambientes apropriados no Biotério da Universidade de Bío-Bío. Placentas frescas (n = 4) foram obtidas dentro de 1 h após cesariana eletiva de mães (28-31 anos) com gestações normais a termo (38 a 41 semanas de gestação). As cesarianas foram realizadas no Hospital Clínico Herminda Martin, Chillán, Chile, conforme relatado anteriormente25. Para aplicação do modelo in vivo , foram utilizadas fêmeas de camundongos não gestantes (linhagem C57BLACK/6) com 4-6 meses de idade. Eles foram divididos em três grupos experimentais: (1) controle (sem tratamento), (2) tratados com sEVs de normóxia (sEVs-Nor) e (3) tratados com sEVs de placentas hipóxicas cultivadas (sEVs-Hyp), que foram usados para avaliar a interrupção da BBB in vivo25. Todas as soluções injetadas eram estéreis. Além disso, o preparo dos sEVs foi realizado em condições assépticas e sob capuz de biossegurança classe II para evitar contaminação.

1. Explantes da cultura placentária

  1. Para extrair explantes de placentas gestacionais normais, verificar o método publicado por Miller et al., 200536.
  2. Remova cuidadosamente os coágulos da placa basal da placenta humana usando pinças esterilizadas. Extrair pequenos explantes para obter uma extração final de tecido de 10 g.
  3. Certifique-se de que os explantes placentários sejam removidos dos quatro quadrantes da porção materna da placenta. Certifique-se de que o tecido desvitalizado e as áreas calcificadas sejam excluídos.
  4. Para manipular o tecido placentário, faça-o no gelo, em condições estéreis e dentro de um gabinete de biossegurança.
  5. Lavar os explantes (pelo menos três vezes) com quantidades abundantes (cinco volumes dos explantes) de solução tampão fosfato fria (4 °C) (PBS 1x, pH 7,4) para remover o máximo de sangue possível. Centrifugar (252 x g por 10 min) à temperatura ambiente entre as lavagens.
  6. Ressuspender 10 g de explantes lavados em 20 mL de meio de cultura suplementado com 2% de soro fetal bovino, 100 UI/mL de penicilina e 100 μg/mL de estreptomicina (ver Tabela de Materiais).
  7. Coloque a suspensão em uma placa de cultura de 100 mm. Deixar os explantes durante 2 h numa estufa a 37 °C com 21% de oxigénio e 5% de CO2.
  8. Em seguida, lavar novamente os explantes com 1x PBS a 37 °C (três vezes). Centrifugar (252 x g por 10 min) à temperatura ambiente entre as lavagens.
  9. Em seguida, ressuspender o tecido em 20 mL de meio de cultura previamente esgotado de nanopartículas.
    OBS: Para depleção de nanopartículas, realizar ultracentrifugação (120.000 x g por 18 h à temperatura ambiente) e microfiltração (filtro de 0,22 μm).
  10. Divida os explantes ressuspensos em duas placas de culturas (100 mm). Cada placa de cultura deve incluir 10 mL de explantes ressuspensos.
  11. Em seguida, colocar uma das placas contendo explantes placentários em condições padrão de cultura (37 °C com 8% de oxigênio e 5% de CO2), enquanto a outra em uma câmara hipóxica com 1% de O2.
    NOTA: (OPCIONAL) A análise da viabilidade tecidual pode ser realizada utilizando as mesmas extrações teciduais e o ensaio com brometo de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazólio (MTT assay), conforme descrito anteriormente37,38. Use a concentração de proteína total medida nos homogeneizados dos explantes para normalizar os valores de MTT.
  12. Após 18 h de cultivo, colher o meio condicionado dos explantes em novo tubo de 15 mL.
    NOTA: Nesta etapa, o meio condicionado pode ser congelado (-80 °C) por um período prolongado (semanas).

