Isolamento de Astrócitos Puros e Microglia da Medula Espinhal de Camundongos Adultos para Ensaios In Vitro e Estudos Transcriptômicos

Summary

Este protocolo descreve o isolamento de astrócitos purificados e microglia da medula espinhal de camundongos adultos, facilitando aplicações subsequentes, como análise de RNA e cultura celular. Inclui métodos e procedimentos detalhados de dissociação celular projetados para melhorar a qualidade e o rendimento das células isoladas.

Abstract

Astrócitos e micróglia desempenham papéis fundamentais no desenvolvimento do sistema nervoso central, respostas a lesões e doenças neurodegenerativas. Essas células altamente dinâmicas exibem respostas rápidas às mudanças ambientais e exibem significativa heterogeneidade em termos de morfologia, perfis transcricionais e funções. Embora nossa compreensão das funções das células gliais na saúde e na doença tenha avançado substancialmente, permanece a necessidade de análises in vitro, células-específicas conduzidas no contexto de insultos ou lesões para caracterizar de forma abrangente populações celulares distintas. O isolamento de células do camundongo adulto oferece várias vantagens sobre linhagens celulares ou animais neonatais, pois permite a análise de células em condições patológicas e em momentos específicos. Além disso, o foco no isolamento específico da medula espinhal, excluindo o envolvimento cerebral, permite a pesquisa de patologias da medula espinhal, incluindo encefalomielite autoimune experimental, lesão medular e esclerose lateral amiotrófica. Este protocolo apresenta um método eficiente para isolar astrócitos e micróglias da medula espinhal de camundongos adultos, facilitando análises imediatas ou futuras com potenciais aplicações em estudos funcionais, moleculares ou proteômicos a jusante.

Introduction

Os astrócitos e a microglia são células gliais versáteis que desempenham papéis vitais no sistema nervoso central (SNC), englobando responsabilidades como regular a função neuronal, contribuir para o desenvolvimento do SNC, manter a barreira hematoencefálica e participar de outros processos críticos 1,2,3,4 . Além de seu papel na manutenção da homeostase, essas células gliais também desempenham um papel fundamental nos mecanismos de lesão e reparo. As microglias são bem conhecidas por suas capacidades fagocíticas, inflamatórias e migratórias após insultos ou lesões ^5,6,7. As respostas astrocitárias na doença são igualmente diversas, englobando contribuições para a inflamação, a formação de cicatrizes gliais e o comprometimento da barreira hematoencefálica ^8,9. Embora nossa compreensão dos papéis prejudiciais e reparadores da micróglia e dos astrócitos no SNC tenha crescido, a heterogeneidade inerente em sua estrutura e função requer ferramentas robustas para estudá-los em vários contextos.

Obter mais informações sobre os papéis da micróglia e dos astrócitos na saúde e na doença requer uma abordagem combinada de investigações in vivo e in vitro . Técnicas in vivo alavancam o intrincado crosstalk entre células gliais e neurônios dentro do SNC, enquanto metodologias in vitro mostram-se valiosas ao avaliar funções ou respostas unicelulares sob estímulos específicos. Cada método oferece vantagens únicas; Estudos in vitro são essenciais para a compreensão dos papéis específicos desses tipos celulares sem a entrada direta ou indireta de células vizinhas. Além disso, ensaios in vitro utilizando linhagens celulares imortais apresentam certos benefícios, incluindo a capacidade de proliferação indefinida, custo-benefício e facilidade de manutenção. No entanto, é importante notar que as células primárias imitam mais de perto as respostas fisiológicas normais em comparação com as linhagens celulares. Essa relevância fisiológica é crucial em ensaios funcionais e análises transcriptômicas.

Um dos desafios na obtenção de células primárias, particularmente da medula espinhal de camundongos adultos, está na quantidade e viabilidade das amostras. A medula espinhal adulta, sendo menor que o cérebro e contendo uma quantidade significativa de mielina, apresenta dificuldades únicas. Embora existam vários protocolos publicados detalhando o isolamento de células gliais puras e viáveis de animais neonatais ou do cérebro de camundongos adultos 10,11,12,13, essas metodologias podem não ser adequadas para o estudo de doenças e lesões específicas da medula espinhal. Neste protocolo, oferecemos um procedimento abrangente para isolar eficientemente a micróglia e os astrócitos puros e viáveis da medula espinhal de camundongos adultos, facilitando aplicações a jusante em cultura de células e análises transcriptômicas. Este protocolo tem sido empregado com sucesso para isolar essas células de camundongos adultos com idade entre 10 semanas e 5 meses, demonstrando sua utilidade em vários contextos, incluindo estudos envolvendo camundongos knockout condicionais, respostas a drogas, pesquisa de desenvolvimento e modelos relacionados à idade.

