Method Article

Análises estruturais de uma variável de fragmento de cadeia única específica do receptor do fator de crescimento epidérmico por meio de uma abordagem in silico

DOI:

10.3791/65894

⸱

November 10th, 2023

 , 
1College of Arts and Sciences, Qatar University, 2Amity University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Este protocolo de previsão de modelagem de homologia de anticorpos é seguido por acoplamento de Pyrx do receptor de anticorpos e simulação dinâmica molecular. Esses três métodos primários são usados para visualizar as áreas precisas de ligação anticorpo-receptor e a estabilidade de ligação da estrutura final.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Os anticorpos variáveis de fragmento de cadeia única (scFv) foram previamente construídos a partir de cadeias leves e pesadas variáveis unidas por um ligante (Gly4-Ser) 3. O ligante foi criado usando software de modelagem molecular como uma estrutura de loop. Aqui, apresentamos um protocolo para análisein silico de um anticorpo scFv completo que interage com o receptor do fator de crescimento epidérmico (EGFR). A modelagem por homologia, com Pyrx de docking proteína-proteína e simulação dinâmica molecular do anticorpo scFv em interação e EGFR Primeiro, os autores usaram um programa de modelagem de estrutura de proteína e Python para modelagem de homologia, e a estrutura scFv do anticorpo foi modelada para homologia. Os pesquisadores baixaram o software Pyrx como uma plataforma no estudo de acoplamento. A simulação dinâmica molecular foi executada usando software de modelagem. Os resultados mostram que quando a simulação de MD foi submetida à minimização de energia, o modelo de proteína apresentou a menor energia de ligação (-5,4 kcal/M). Além disso, a simulação de MD neste estudo mostrou que o anticorpo EGFR-scFv acoplado foi estável por 20-75 ns quando o movimento da estrutura aumentou acentuadamente para 7,2 Å. Em conclusão, a análise in silicofoi realizada, e as simulações de docking molecular e dinâmica molecular do anticorpo scFv comprovaram a eficácia do medicamento imunoterapêutico projetado scFv como uma terapia medicamentosa específica para EGFR.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mudanças conformacionais na proteína (ligante e receptor) sempre ocorrem com base em funções baseadas em estrutura. O estudo dos possíveis sulcos de ligação da proteína e a previsão da interação de ligação estável é um método avançado para preparar medicamentos para melhor uso no corpo humano. A modelagem por homologia seguida de docking e simulação dinâmica molecular é um método direto para a previsão precisa de interações estáveis de ligação entre os resíduos de receptores e anticorpos construídos que são usados como medicina personalizada específica 1,2. A estrutura do modelo prevista pode mostrar mudanças conformacionais e rearranjos nos locais de ligação ligante-receptor, particularmente na interface anticorpo-receptor. Há muitas razões para essas mudanças, como a rotação das cadeias laterais, transformação estrutural global ou modificações mais complexas. A principal razão para a modelagem por homologia é distinguir a estrutura terciária de uma proteína de sua estrutura primária 2,3.

Um receptor de tirosina quinase chamado receptor do fator de crescimento epidérmico (EGFR) desempenha muitos papéis biológicos nas células cancerígenas, incluindo apoptose 4,5, diferenciação 6,7, progressão do ciclo celular 8,9, desenvolvimento 9,10 e transcrição11. O EGFR é um dos alvos terapêuticos bem conhecidos para o câncer de mama12. A superexpressão da atividade regular da quinase, como o EGFR, geralmente leva à progressão das células cancerígenas, que podem ser reprimidas por muitos tipos de inibidores do câncer13. O receptor do fator de crescimento epidérmico (EGFR) foi usado como receptor para a variável de fragmento de cadeia única construída especificamente para trabalhar contra esse receptor. Sua estrutura prevista foi usada para testar a atividade de ligação do anticorpo.

Neste artigo, a estrutura do anticorpo scFv foi modelada usando software de modelagem com script Python e o método de modelagem por homologia14,15. Um modelo de homologia pode ser construído a partir das sequências de proteínas e aminoácidos de receptores e ligantes 16,17. Além disso, tecnologias avançadas de bioinformática, como docking molecular, foram empregadas para prever como ligantes de moléculas pequenas se ligarão ao local de ligação do alvo correto. O acoplamento equilibraria o desenvolvimento de novos medicamentos direcionados a várias doenças. O comportamento de ligação é levado em consideração 5,18.