2. Isolamento de SVs derivados da placenta

  1. Isolar sEVs do meio condicionado usando o protocolo de centrifugação diferencial e microfiltração seguindo relatos publicados anteriormente25,39.
  2. Realizar centrifugação sequencial para o meio condicionado colhido. As etapas sequenciais das centrifugações são (1) 300 x g por 10 min, (2) 2000 x g por 10 min, (3) 10.000 x g por 30 min e (4) 120.000 x g por 2 h. Realizar as centrifugações à temperatura ambiente.
  3. Em todas essas centrifugações, usando uma pipeta de 20-100 μL, colete cuidadosamente o sobrenadante e descarte o pellet.
  4. Uma vez feito, passe o último sobrenadante coletado através de um filtro de 0,22 μm (ver Tabela de Materiais). Em seguida, realizar uma centrifugação adicional a 120.000 x g por 18 h à temperatura ambiente.
  5. Depois disso, descarte o sobrenadante enquanto ressuspende o pellet (que contém sEVs placentários) em 500 μL de PBS (pH 7,4) e passe novamente por um filtro de 0,22 μm. Finalmente, realizar uma última centrifugação a 120.000 x g por 3 h à temperatura ambiente.
  6. Em seguida, ressuspenda o pellet (que contém sEVs placentários) em 500 μL de PBS (pH 7,4, previamente esgotado de sEVs) e passe por um filtro de 0,22 μm.
  7. Rotular as amostras como estoque de sEVs-Normoxia (sEVs-Nor) ou sEVs-Hypoxia (sEVs-Hyp).
    NOTA: Preparar alíquotas de 50-100 μL dos sEVs isolados para experimentação posterior. Os pequenos veículos elétricos podem ser armazenados a -80 °C por um período prolongado (meses).
  8. Caracterizar os sEVs placentários por tamanho, contagem e marcador proteico de sEVs, conforme relatado anteriormente25. O diâmetro médio ideal das partículas de sEVs é de 50-150 nm.
    NOTA: A caracterização de sEVs inclui detecção positiva de CD63, Tsg101, Alix e HSP70 (ou seja, para caracterizar a população de sEVs enriquecida em exossomos). Utilizar também a PAPL como marcador de origem placentária25.
  9. Meça a quantidade total de proteína na solução de sEVs usando o kit de ensaio de proteína BCA seguindo as instruções do fabricante (consulte a Tabela de Materiais).
    NOTA: A Figura 1 mostra uma visão geral da cultura do explante placentário e do isolamento da vesícula extracelular.

3. Injeção em ratos

  1. Anestesiar o animal em câmara de indução anestésica com distribuição de isoflurano a 5% (ver Tabela de Materiais). Verifique o nível de anestesia através de uma pinça do dedo do pé.
  2. Após ~40 s, coloque o mouse no sistema de anestesia usando uma máscara facial e mantenha um nível de anestesia de isoflurano a 2%.
  3. Em seguida, posicione o animal numa plataforma de aquecimento (ver Tabela de Materiais) a uma temperatura ambiente de 28 °C. Mantenha os olhos lubrificados com lágrimas artificiais.
  4. Antes da injeção, diluir os sEVs placentários (200 μg de proteína total) com tampão fosfato (pH, 7,4) até atingir um volume final de 70 μL.
  5. Desinfetar a área de injeção com etanol 70% e cotonetes. Certifique-se de usar uma seringa de insulina com uma agulha de 30 G para injetar a solução de sEVs.
    NOTA: A seringa pode ser posicionada na plataforma de aquecimento por 5 min para adquirir uma temperatura fisiológica.
  6. Em seguida, injete a solução na veia jugular externa. Esta etapa precisa de treinamento especial.
    NOTA: O procedimento deve ser realizado com cautela, retraindo lentamente a agulha e aspirando suavemente até a evidência de refluxo sanguíneo.
  7. Após a injeção, aplique uma leve pressão na área injetada por ~15 s com um cotonete seco. Depois disso, devolva os animais para suas respectivas gaiolas.
  8. Certifique-se de avaliar a consciência e o comportamento por 15 min. Um indicador da realização da consciência é a recuperação animal da atividade motora total.
    NOTA: Certifique-se de manter uma temperatura quente nas gaiolas dos animais.