Protocol

Todos os cuidados com os animais e procedimentos experimentais foram conduzidos após a aprovação do Comitê de Cuidados e Uso de Animais da Escola de Medicina e Ciências da Saúde da Universidade George Washington (Washington, D.C., EUA; IACUC#2021-004). O estudo utilizou camundongos selvagens machos e fêmeas C57BL/6J com idade entre 10 semanas e 5 meses, que foram obtidos de um fornecedor comercial (ver Tabela de Materiais) e alojados na Universidade George Washington. Uma visão geral do fluxo de trabalho do protocolo é apresentada na Figura 1.

1. Preparação da medula espinhal

1. Anestesiar os animais com Avertin (12,5 mg/mL de 2,2,2-Tribromoetanol e 2,5% de 2-metil-2-butanol em água estéril) (ver Tabela de Materiais). Confirme a ausência de resposta aos beliscões dos dedos dos pés e da cauda nos ratos.
2. Realizar perfusão cardíaca com solução salina tamponada com fosfato (DPBS) 1x Dulbecco a frio para remover as células mononucleares do sangue periférico.
   1. Coloque o animal em uma bandeja rasa e faça uma incisão lateral para expor a cavidade pleural. Insira uma agulha de perfusão 23 G conectada a uma bomba peristáltica (ver Tabela de Materiais) no ventrículo esquerdo e ative a bomba. Uma vez que a DPBS fria flui através do coração, crie uma pequena incisão no átrio direito.
      NOTA: Uma taxa de perfusão mais rápida é preferida nesta etapa para aumentar a viabilidade celular. O sangue deve ser liberado em menos de 1 minuto. A limpeza do fígado indica perfusão bem-sucedida.
3. Decapitar o animal com uma tesoura grande e retirar a coluna vertebral¹⁴. Submergir em 1x DPBS frios com Ca²⁺/Mg²⁺/0,2% de glicose em uma placa de Petri sobre gelo para enxágue tecidual.
4. A partir de agora, certifique-se de que todas as etapas sejam realizadas em um ambiente estéril. Use extrusão hidráulica¹⁴ para isolar toda a medula espinhal. Empregar uma agulha de 18 G e uma seringa de 10 mL preenchida com 1x DPBS frios com Ca²⁺/Mg²⁺/0,2% de glicose. Transfira a medula espinhal para uma placa de Petri colocada em blocos de gelo contendo 1x DPBS frios suficientes com Ca²⁺/Mg²⁺/0,2% de glicose para submergir todo o tecido.
5. Remova cuidadosamente as meninges sob um microscópio dentro de uma capela de fluxo laminar. Transfira a medula espinhal para uma placa de Petri vazia em bolsas de gelo e, usando um bisturi cirúrgico com lâmina nº 10, corte toda a medula espinhal em seções de 2-3 mm.

2. Dissociação enzimática celular

1. Adicione a mistura de enzimas 1 e a mistura de enzimas 2 do Kit de dissociação cerebral para adultos disponível comercialmente, seguindo o protocolo do fabricante (consulte a Tabela de Materiais). Agite as enzimas no prato várias vezes para garantir um revestimento uniforme da medula espinhal e, em seguida, incube a 37 °C durante 30 minutos. A cada 5 minutos, gire suavemente o prato para evitar aglomeração de tecidos e facilitar a distribuição uniforme de reagentes.
2. Retire a placa da incubadora e adicione 350 μL de 0,46 mg/mL de DNAse I em Meio Essencial Mínimo (MEM) (ver Tabela de Materiais). Misture girando suavemente.
3. Adicione 1 mL de DMEM frio/0,5% de Soro Fetal Bovino (SFB) e misture girando suavemente. Transfira imediatamente todo o conteúdo para um tubo de 5 mL.

3. Dissociação mecânica celular

1. Usando uma pipeta P1000, triture suavemente o tecido três vezes, garantindo que pedaços de tecido sejam retirados cada vez para dissociar ainda mais o tecido. Em seguida, usando uma pipeta de vidro Pasteur plugada de 9", triture suavemente mais cinco vezes, garantindo que nenhuma bolha seja gerada durante o processo.
2. Coloque o tubo de 5 mL na vertical e deixe o tecido se acomodar no fundo por 30 s. Uma vez que o tecido tenha se acomodado, extrair o sobrenadante usando uma pipeta P1000 e passá-lo através de um filtro de 30 μm para um tubo cônico de 15 mL.
3. Ao mesmo tubo de 5 mL com o tecido restante, adicionar 1 mL de DMEM frio/SFB a 0,5%. Usando uma pipeta Pasteur, triture suavemente três vezes.
4. Deixe o tecido assentar no fundo por 30 s, depois passe o sobrenadante através de um filtro de 30 μm e colete-o no mesmo tubo de 15 mL de antes. Repita as etapas 3.3 e 3.4 mais uma vez.
5. Centrifugar a suspensão da célula filtrada a 300 x g durante 10 minutos à temperatura ambiente (TR). Remova e descarte cuidadosamente o sobrenadante resultante usando um aspirador a vácuo.

