Eletrodeformação modulada em amplitude para avaliação da fadiga mecânica de células biológicas

Resumo

Apresentamos aqui um protocolo para testes de fadiga mecânica no caso de hemácias humanas usando uma abordagem de eletrodeformação modulada por amplitude. Esta abordagem geral pode ser usada para medir as mudanças sistemáticas nas características morfológicas e biomecânicas de células biológicas em uma suspensão por deformação cíclica.

Resumo

As hemácias (hemácias) são conhecidas por sua notável deformabilidade. Eles sofrem repetidamente considerável deformação ao passar pela microcirculação. A deformabilidade reduzida é observada em hemácias fisiologicamente envelhecidas. As técnicas existentes para medir a deformabilidade celular não podem ser facilmente usadas para medir a fadiga, a degradação gradual nas membranas celulares causada por cargas cíclicas. Apresentamos um protocolo para avaliar a degradação mecânica em hemácias a partir de tensões cíclicas de cisalhamento usando eletrodeformação baseada em modulação de amplitude shift keying (ASK) em um canal microfluídico. Resumidamente, os eletrodos interdigitalizados no canal microfluídico são excitados com uma corrente alternada de baixa tensão em radiofrequências usando um gerador de sinais. As hemácias em suspensão respondem ao campo elétrico e exibem dieletroforese positiva (DEP), que move as células para as bordas do eletrodo. As células são então esticadas devido às forças elétricas exercidas sobre as duas metades celulares, resultando em estiramento uniaxial, conhecido como eletrodeformação. O nível de tensão de cisalhamento e a deformação resultante podem ser facilmente ajustados alterando a amplitude da onda de excitação. Isso permite quantificações da deformabilidade não linear das hemácias em resposta a pequenas e grandes deformações em alto rendimento. A modificação da onda de excitação com a estratégia ASK induz eletrodeformação cíclica com taxas de carregamento e frequências programáveis. Isso fornece uma maneira conveniente para a caracterização da fadiga eritrocitária. Nossa abordagem de eletrodeformação modulada por ASK permite, pela primeira vez, uma medição direta da fadiga das hemácias a partir de cargas cíclicas. Ele pode ser usado como uma ferramenta para testes biomecânicos gerais, para análises de deformabilidade e fadiga celular em outros tipos celulares e condições doentes, e também pode ser combinado com estratégias para controlar o microambiente das células, como tensão de oxigênio e pistas biológicas e químicas.

Introdução

As hemácias (hemácias) são as células mais deformáveis do corpo humano¹. Sua deformabilidade está diretamente relacionada à sua funcionalidade de transporte de oxigênio. Descobriu-se que a deformabilidade reduzida nas hemácias se correlaciona com a patogênese de várias doenças eritrocitárias². Medidas de deformabilidade nos levaram a um melhor entendimento das doenças relacionadas às hemácias3. A vida normal das hemácias pode variar de 70 a 140 dias⁴. Portanto, é importante medir como sua deformabilidade diminui com o processo de envelhecimento, por exemplo, seu comportamento de fadiga devido a tensões cíclicas de cisalhamento³.

Medir a deformabilidade das hemácias em alto rendimento é um desafio devido às forças da escala de piconewton (~^10-12 N) que são aplicadas às células individuais. Na última década, muitas tecnologias foram desenvolvidas para medir a deformabilidade celular⁵. Medidas de deformação de hemácias em nível de célula única podem ser realizadas por aspiração por pipeta e pinça óptica, enquanto as análises em massa são feitas por ectaciometria de gradiente osmótico. As análises de ectacitometria fornecem uma abundância de dados, o que oferece uma oportunidade para diagnosticar distúrbios sanguíneos ^6,7. A deformabilidade das hemácias também pode ser analisada pela teoria viscoelástica por microscopia de força atômica com sonda coloide. Neste método, a análise computacional é aplicada para estimar o módulo de elasticidade das hemácias, considerando tanto respostas dependentes do tempo quanto do estado estacionário. A deformabilidade de hemácias individuais pode ser medida usando o método de arranjo de microcâmaras de célula única. Este método analisa cada célula através da membrana e marcadores fluorescentes citosólicos para fornecer informações sobre a deformabilidade das hemácias e a distribuição das características celulares em populações complexas de hemácias para detectar distúrbios^{hematológicos8}.