4. Escala de comportamento e coma murino rápido (RMCBS)

  1. Utilizar o RMCBS para avaliar os parâmetros neurológicos e de bem-estar dos animais40.
    NOTA: O RMCBS permite uma avaliação rápida (~ 3 min) com o mínimo de estresse do animal devido à intervenção do operador. RMCBS tem dez parâmetros (cada escore é 0-2).
  2. Avalie o bem-estar de camundongos com a escala RMCBS em 0 h (antes de injetar sEVs) e 3 h, 6 h, 12 h e 24 h após a injeção.
    OBS: Realizar análise de claudina-5 (6 h após a injeção de sEVs) e extravasamento de azul de Evan (24 h após a injeção de sEVs) para avaliar a ruptura da BBB (Figura 2).

5. Análise do extravasamento azul de Evan

  1. Após a injeção de sEVs placentários (24 h), anestesiar os camundongos conforme descrito no passo 3.1.
  2. Preparar a solução azul de Evan (2%, diluída em solução tampão fosfato, 1x) (ver Tabela de Materiais).
  3. Com acesso retro-orbital25, injetar solução de Evan Blue a 2 mL/kg.
  4. Permitir que a solução azul de Evan circule por 20 minutos sob manutenção da anestesia.
  5. Em seguida, realizar perfusão intracardíaca seguindo o protocolo41 previamente descrito com solução salina (~3 mL, 0,9%, p/v) para remover o corante azul de Evan da circulação. Esta etapa é obrigatória.
    NOTA: Para este procedimento, aumente a anestesia para 5% e verifique um plano profundo de anestesia (ou seja, redução drástica da frequência respiratória).
  6. Expor o coração por toracotomia medial41 (Figura 3).
  7. Em seguida, fixar todo o animal com uma infusão intracárdica de solução de paraformaldeído (4% em PBS, v/v).
    OBS: Verificar a rigidez da cauda para monitorar a fixação adequada.
  8. Além disso, uma vez que a fixação esteja completa, extraia cuidadosamente o cérebro, pese-o e fotografe-o41. Tire fotos com todo o cérebro perto de uma régua42.
  9. Em seguida, coloque o cérebro em uma fatiadora de camundongos cerebrais (veja Tabela de Materiais).
  10. Dissecar o cérebro em nove seções, crane-caudal, incluindo o cerebelo (100 μm cada seção).
  11. Após a dissecção, visualize e capture imagens das fatias cerebrais em um microscópio de zoom estéreo (veja Tabela de Materiais).
  12. Use as imagens capturadas para quantificar o extravasamento azul de Evan usando o software ImageJ (consulte Tabela de Materiais).
    NOTA: Para analisar a presença do corante azul de Evan, defina os valores de azul de Evan usando um controle positivo da seção cerebral (de um animal controle animal injetado com corante, mas sem perfusão intracárdica). Os valores do azul de Evan obtidos a partir do controle positivo estão geralmente entre 75 e 110 no histograma de intensidade do canal azul (Figura 4).
  13. Certifique-se de que as imagens cerebrais sejam analisadas às cegas pelo respectivo grupo experimental para evitar viés de observador. Alternativamente, quantificar o extravasamento do azul de Evan por homogeneização cerebral seguida de espectroscopia43.
    NOTA: Em experimentos separados, usando cérebros recém-isolados de camundongos injetados com sEVs (6 h), analise os níveis de proteína de claudina 5 (CLND-5) (ver Tabela de Materiais), uma junção apertada crítica envolvida na estanqueidade do BBB44 (Figura 5).