4. Remoção da mielina

1. Remova a mielina usando a solução de remoção de detritos (DRS) fornecida no Kit de Dissociação Cerebral para Adultos seguindo o protocolo do fabricante. Após a remoção dos detritos, adicionar 5 mL de DMEM frio/FBS a 0,5% ao pellet de células e inverter suavemente o tubo três vezes. Centrifugar a suspensão celular a 300 x g durante 10 minutos à temperatura ambiente (TR).
   NOTA: Se as células serão usadas para estudos in vitro e permanecerão em cultura, deve-se usar DMEM/FBS pré-aquecido a 0,5%.
2. Eliminar o sobrenadante e ressuspender o pellet celular em 1 mL de DPBS/FBS a 0,5% (frio para estudos de RNA e quente para ensaios in vitro ). Conte as células e avalie a viabilidade usando Trypan Blue.
   NOTA: Suspensões celulares de vários animais podem ser combinadas para aumentar a concentração celular.
3. Lave as células adicionando DPBS/FBS a 0,5% até um volume total de 5 mL. Centrifugar a suspensão a 300 x g durante 10 min à temperatura ambiente e eliminar o sobrenadante com uma pipeta.

5. Isolamento de micróglias e astrócitos

1. Rotule as células com microesferas anti-CD11b ou anti-ACSA-2 seguindo o protocolo do fabricante (consulte a Tabela de Materiais).
2. Classifique as células por seleção positiva usando as colunas MS de acordo com as instruções do fabricante (consulte Tabela de Materiais). Após a triagem, centrifugar as células classificadas a 300 x g por 10 min e descartar o sobrenadante.

6. Plating de células para ensaios in vitro

NOTA: Se as células não forem plaqueadas e forem usadas imediatamente para análise de RNA, prossiga para a etapa 8.

1. Ressuspender as células em 1 mL de DMEM quente/SFB a 0,5%. Conte as células e avalie sua viabilidade usando um hemacitômetro (ver Tabela de Materiais).
2. Ajustar a concentração celular para 75.000 células por 50 μL. Adicionar 50 μL da suspensão celular a cada lamínula revestida de poli-L-lisina¹¹ em uma placa de 24 poços.
3. Incubar a 37 °C durante 2 h para permitir que as células adiram à lamínula.
4. Adicione cuidadosamente 450 μL de DMEM quente/5% FBS/Penicilina-Estreptomicina (Pen-Strep, ver Tabela de Materiais) a cada poço.
5. Após 3 dias, substituir metade do meio por 250 μL de DMEM quente/5% FBS/Pen-Strep. Para manutenção, substitua completamente o meio por 500 μL de DMEM quente/5% FBS/Pen-Strep a cada 4-5 dias.

7. Imuno-histoquímica

NOTA: É melhor realizar análises imunohistoquímicas após pelo menos 3 dias quando o meio tiver sido substituído pelo menos uma vez. Isso garante que os detritos tenham sido removidos e que as células tenham aderido completamente à lamínula.

1. Remover o meio e rotular as células com mAb O4 anti-rato (1:100) (ver Tabela de Materiais) em DMEM quente/5% FBS/10% soro normal de cabra (NGS) durante 15 minutos à temperatura ambiente (RT) ou a 37 °C.
   Observação : ignore esta etapa e prossiga para a etapa 7.3 se as células não serão rotuladas com O4.
2. Enxágue suavemente as lamínulas mergulhando-as em DMEM/5% FBS morno três vezes. Adicionar cabra anti-rato 594 IgM (1: 300) (ver Tabela de Materiais) em DMEM quente/5% FBS/10% NGS e incubar em RT por 15 min no escuro. Enxaguar suavemente três vezes em DMEM/5% FBS quente.
3. Fixar as células com ácido acético a 5% a frio/metanol durante 15 minutos a 4 °C. Lave três vezes com 1x PBS e, em seguida, rotule com o anticorpo apropriado: GFAP anticoelho (1: 500), GFAP anti-rato (1: 500) ou Iba1 anticoelho (1: 500) em 1% Triton-X100/10% NGS em 1x DPBS (ver Tabela de Materiais). Incubar por 1 h no TR.
   OBS: Mantenha as lamínulas no escuro caso já tenham sido manchadas com O4.
4. Enxágue suavemente três vezes com PBS. Rótulo com o anticorpo secundário apropriado: anti-camundongo 594 IgG (1: 500), anti-coelho 488 IgG (1: 500) (ver Tabela de Materiais). Incubar por 30 min no TR no escuro.
5. Enxágue suavemente três vezes com PBS. Contramanchar com DAPI (1: 1000) por 1 min em RT. Enxágue três vezes com PBS, adicione o meio de montagem (consulte a Tabela de Materiais) e monte as lamínulas nas lâminas.