A fadiga é um fator-chave na degradação das propriedades de materiais de engenharia e biomateriais. O teste de fadiga permite uma análise quantitativa da integridade e longevidade de uma estrutura submetida a cargas cíclicas. A análise da fadiga em células biológicas tem sido dificultada pela falta de um método geral, prontamente aplicável, de alto rendimento e quantitativo para a implementação da deformação cíclica nas membranas celulares. Isso é possível com a utilização de técnicas de modulação de sinal elétrico e eletrodeformação implementadas em ambiente microfluídico. A técnica de chaveamento de deslocamento de amplitude (ASK) como uma modulação digital é aplicada através da modulação On-Off keying (OOK) neste artigo. O conceito de chaveamento refere-se à transmissão de sinais digitais pelo canal, que requer um sinal portador de onda senoidal para funcionar⁹. Os tempos ON e OFF podem ser definidos iguais. Sob chaveamento ON, as hemácias entram em um estado deformado enquanto expostas a uma força de eletrodeformação externa (F_dep)¹⁰ criada pelo campo elétrico não uniforme. Sob OFF-keying, as hemácias estão em seu estado relaxado. Observamos a fadiga das hemácias, ou seja, uma degradação progressiva em sua capacidade de alongamento com o aumento dos ciclos de carga. A perda de deformabilidade induzida por fadiga em hemácias pode fornecer informações sobre o dano acumulado na membrana durante a circulação sanguínea, permitindo-nos investigar melhor as conexões entre fadiga celular e estados de doença.

Aqui nós fornecemos procedimentos passo-a-passo sobre como o teste de fadiga de hemácias é implementado em um dispositivo microfluídico via eletrodeformação modulada por ASK e as configurações do sistema, como dispositivo microfluídico, carregamento mecânico e imaginação microscópica para a caracterização da degradação gradual na deformabilidade mecânica de hemácias.

Protocolo

Sangue total humano desidentificado foi obtido comercialmente. O trabalho envolvendo as amostras de sangue foi realizado em um laboratório de nível 2 de biossegurança, utilizando protocolos aprovados pelo Comitê Institucional de Biossegurança da Florida Atlantic University.