Além disso, o docking molecular é uma técnica crítica para facilitar e acelerar o desenvolvimento da ligação ligante-receptor. O acoplamento molecular permite que os cientistas examinem virtualmente uma biblioteca de ligantes em relação a uma proteína-alvo e prevejam as conformações e afinidades de ligação dos ligantes à proteína receptora-alvo. A simulação dinâmica molecular (MNS) demonstra como os resíduos se movem no espaço, simula os movimentos dos anticorpos em direção aos seus receptores e, finalmente, informa os esforços de design de anticorpos. Este estudo é uma nova previsão das dimensões da caixa de grade que decidiu como o anticorpo scFv se liga ao EGFR e a detecção da energia e do tempo dessa ligação na simulação de MD.

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Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Predições de estrutura secundária de uma proteína variável de fragmento de cadeia única (scFv)

  1. Construa a estrutura 3D da proteína variável de fragmento de cadeia única (scFv) com o banco de dados de proteínas BLAST (PDB), a numeração KABAT e o software de modelagem. O scFv consiste em um ligante (Gly4-Ser) que conecta uma cadeia pesada variável (VH) e uma cadeia leve variável (VL).
  2. Use o software de modelagem molecular para construir o ligante como uma estrutura de loop e execute todos esses métodos conforme descrito em estudos anteriores 2,19,20.

2. Seleção de modelos e previsão de estrutura 3D scFv e EGFR e modelagem por homologia

  1. Escolha o modelo 1ivo para estruturas EGFR (com base em sua alta resolução). Faça download do arquivo 1ivo.pdb do site do pdb, conforme mostrado na Figura 1B.
  2. Prepare o arquivo 1ivo.pdb de entrada conforme descrito abaixo.
    1. No arquivo 1ivo.pdb, remova todos os ligantes externos abrindo o site do pdb.org e selecionando o 1ivo. Estrutura, e procurando o nome dos ligantes sob o título de molécula pequena na página de estrutura 1ivo do site do pdb.
    2. Encontre o nome do ligante NAG. Abra o arquivo 1ivo.pdb baixado do site do pdb e encontre o resíduo de terminação (TER.).
    3. Exclua os resíduos dos ligantes externos na estrutura 1ivo, começando pelo resíduo após TER. e antes que o resíduo termine. Salve o arquivo 1ivo.pdb no sistema.
  3. Prepare o arquivo 1ivo.pdb salvo conforme descrito abaixo.
    1. Baixe o software de encaixe Autodock (autodock.scripps.edu) na área de seleção da janela. Clique no arquivo Open 1ivo.pdb.
    2. Use o comando Editar para escolher Adicionar Hidrogênio > Adicionar, selecione Somente Polar e pressione Ok.
    3. Use o comando Editar para adicionar cargas Kollman (Figura Suplementar 1). Use o comando Editar para excluir a água. Salve o arquivo 1ivo.pdb no pc.
  4. Minimize a energia da estrutura 1ivo.pdb conforme descrito abaixo.
    1. Baixe o SPDBV. software da http://spdbv.vital-it.ch/disclaim.html. Abra o arquivo 1ivo.pdb.
    2. Selecione tudo. Selecione o comando Perf > Minimização de energia > Ok (Figura suplementar 2). Salve o arquivo 1ivo no pc.
  5. Prepare o modelo completo scFv usando modelagem de homologia, conforme descrito abaixo.
    1. Baixe o software de modelagem17 e o shell do script Python 3.7.9 na janela-64. Mantenha o software baixado files na unidade D.
  6. Prepare os arquivos de entrada conforme descrito abaixo.
    1. Carregue o arquivo scFv Pdb no formato fasta do site do NCBI e renomeie o arquivo TARGET.ali. conforme descrito no Arquivo de Codificação Suplementar 1. Escolha o modelo usando a seção Blast no NCBI, cole o arquivo sequenciado, selecione no formato pdb 7det.pdb conforme descrito em Arquivo de codificação suplementar 2 e, em seguida, envie. Em seguida, use o site pdb.org para obter o arquivo de modelo.
    2. Prepare o terceiro arquivo de entrada como align2d.py (Python) conforme descrito em Codificação Suplementar File 3, que é aberto conforme mostrado na Figura Suplementar 3A. Pressione a opção Mostrar mais e vá para Editar com IDLE > Editar com EDLE (64 bits). Execute usando o comando run module 5 no align2d.py para obter dois arquivos de saída: Tar- 7det.ali e Tar- 7det.pap.
  7. Conclua as três etapas anteriores para usar o comando no último arquivo de entrada.
  8. Adicione um novo arquivo de entrada model-single.py (arquivo python de comando) conforme mostrado no Arquivo de Codificação Suplementar 4 e conforme descrito abaixo.
    1. Pressione a opção Mostrar mais e vá para Editar com IDLE > Editar com EDLE3.7 (64 bits). Execute usando o comando (run module 5), conforme mostrado na Figura 3B suplementar.
      NOTA: Os arquivos de saída resultantes são os seis arquivos dos modelos de homologia mostrados na Figura Suplementar 3C.