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Resultados

Este protocolo avalia a capacidade de sEVs derivados de placentas cultivadas em hipóxia para interromper a BBB em camundongos não gestantes. Este método permite compreender melhor a conexão potencial entre a placenta e o cérebro em condições normais e patológicas. Em particular, este método pode constituir um proxy para analisar a participação de EVs placentárias no aparecimento de complicações cerebrais na pré-eclâmpsia.

Ao contrário dos camundongos injetados com sEVs-Nor, os camundongos inje...

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Discussão

Este estudo revela novos insights sobre danos potenciais resultantes de sEVs isolados de explantes placentários cultivados em condições hipóxicas sobre o rompimento da barreira hematoencefálica de roedores. O mecanismo patológico envolve a redução do CLND-5 na região posterior do cérebro25.

Investigações prévias revelaram que os sEVs plasmáticos de indivíduos com pré-eclâmpsia induzem disfunção endotelial em vários órgãos usando modelos in vitro

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Divulgações

Os autores declaram não haver qualquer conflito de interesses.

Agradecimentos

Os autores agradecem aos pesquisadores da GRIVAS Health pela valiosa contribuição. Além disso, as parteiras e o corpo clínico do Serviço de Obstetrícia e Ginecologia pertencem ao Hospital de Chillán, Chile. Fundada por Fondecyt Regular 1200250.

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Matriz de cérebro de camundongos adultos impressa em 3DArquivo de acesso abertoCamundongos adultosFatiador de cérebro de camundongos adultos. Impresso em filamento PLA.
Anticorpo primário anti-β-actinaSigma-AldrichClon AC-74Anticorpo para controle de carga (Western blot)
Anticorpo primário anti-Claudin5Santa cruz Biotecnologiasc-374221Anticorpo primário para proteína de junção apertada CLDN5 de camundongos BBB (Western blot)
Kit de proteína BCAThermo Scientific23225Kit para medir a concentração de proteínas
Meios de cultura #200 500 mLThermo Fisher Scientificm200500Meio de cultura para explantes placentários
D180 CO2 incubadoraRWD Ciências da vidaD180Incubadora padrão para estabilizar explantes e cultura sEVs-Nor
Evans corante azul > 75% 10 gSigma-AldrichE2129.10GCorante para analisar a ruptura da barreira hematoencefálica IN VIVO
Soro fetal bovino 500 mLThermo Fisher Scientific16000044Fator de crescimento aditivo para meios de cultura 200
Himac Ultracentrifuge CP100NXHimac eppendorf group5720410101Ultracentrifuge para meios condicionados > 1,20,000 x g
Software ImageJNIHhttps://imagej.nih.gov/ij/download.html
Isoflurano x 100 mLUSP Baxter212-094Agente de anestesia inalada volátil para camundongos
Kit CellTiter 96 Não radioativo Promega0000105232In vitro ensaio para viabilidade de explantes placentários
Camundongo IgG Anticorpo secundárioThermo Fisher ScientificMO 63103Anticorpo secundário para CLDN5 (western blot)
NanoSight NS300Malvern Panalytical90278090Análise de nanorastreamento de partículas de explantes placentários meios condicionados
Paraformaldehide E solução a 97% 500 mLThermo Fisher ScientificA11313.22Solução fixadora para fatias de tecido cerebral e perfusão intracárdica (uma vez diluída)
PBS 1 X pH 7.4 500 mLThermo Fisher ScientificSolução delavagem 10010023 para explantes de placenta
Penicilina-estreptomicina 100x 20 mLThermo Fisher Scientific10378016Antiobióticos para explantes placentários meios
de culturaProOX C21 Citocêntrico O2 e CO2 Controlador de subcâmaraBioSpherixSCR_021131regulador de CO2 para induzir hipóxia em câmara selada para sEVs-Hyp
Tiopental sódico 1 gChemie7061agente humanitário de eutanásia
Sistema de anestesia de baixo fluxo SomnosuiteKent ScientificsSS-01Vaporizador de isoflurano para pequenos roedores
Plataforma de aquecimento cirúrgicoKent ScientificsA41166Plataforma de aquecimento para manutenção de anestesia em camundongos
Filtros de seringa, Politetrafluoretileno (PTFE), Hidrofóbico, 0,22 µ m, Estéril, 25 mmMaterial de laboratório do sul10026Filtração de meios condicionados colhidos de explantes placentários 
Micro Centrífugas de Alta Velocidade de Mesa  HITACHI himac CT15E/CT15REHitachi medical systems6020Centrifugações seriais de meios condicionados < 1,20, 000 x g
Estereomicroscópio trinocular transmitido e luz reflexiva 10x-160x Centro Médico2597Estereomicroscópio para registrar fatias de cérebro