8. Extração de RNA

NOTA: Idealmente, deve haver pelo menos 100.000 células para extrair RNA suficiente para análise. Se necessário, células de 2-3 medulas, podem ser combinadas.

1. Extraia o RNA usando um kit de isolamento de RNA disponível comercialmente seguindo o protocolo do fabricante (consulte a Tabela de Materiais). Para cada etapa de lavagem com o tampão de lavagem RW1 fornecido no kit, deixe as células no tampão de lavagem por mais 2 min.
2. Remova qualquer DNA genômico remanescente usando DNase I de acordo com as instruções do fabricante (consulte a Tabela de Materiais). Incubar com DNase em TR durante 15 minutos e, em seguida, lavar com tampão RW1.
3. Para aumentar o rendimento de RNA, antes da eluição incubar as amostras em água livre de RNAse em TR por 10 min. Avalie a integridade e a quantidade de RNA usando um bioanalisador¹⁵ (ver Tabela de Materiais).

Results

Os métodos descritos neste protocolo permitem o isolamento de micróglia pura e viável e astrócitos da medula espinhal de camundongos adultos, facilitando várias aplicações a jusante, incluindo ensaios funcionais ou histológicos in vitro e análise de RNA.

Um isolamento bem sucedido para estudos in vitro resultará em proliferação celular contínua ao longo de vários dias. Células adultas exibem uma taxa de proliferação mais lenta em comparação com células isoladas de animais neo...

Discussion

O isolamento de células primárias puras e viáveis é fundamental para investigar a estrutura e função de tipos celulares específicos. Em camundongos adultos, particularmente na medula espinhal, essa tarefa apresenta desafios significativos, pois os protocolos existentes muitas vezes não são adaptados à medula espinhal^adulta10,17. Este protocolo apresenta um método eficiente e custo-efetivo aplicável a várias aplicações a jusante, incluindo cultura celular, citomet...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
2,2,2-Tribromoethanol	Sigma Aldrich	T48402
Avantor	10861-558		cultura de tecidos 24
2-Methyl-2-butanol, 98%	Thermo Fisher	A18304-0F
4 ', 6-Diamidino-2-Phenylindole, solução boa Corning	Invitrogen	D1306	1:1000
45% de Dihydrochloride
Tubos tampados de 5 mL	Eppendorf	30122305
Ácido acético	Sigma-Adlrich	A6283
Kit de dissociação cerebral adulto	Miltenyi	103-107-677
Kit de microesferas anti-ACSA2	Miltenyi	130-097-679
Anti-IBA1	Wako	019-1974
Bioanalyzer	Agilent Tecnologias	G2939BA
camundongos C57BL/6J do tipo selvagem (WT)	Jackson Laboratories
CD11b (Microglia) MicroBeads	Miltenyi	130-093-634
Celltrics 30 µ m filtro	Sysmex Partec	04-004-2326
Câmara de Contagem (Hemacitômetro)	Hausser Scientific Co	3200
Desoxirribonuclease I do pâncreas bovino	Sigma Aldrich	D4527-40KU
Água destilada	TMO	15230001
DMEM / F12	Thermo Fisher	11320074
DNase para purificação de RNA	Qiagen	79254
Solução salina tamponada com fosfato de Dulbecco	Thermo Fisher	14040117
Soro bovino fetal	Thermo Fisher	A5209401
GFAP anticorpo (camundongo)	Santa Cruz	sc-33673	1:500
GFAP anticorpo (coelho)	Dako	Z0334	1:500
cabra anti-rato 594 IgG	Invitrogen	a11032	1:500
Cabra anti-rato 594 IgM	Invitrogen	a21044	1:300
Cabra anti-coelho 488 IgG	Invitrogen	a11008	1:500
Iba1 anticorpo (coelho)	Wako	019-1974	1:500
MACS Separador	Miltenyi	130-042-303
Masterflex C/L Sistema de Bomba	Thermo Fisher	77122-22
MEM	Corning	15-015-CV
Metanol	Sigma-Adlrich	439193
Montagem Meio Vector	Laboratórios	H-1000-10
MS Colunas	Miltenyi	130-042-401
O4 Anticorpo	R& D	MAB1326
Penicilina-Estreptomicina	Gibco	15070063
Pipeta pasteur de vidro plugada de 9"	VWR	14672-412
RNeasy Plus Micro Kit	Qiagen	74034
Lâmina de bisturi cirúrgico Royal-tek nº 10	Fisher scientific	22-079-683
Conjunto de infusão de veias pequenas, 23 G x 19 mm	Kawasumi	D3K2-23G