1. Preparação do dispositivo microfluídico

1. Tape o wafer de silício mestre SU-8 para o design do canal microfluídico no interior de uma placa de Petri de plástico de 14 cm e limpe-o com gás N₂ .
2. Pesar 60 g de base de polidimetilsiloxano (PDMS) e 6 g de agente de cura PDMS em um copo de papel. Misture as duas partes usando uma espátula de madeira até que a mistura fique com uma cor branca turva.
3. Despeje a mistura de PDMS na placa de Petri plástica que contém o wafer de silício. Coloque a placa de Petri em um exsicador a vácuo com uma torneira de 3 vias. Gire a válvula da torneira para conectar o vácuo à câmara do exsicador para remover bolhas de ar do PDMS.
4. Reintroduza o ar na câmara do exsicador ajustando a válvula da torneira para conectar a câmara do exsicador ao ambiente em ciclos de aproximadamente 5 minutos. Repita até que todas as bolhas de ar sejam removidas das características dos canais.
5. Coloque a placa de Petri dentro de um forno a 70 °C por 4 h. Decorrido o tempo, retire a placa de Petri, deixe esfriar até a temperatura ambiente e coloque-a em uma esteira de corte.
6. Usando um bisturi, corte a porção do PDMS acima do wafer de silício. Coloque o recorte PDMS entre as duas folhas de filme de embrulho de laboratório. O gap formado entre o recuo do microcanal e o filme semitransparente facilita a identificação da localização do canal microfluídico, bem como sua respectiva entrada e saída.
7. Usando uma lâmina de barbear, corte um canal individual do PDMS grande. Perfurar um orifício de entrada de 3 mm e um orifício de saída de 1,5 mm com punções de biópsia respectivos aos dois tamanhos (Figura 1A).
8. Coloque o canal perfurado, com o lado do canal voltado para cima, em uma lâmina de vidro limpa. Coloque um substrato de vidro de 20 mm x 15 mm contendo eletrodos interdigitados de óxido de índio estanho (ITO) de filme fino na mesma lâmina de vidro com eletrodos voltados para cima.
9. Coloque delicadamente a lâmina de vidro com PDMS e substrato em um limpador de plasma. Feche a válvula de gás, ligue o interruptor da bomba e aguarde 2 minutos para obter uma leitura do sensor de 600 - 800 mTorr.
10. Ligue o interruptor de alimentação e aguarde 30 s. Gire o botão de alimentação RF de baixo para alto e aguarde 1 min.
11. Em seguida, inverta a sequência girando o botão de RF para baixo, interruptor de energia para OFF, interruptor da bomba para OFF e abrindo a válvula de gás.
12. Imediatamente após abrir a câmara do limpador de plasma, levante e gire o PDMS de modo que o lado do canal fique voltado para baixo (180°). Coloque o canal na parte superior do substrato ITO. O processo de colagem já começou.
13. Usando pinças, pressione suavemente os cantos do PDMS por cerca de 3 s. Evite pressionar o próprio canal.
    OBS: O processo de colagem ocorre espontaneamente ao contato físico entre as duas superfícies tratadas.
14. Coloque o meio de escorvamento numa seringa de 1 ml com uma agulha de 23 G. Molhe cuidadosamente o canal, inserindo a agulha diretamente no poço de entrada e, em seguida, liberando o meio. Opere devagar. Não introduza bolhas de ar. Incubar por pelo menos 3 min.
15. Retire o meio nobre usando uma ponteira de pipeta de 10 μL. Lave o canal com o meio DEP 3 vezes inserindo o meio DEP no canal. Mantenha o canal sempre molhado.

2. Dispositivo de teste

NOTA: O dispositivo de teste é projetado usando software CAD 3D e inclui uma unidade de alojamento de base e uma unidade superior (Figura 1B). Em seguida, ele é fabricado usando uma fresadora CNC de 3 eixos com um limite de tolerância padrão de cerca de ± dimensão de 0,005 polegadas do dispositivo de teste é verificada usando um paquímetro eletrônico (não mostrado). A esterilidade do acessório não é necessária para os testes biomecânicos in vitro.

1. Pré-solda fios nas extremidades do copo de solda de dois conjuntos de conectores de pistão de mola.
2. Insira os conectores de pistão de mola na unidade superior e crie uma ligação permanente adicionando uma gota de cola epóxi.

3. Preparação do tampão de trabalho da eletrodeformação

1. Para preparar o meio DEP, pesar 12,75 g de sacarose e 0,45 g de dextrose em balança.
2. Dissolver ambos os pós em um único recipiente com 150 mL de água deionizada (DI) e 3,5 mL de solução salina tamponada com fosfato (PBS).
3. Usando um testador de condutividade de baixo alcance, meça a condutividade e certifique-se de que ela seja de 0,04 S/m (Figura 2).
   NOTA: Um valor de condutividade diferente pode ser usado, o que pode alterar o sinal e a magnitude da força DEP resultante¹¹. A eletrodeformação, no entanto, requer uma força DEP positiva.
4. Por meio de um osmômetro, confirme se a osmolaridade está dentro da faixa normal do plasma sanguíneo, 275 a 295 mOsm/kg de água (Figura 3). Conservar a 4 °C. O meio DEP está agora preparado.
5. Em um tubo de 15 mL, dissolver 0,5 g de albumina de soro bovino (BSA) em 10 mL do meio DEP. Homogeneizar. O principal meio do dispositivo já está preparado.