Referências

  1. Lisonkova, S., Joseph, K. S. Incidence of preeclampsia: risk factors and outcomes associated with early- versus late-onset disease. Am J Obstet Gynecol. 209 (544), 544.e1-544.e12 (2013).
  2. Sibai, B., Dekker, G., Kupferminc, M. Preeclampsia. Lancet. 365 (9461), 785-799 (2005).
  3. Hammer, E. S., Cipolla, M. J. Cerebrovascular dysfunction in preeclamptic pregnancies. Curr Hypertens Rep. 17 (8), 64(2015).
  4. Okanloma, K. A., Moodley, J. Neurological complications associated with the preeclampsia/eclampsia syndrome. Int J Gynaecol Obstet. 71, 223-225 (2000).
  5. Frias, A. E., Belfort, M. A. Post magpie: how should we be managing severe preeclampsia. Curr Opin Gynecol Obstet. 15 (6), 489-495 (2003).
  6. Familari, M., Cronqvist, T., Masoumi, Z., Hansson, S. R. Placenta-derived extracellular vesicles: Their cargo and possible functions. Reprod Fertil Dev. 29 (3), 433-447 (2017).
  7. Montoro-Garcia, S., Shantsila, E., Marin, F., Blann, A., Lip, G. Y. Circulating microparticles: new insights into the biochemical basis of microparticle release and activity. Basic Res Cardiol. 106, 911-923 (2011).
  8. Germain, S. J., Sacks, G. P., Sooranna, S. R., Sargent, I. L., Redman, C. W. Systemic inflammatory priming in normal pregnancy and preeclampsia: the role of circulating syncytiotrophoblast microparticles. J Immunol. 178 (9), 5949-5956 (2007).
  9. Tannetta, D., Masliukaite, I., Vatish, M., Redman, C., Sargent, I. Update of syncytiotrophoblast derived extracellular vesicles in normal pregnancy and preeclampsia. J Reprod Immunol. 119, 98-106 (2017).
  10. Collett, G. P., Redman, C. W., Sargent, I. L., Vatish, M. Endoplasmic reticulum stress stimulates the release of extracellular vesicles carrying danger-associated molecular pattern (DAMP) molecules. Oncotarget. 9 (6), 6707-6717 (2018).
  11. Cooke, W. R., et al. Maternal circulating syncytiotrophoblast-derived extracellular vesicles contain biologically active 5'-tRNA halves. Biochem Biophys Res Commun. 518 (1), 107-113 (2019).
  12. Gill, M., et al. Placental syncytiotrophoblast-derived extracellular vesicles carry active nep (neprilysin) and are increased in preeclampsia. Hypertension. 73 (5), 1112-1119 (2019).
  13. Kandzija, N., et al. Placental extracellular vesicles express active dipeptidyl peptidase IV; levels are increased in gestational diabetes mellitus. J Extracell Vesicles. 8 (1), 1617000(2019).
  14. Motta-Mejia, C., et al. Placental vesicles carry active endothelial nitric oxide synthase and their activity is reduced in preeclampsia. Hypertension. 70 (2), 372-381 (2017).
  15. Sammar, M., et al. Reduced placental protein 13 (PP13) in placental derived syncytiotrophoblast extracellular vesicles in preeclampsia - A novel tool to study the impaired cargo transmission of the placenta to the maternal organs. Placenta. 66, 17-25 (2018).
  16. Burton, G. J., Woods, A. W., Jauniaux, E., Kingdom, J. C. Rheological and physiological consequences of conversion of the maternal spiral arteries for uteroplacental blood flow during human pregnancy. Placenta. 30 (6), 473-482 (2009).
  17. Warrington, J. P., et al. Placental ischemia in pregnant rats impairs cerebral blood flow autoregulation and increases blood-brain barrier permeability. Physiological Reports. 2 (8), e12134-e12134 (2014).