3. Predição e avaliação da estrutura secundária do receptor

  1. Detecte a correção e a precisão dos modelos de homologia, conforme descrito abaixo.
    1. Crie o gráfico Ramachandran para os modelos scFv e EGFR baixando a ferramenta de visualização do https://discover.3ds.com/discovery-studio-visualizer-download.
    2. Abra o arquivo, clique com o botão direito do mouse e selecione a sequência de exibição (Figura Suplementar 4). Copie a sequência e cole-a no banco de dados pictórico de estruturas 3D (pdbsum) www.ebi.ac.uk/thornton-srv/databases/pdbsum/.
    3. Selecione pesquisar por sequência, cole a cópia da sequência e envie-a. Crie o gráfico conforme mostrado na Figura 1B,D.

4. Acoplamento proteína-proteína

  1. Baixe o software da ferramenta de triagem virtual.
  2. Vá para Arquivo> leia Moléculas > carregue 1ivo.pdb. Clique com o botão direito do mouse na proteína no painel de autodock para criar uma macromolécula. Clique com o botão direito do mouse novamente para criar um ligante (Figura Suplementar 5).
  3. Clique no painel de encaixe automático para selecionar proteína e, em seguida, selecione ligante.
  4. Abra a lista de proteínas. Em seguida, na lista, selecione scFv Protein.
  5. Vá para Alternar esferas de seleção. Ajuste a caixa de grade para o centro do receptor. Clique em Avançar quando o botão rosa redondo aparecer.
  6. Para preparar os arquivos pdbqt para estruturas scFv-antibody e EGFR (1ivo), use as etapas a seguir.
    1. Vá para C Drive > Program Files (86) > Usuários e, em seguida, escolha o arquivo pyrx que contém macromoléculas e arquivos de saída de proteína que foram salvos como um arquivo pdbqt.
    2. Em seguida, salve o arquivo pdbqt de anticorpo de variável de fragmento de cadeia única (scFv).
  7. Baixe o software PyMOL em PyMOL | pymol.org. Use o software PyMOL para mostrar as configurações EGFR do receptor de anticorpos scFv.
    1. Vá para o arquivo e abra C:\Users\ilham\.mgltools\PyRx\Macromolecules\protein. Prepare as configurações de encaixe do anticorpo scFvinteragindo com o receptor na Figura 2A , conforme descrito abaixo.
      1. Use a opção de exibição para mostrar o arquivo do receptor (1ivo) como resíduos de sequência com um fundo branco mostrado na Figura Suplementar 6.
      2. Exiba o arquivo de configuração de encaixe com resolução mais alta para ver a cor do ligante nas cores de resíduo verde e vermelho. Exibir a superfície rígida do receptor (1ivo) em amarelo.
  8. Prepare as configurações de encaixe do anticorpo scFvinteragindo com o receptor na Figura 2B, conforme descrito abaixo.
    1. Baixe o software de encaixe na área de seleção de janelas. Use o Autodock para mostrar as configurações e conformações do EGFR do receptor de anticorpos scFv.
      1. No Autodock, escolha a opção Analyze e abra o resultado do Autodock Vina. Vá para Arquivo e abra C:\Users\ilham\.mgltools\PyRx\Macromolecules\protein.
      2. Selecione o arquivo pdb do receptor de proteína e, em seguida, selecione a área da configuração do ligante (estrutura do anticorpo scFv). Conecte a superfície rígida do receptor com a configuração da estrutura encaixada e oculte o restante do receptor. Oculte os resíduos distantes do receptor dos resíduos conectados ao ligante, conforme mostrado na Figura 2B.
    2. O complexo proteína-proteína foi então considerado pronto para realizar a simulação de MD.