4. Preparação da suspensão celular

1. Lavar 20 μL do sangue total centrifugando o sangue com 1 ml de PBS a 268 x g durante 3 minutos. Descarte o sobrenadante.
2. Ressuspender as hemácias em 1 mL de PBS. Pipetar suavemente para misturar. Lave as hemácias por 3 min a 268 x g e descarte o sobrenadante.
3. Extrair 5 μL de pastilha de RBC usando uma ponta de micropipeta de 10 μL e dispensar totalmente em 1 mL do meio DEP. Lave as células centrifugando a 268 x g por 3 min.
4. Eliminar o sobrenadante e ressuspender as hemácias em 1 mL de meio DEP. Pipetar suavemente para misturar.
5. Lave as hemácias por 3 min a 268 x g e descarte o sobrenadante. Pipetar 2 μL de pastilha de hemácias em 500 μL de meio DEP. A suspensão celular é agora preparada com uma concentração dentro de uma faixa de 62 - 104 células/μL¹², que pode ser confirmada usando uma lâmina de contagem de células padrão.

5. Configuração da eletrodeformação e teste de fadiga

1. Coloque o dispositivo microfluídico na parte inferior do dispositivo de ensaio. Alinhe a parte superior do acessório ao dispositivo e monte as duas partes utilizando dois conjuntos de parafusos e porcas de nylon (Figura 4).
2. Coloque o dispositivo de teste no palco do microscópio. Localize um conjunto desejado de eletrodos sob o microscópio.
3. Conecte o par correspondente de fios de eletrodos que correspondem ao conjunto de eletrodos localizado ao terminal de saída do gerador de funções (Figura 4).
4. Remover 5 μL do meio DEP da entrada de 3 mm do canal microfluídico. Coloque lentamente 5 μL da suspensão celular na entrada usando uma ponteira de pipeta de 10 μL.
5. Deixe as células se acomodarem por 1 min. Se necessário, adicione um meio DEP adicional à entrada para empurrar as células para o canal.
6. Observe o canal em aumento de 20x. Use um filtro passa-banda de 414/46 nm para melhorar o contraste da imagem.
7. Pressione o botão senoidal e defina uma onda senoidal com uma amplitude de 2 V_RMS na frequência de 3 MHz. Pressione o botão Mod para ativar a modulação. Altere o modo de onda para ASK pressionando a opção Tipo .
8. Ajuste a frequência de modulação para 250 mHz, o que corresponde a um período de carga-descarga de 4 s (Figura 5A). Ligue a saída do gerador de funções.
9. Grave um vídeo de 1 min a cada 10 min a 30 quadros por s (fps).

6. Caracterização da deformação eritrocitária

1. Usando um aplicativo de edição de vídeo, abra .avi arquivos gravados na etapa anterior pressionando Ctrl+O. Use a linha do tempo para escolher um quadro de interesse e defina os quadros de início e fim da seleção como idênticos pressionando a tecla Home e, em seguida, a tecla End no teclado.
2. Exporte o quadro da imagem. Selecione o formato de saída para ser JPEG e pressione OK.
3. Abra o aplicativo ImageJ e carregue as imagens salvas na etapa anterior. Comece definindo as medidas necessárias pressionando Analisar > Definir Medidas e garantindo que as caixas de seleção de Área, Perímetro e Elipse de ajuste estejam marcadas. Pressione OK.
4. Em seguida, converta a imagem em tons de cinza escolhendo Imagem > Tipo > 8 bits.
5. Em seguida, converta a imagem em binária usando Image > Adjust > Thresholding. Na caixa de diálogo Limite, ajuste os dois controles deslizantes conforme necessário. Pressione Aplicar e feche a caixa de diálogo Limite.
6. Escolha Analisar ferramentas > > ROI Manager. No Gerenciador de ROI, pressione a caixa de seleção Mostrar tudo. Não feche esta caixa.
7. Selecione a Ferramenta Varinha (rastreamento), selecione uma célula aplicável na imagem e pressione T no teclado. A célula selecionada será numerada. Uma nova célula pode ser selecionada novamente. Selecione todas as células aplicáveis a serem medidas. As células aplicáveis são identificadas como aquelas que são isoladas de outras células. O número dessas células pode variar de 50 a 200 em um único campo de visão.
8. Retorne à caixa Gerenciador de ROI e pressione Medir. Isso abre a caixa Resultados. As colunas denominadas Maior e Menor são os comprimentos dos eixos maiores e menores da elipse ajustada (em pixels), respectivamente. Escolha Arquivo > Salvar como para exportar as medidas como um arquivo formatado em CSV.
9. Usando qualquer software de análise computacional apropriado, calcule o quociente de Maior e Menor.