  18. Warrington, J. P., Drummond, H. A., Granger, J. P., Ryan, M. J. Placental Ischemia-induced increases in brain water content and cerebrovascular permeability: Role of TNFα. Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol. 309 (11), R1425-R1431 (2015).
  19. Johnson, A. C., et al. Magnesium sulfate treatment reverses seizure susceptibility and decreases neuroinflammation in a rat model of severe preeclampsia. PLoS ONE. 9 (11), e113670(2014).
  20. Escudero, C. A., et al. Role of extracellular vesicles and microRNAs on dysfunctional angiogenesis during preeclamptic pregnancies. Front Physiol. 7, 1-17 (2016).
  21. Salomon, C., et al. Placental exosomes as early biomarker of preeclampsia: Potential role of exosomalmicrornas across gestation. J Clin Endocrinol Metab. 102 (9), 3182-3194 (2017).
  22. Knight, M., Redman, C. W., Linton, E. A., Sargent, I. L. Shedding of syncytiotrophoblast microvilli into the maternal circulation in pre-eclamptic pregnancies. Br J Obstet Gynaecol. 105 (6), 632-640 (1998).
  23. Gilani, S. I., Weissgerber, T. L., Garovic, V. D., Jayachandran, M. Preeclampsia and extracellular vesicles. Curr Hypertens Rep. 18 (9), 68(2016).
  24. Dutta, S., et al. Hypoxia-induced small extracellular vesicle proteins regulate proinflammatory cytokines and systemic blood pressure in pregnant rats. Clin Sci (Lond). 134 (6), 593-607 (2020).
  25. Leon, J., et al. Disruption of the blood-brain barrier by extracellular vesicles from preeclampsia plasma and hypoxic placentae: attenuation by magnesium sulfate. Hypertension. 78 (5), 1423-1433 (2021).
  26. Han, C., et al. Placenta-derived extracellular vesicles induce preeclampsia in mouse models. Haematologica. 105 (6), 1686-1694 (2020).
  27. Amburgey, O. A., Chapman, A. C., May, V., Bernstein, I. M., Cipolla, M. J. Plasma from preeclamptic women increases blood-brain barrier permeability: role of vascular endothelial growth factor signaling. Hypertension. 56 (5), 1003-1008 (2010).
  28. Cipolla, M. J., et al. Pregnant serum induces neuroinflammation and seizure activity via TNFalpha. Exp Neurol. 234 (2), 398-404 (2012).
  29. Bergman, L., et al. Preeclampsia and increased permeability over the blood brain barrier - a role of vascular endothelial growth receptor 2. Am J Hypertens. 34 (1), 73-81 (2021).
  30. Torres-Vergara, P., et al. Dysregulation of vascular endothelial growth factor receptor 2 phosphorylation is associated with disruption of the blood-brain barrier and brain endothelial cell apoptosis induced by plasma from women with preeclampsia. Biochim Biophys Acta Mol Basis Dis. 1868 (9), 166451(2022).
  31. Schreurs, M. P., Houston, E. M., May, V., Cipolla, M. J. The adaptation of the blood-brain barrier to vascular endothelial growth factor and placental growth factor during pregnancy. FASEB J. 26 (1), 355-362 (2012).
  32. Schreurs, M. P., Cipolla, M. J. Cerebrovascular dysfunction and blood-brain barrier permeability induced by oxidized LDL are prevented by apocynin and magnesium sulfate in female rats. J Cardiovasc Pharmacol. 63 (1), 33-39 (2014).
  33. Schreurs, M. P. H., et al. Increased oxidized low-density lipoprotein causes blood-brain barrier disruption in early-onset preeclampsia through LOX-1. FASEB J. 27 (3), 1254-1263 (2013).