5. Simulação dinâmica molecular (simulação MD) do complexo de acoplamento de anticorpos EGFR-scFv

  1. Baixe o software de simulação MD e use-o da seguinte maneira.
    1. Prepare o arquivo pdb EGFR (1ivo) usando o assistente de reparo como na Figura Suplementar 7A. Opere a seção de pré-processamento para refinar o arquivo. Envie o arquivo refinado a ser definido no integrador de sistemas.
    2. Carregue o software de simulação de dinâmica molecular do diretório de trabalho. Adicione os íons e atualize o arquivo refinado para atingir 20 Å para enviar o trabalho (Tabela 1), também mostrado na Figura Suplementar 7B.
    3. Carregue o EGFR (1ivo) pdb do arquivo importado e escolha 100 ns timesteps para executá-lo (Figura Suplementar 7C).
  2. Inicie a análise da simulação após a conclusão da simulação MD, conforme descrito abaixo.
    1. Crie uma pasta de trabalho e salve-a no arquivo cms . Carregue o arquivo cms para executar esta etapa na simulação MD.
    2. Crie um diretório de trabalho para pastas de projeto e relate os valores de energia. Use S.I.D. pdf para relatar a simulação, conforme mostrado na Figura 3A, e o diagrama de interação e a ligação H, conforme mostrado na Figura 3B.
    3. Carregue o arquivo pdf do cms navegando na pasta e use o TIP3P como modelo para minimização do volume do arquivo.
    4. Crie o arquivo de solvatação para executar esta etapa mostrada na Figura Suplementar 7D. Salve o arquivo pdf através do software e analise os dados, resultando na Figura 4, Figura 5 e Figura 6.
  3. Gere uma configuração de finalização do MDsimulation criando o arquivo de resolução. Localize os resultados na caixa de limite, conforme mostrado na Figura 7.

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Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Usando a tecnologia de exibição de fagos, o gene scFv anti-EGFR foi criado a partir da linha de hibridoma de células B de camundongo C3A820,21. Os modelos de estrutura variável de fragmento de cadeia única (scFv) das estruturas VH e VL foram construídos separadamente, de acordo com Chua et al.22. Depois disso, os modelos ficaram visíveis como fitas produzidas usando RasMol. Em seguida, usando um software de modelagem molecular, um peptídeo...

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Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

O EGFR é o principal receptor-alvo do câncer de mama. A superexpressão do EGFR aumenta os casos de câncer de mama em todo o mundo. Enquanto isso, anticorpos específicos, como variáveis de fragmento de cadeia única, são anticorpos que se movem facilmente através da circulação sanguínea e têm uma taxa de depuração rápida no corpo. Os anticorpos são uma solução sábia e uma droga imunoterápica eficaz37. Portanto, o design de medicamentos baseado em estrutura deve iden...

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Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Os autores não têm nada a divulgar.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Software AutodockCentro de Biologia Estrutural Computacional AutoDock (scripps.edu)
Software Desmond Maestro 19.4 Schrödingerwww.schrodinger.com 
Baixe o Discovery Studio 2021   Dassault Systems  https://discover.3ds.com/discovery-studio-visualizer-download.
Modelador Versão 9.24[17] Universidade da Califórniahttps://salilab.org/modeller/9.24/release.html
Banco de dados pictórico de estruturas 3D (pdbsum)EMBL-EBI  www.ebi.ac.uk/thornton-srv/databases/pdbsum/
Software PyMOL SchrodingerPyMOL | pymol.org
Pyrx software Sourceforge  Baixar PyRx - Virtual Screening Tool (sourceforge.net)
Python script 3.7.9 shell da janela (64)PythonPython Release Python 3.7.9 | Python.org
SPDBV software Expasyhttp://spdbv.vital-it.ch/disclaim.html

References

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