Resultados

Quando a suspensão celular foi carregada no canal microfluídico, uma distribuição relativamente uniforme das células foi observada. Após a saída do sinal (por exemplo, uma onda senoidal simples ou fase On-Keying do ASK) do gerador de função, os eletrodos interdigitados de filme fino geraram um campo elétrico de corrente alternada não uniforme. As células em suspensão responderam espontaneamente a essa excitação elétrica e exibiram um comportamento DEP positivo, ou seja, movendo-se em direção às bordas dos eletrodos com m...

Discussão

A modulação ASK OOK de uma onda senoidal indutora de força DEP pode ser usada para testar a fadiga mecânica de hemácias por um longo período de tempo. Neste protocolo, limitamos o teste de fadiga in vitro a 1 hora para prevenir os potenciais efeitos metabólicos adversos sobre a deformabilidade celular. Condições abrangentes de teste de fadiga podem ser programadas usando a técnica de eletrodeformação modulada por ASK. Parâmetros como frequência de carregamento, amplitude e taxa de carregamento podem ser programados. A fr...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Balança	ViBRA	HT-224R
Filtro passa-banda	BRIGHTLINE	414/46 BrightLine HC
BD  Seringas Descartáveis com Luer-Lok™ Pontas, 1 mL	Fisher Scientific	14-823-30
Punções de Biópsia com Sistema de Êmbolo, 1.5 mm	Fisher Scientific	12-460-403
Punções de Biópsia com Sistema de Êmbolo, 3 mm	Fisher Scientific	12-460-407	1.5 mm e 3 mm de diâmetro
Agulha romba, 23-gauge	BSTEAN	X001308N97
Bovin Serum Albumina	RMBIO	BSA-BSH
Centrífuga	SCILOGEX	911015119999
Tubo Cônico, 50 mL	Fisher Scientific	05-539-13
Dextrose	Fisher Scientific	MDX01455	MilliporeSigma™
Medidor de baixa condutividade EC	ecoTestr	358/03
Eppendorf    Tubos de Microcentrífuga Snap-Cap	www.eppendorf.com	05-402-25
Excel	Microsoft		Gerador de Função de plotagem gráfica
	SIGLENT	SDG830
Substrato de Eletrodo de Vidro/ITO	OSSILA	S161
ImageJ	NIH		https://imagej.nih.gov/ij/
Microscópio Invertido	OLYMPUS	IX81 - Forno de Laboratório SN9E07015
	QUINCY LAB (QL)	modelo 30GCE	Modelo Digital
Plotagem de Gráficos	Matlab	MathWorks
- Modelo 3300	Advanced Instruments Inc.	S / N: 03050397P
Filme de embalagem de laboratório de parafilme	Fisher Scientific	13-374-12
Placa de Petri	FALCON	SKU = 351006	ICSI / Biopsydish 50 * 9 mm
Solução salina tamponada com fosfato (PBS)	LONZA	04-479Q
Limpador de plasma	Harrick plasma PDCOOL	NC0301989
Solidworks	Dassault Systemes		Software CAD
Sacarose	Fisher Scientific	50-188-2419
Dessecador a vácuo	SPBEL-ART	F42400-2121
Espátula de madeira	Fisher Scientific	NC0304136	Abaixadores de língua Madeira NS 6"