  34. Escudero, C., et al. Brain vascular dysfunction in mothers and their children exposed to preeclampsia. Hypertension. 80 (2), 242-256 (2023).
  35. Russell, W. M. S., Burch, R. L. The principles of humane experimental technique. Universities Federation of Animal Welfare. , https://awionline.org/lab-animal-search/russell-w-m-s-burch-r-l-1959-principles-humane-experimental-technique-methuen-co (1959).
  36. Miller, R. K., et al. Human placental explants in culture: approaches and assessments. Placenta. 26 (6), 439-448 (2005).
  37. Troncoso, F. A. J., Herlitz, K., Ruiz, F., Bertoglia, P., Escudero, C. Elevated pro-angiogenic phenotype in feto-placental tissue from gestational diabetes mellitus. Placenta. 36 (4), 2(2015).
  38. Zhang, H. C., et al. Microvesicles derived from human umbilical cord mesenchymal stem cells stimulated by hypoxia promote angiogenesis both in vitro and in vivo. Stem Cells Dev. 21 (18), 3289-3297 (2012).
  39. Thery, C., Amigorena, S., Raposo, G., Clayton, A. Isolation and characterization of exosomes from cell culture supernatants and biological fluids. Curr Protoc Cell Biol. Chapter 3 (Unit 3), 22(2006).
  40. Carroll, R. W., et al. A rapid murine coma and behavior scale for quantitative assessment of murine cerebral malaria. PLoS One. 5 (10), e13124(2010).
  41. Wu, J., et al. Transcardiac perfusion of the mouse for brain tissue dissection and fixation. Bio Protoc. 11 (5), e3988(2021).
  42. Walchli, T., et al. Quantitative assessment of angiogenesis, perfused blood vessels and endothelial tip cells in the postnatal mouse brain. Nat Protoc. 10 (1), 53-74 (2015).
  43. Wang, H. L., Lai, T. W. Optimization of Evans blue quantitation in limited rat tissue samples. Sci Rep. 4, 6588(2014).
  44. Morita, K., Sasaki, H., Furuse, M., Tsukita, S. Endothelial claudin: claudin-5/TMVCF constitutes tight junction strands in endothelial cells. J Cell Biol. 147 (1), 185-194 (1999).
  45. Lara, E., et al. Abnormal cerebral microvascular perfusion and reactivity in female offspring of reduced uterine perfusion pressure (RUPP) mice model. J Cereb Blood Flow Metab. 42 (12), 2318-2332 (2022).
  46. Chang, X., et al. Exosomes from women with preeclampsia induced vascular dysfunction by delivering sflt (soluble fms-like tyrosine kinase)-1 and seng (soluble endoglin) to endothelial cells. Hypertension. 72, 1381-1390 (2018).
  47. Smarason, A. K., Sargent, I. L., Starkey, P. M., Redman, C. W. The effect of placental syncytiotrophoblast microvillous membranes from normal and pre-eclamptic women on the growth of endothelial cells in vitro. BJOG. 100 (10), 943-949 (1993).

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Reimpressões e permissões

Explorar mais artigos

Hipóxia PlacentáriaModelo de Camundongo para Pré-eclâmpsiaDisfunção Endotelial CerebralExtravasamento de Azul de EvansCultura de Explante PlacentárioCentrifugação SequencialInjeção na Veia JugularAvaliação do Escore Neurológico
Ruptura da Barreira Hematoencefálica de Camundongos por Pequenas Vesículas Extracelulares de Placentas Humanas Hipóxicas
Fale conosco
Recomendar à biblioteca

Privacidade

Termos de Uso

Políticas

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Todos os direitos reservados.